מאמר שיטה

תת-סוגים של Jejuni קמפילובקטר SSP. doylei המבודד באמצעות ספקטרומטריית מסה מבוססת PhyloProteomics (MSPP)

DOI:

10.3791/54165

⸱

30 באוקטובר 2016

 ,  ,  ,  ,  , 
1Institut für Medizinische Mikrobiologie, Universitätsmedizin Göttingen

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Phyloproteomics Mass מבוסס ספקטרומטריית (MSPP) שמש להקליד אוסף של SSP jejuni קמפילובקטר. Doylei מבודד ברמת הזן בהשוואת הקלדת רצף multilocus (MLST).

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

MALDI-TOF MS מציעה את האפשרות להבחין כמה חיידקים לא רק ברמת המין ותתי אבל אף מתחתיו ברמת המתח. isoforms אללים של יונים סמן ביולוגי לזיהוי לגרום משמרות המונית ספציפי לבודד. phyloproteomics Mass מבוסס ספקטרומטריית (MSPP) הוא שיטה חדשנית המשלבת ההמונים סמנו הביולוגיים לזיהוי ספקטרומטריה בתכנית המאפשרת ניכוי יחסי phyloproteomic ממשמרות מסה ספציפיות לבודדות לעומת הגנום רצף זן התייחסות. רצף חומצות אמינו מוסק משמש ואז לחשב dendrograms המבוסס MSPP.

כאן אנו מתארים את זרימת העבודה של MSPP ידי הקלדת SSP jejuni קמפילובקטר. Doylei אוסף מבודד של שבעה זנים. כל שבעה הזנים היו ממקור אנושי והקלדת רצף multilocus (MLST) הפגינו המגוון הגנטי שלהם. MSPP-הקלדה הביאה שבעה סוגי MSPP רצף שונים, משקף PHY שלהם מספיקיחסי logenetic.

ג jejuni SSP. doylei ערכת MSPP כוללת 14 יונים סמן ביולוגיים שונים, חלבונים ריבוזומלי בעיקר בטווח ההמוני של 2 עד 11 kDa. MSPP יכול באופן עקרוני, להיות מותאם לפלטפורמות ספקטרומטריה אחרות עם טווח המוני מורחב. לכן, טכניקה זו יש פוטנציאל להיות כלי שימושי עבור הקלדה מיקרוביאלי רמת המתח.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

במהלך העשור האחרון, יינון desorption לייזר בסיוע מטריקס הזמן של הטיסה ספקטרומטריית מסה (MALDI-TOF MS) התקדמה להיות שיטה סטנדרטית מוערך מאוד על הסוג חיידקים וזיהוי מינים במיקרוביולוגיה קלינית 1, 2. זיהוי מינים מבוסס על ההקלטה של ​​טביעות אצבעות חלבון קטנות של תאים שלמים או lysates תא. הטווח ההמוני האופייני ספקטרומטר מסה בשימוש במיקרוביולוגיה השגרה הקלינית הוא 2-20 kDa. בנוסף, ספקטרה וכתוצאה מכך ניתן להשתמש להפלות זנים בבית-מינים מתחת ומתחת-תת-מין ברמה 3. המחקרים החלוציים מוקדם זיהו יונים סמן ביולוגי ספציפי עבור תת קבוצה מסוימת של זנים קמפילובקטר jejuni 4, Clostridium difficile 5, SSP enterica סלמונלה. serovar enterica typhi 6, Staphylococcus aureus 7 - 9, ו- Escherichia coli 10 - 12.

השילוב של מספר המונים משתנים סמן ביולוגי המתאימים isoforms אללים מציע את האפשרות עבור תת-סוגים עמוקים. בעבר, הצלחנו ליישם שיטה להמיר וריאציות אלה פרופילים המוניים לתוך יחסי phyloproteomic משמעות לשחזור קראו ספקטרומטריית מסת phyloproteomics המבוססת (MSPP) על ג SSP jejuni. לבודד jejuni אוסף 13. MSPP יכול לשמש השווה ספקטרומטריה לטכניקות לתת-סוגים מבוססים רצף DNA כמו הקלדת רצף multilocus (MLST).

מיני קמפילובקטר הם הגורם המוביל של גסטרואנטריטיס חיידקי ברחבי עולם 14, 15. כתוצאה sequela Campylobacteriosis שלאחר זיהומיות, כלומר, תסמונת גיאן-בארה, דלקת מפרקים תגובתית ומחלות מעי דלקתיות עלולות להתעורר 16. המקורות העיקריים של זיהום הםבשר בעלי חיים נגוע מן העוף, הודו, חזיר, בקר, כבשים וברווזים, מים וחלב משטח 15, 17. לכן, מחקרי מעקב קבועים אפידמיולוגיים בהקשר של בטיחות מזון נחוצים. MLST הוא "תקן הזהב" ב הקלדה מולקולרית עבור מיני קמפילובקטר 18. מכיוון הרצף סנגר שיטה המבוסס MLST הוא עבודה אינטנסיבית, זמן רבים יחסית יקר, הקלדת MLST מוגבלת מחזורים לבודדים קטנים יחסית. לכן, יש צורך בשיטות לתת-סוגים זולים יותר ומהירות יותר. צורך זה יכול להיות נפגשו על ידי שיטות ספקטרומטריה כמו MSPP.

בעבודה זו אנו מציגים פרוטוקול מפורט עבור הקלדת MSPP באמצעות אוסף של SSP jejuni קמפילובקטר. Doylei מבודד והשוואה של הפוטנציאל שלה עם MLST.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. הכינו סביבת עבודה בטוחה על ידי בהתחשב תנאי בטיחות ביולוגית

  1. הכר את תקנות מעבדה ובטיחות שאינן רלוונטיות לעבודה עם מיקרואורגניזמים. רוב מיקרואורגניזמים פתוגניים האדם חייב להיות מטופל בבית בטיחות ביולוגית ברמה 2 תנאים אבל כמה, כגון typhi serovar enterica סלמונלה, דורשים רמת בטיחות ביולוגית 3. מידע על רמת הטיפול בכל הפתוגן ניתן לגשת בכל www.cdc.gov/biosafety.
  2. לא משנה את סיווג Biohazard של מיקרואורגניזם המסוים, רואה את כל החומרים באים במגע עם סוכן זיהומיות כפסולת זיהומית שיש autoclaved לפני הסילוק. בהתאם להנחיות בטיחות אזוריות לחומרים מסוכנים וחומרים ביולוגיים. ודא כי מכולות מתאימות לסילוק מיידי ונכון של חומרים מזוהמים (biohazards) זמינים.
  3. ודא בכלים סטריליים (לולאות חיסון), פתרונות תקשורת והתרבות (צלחות אגרו) זמינות לפני תחילת תרבות חיידקים.
  4. לשטוף ידיים עם סבון חיטוי מים חמים מיד לאחר הטיפול מיקרואורגניזמים זיהומיות.

2. הפניה בחר ומבודד אוסף

  1. בחר ולקבל התייחסות רגילה אחד רצף הגנום לבודד יחד עם הרצפים של proteome המקודד, באופן אידיאלי בפורמט FASTA. אם יותר זנים רצף הגנום זמינים, כולל אלה בניתוח.
    הערה: זה לבודד / מבודד אלה יהיו בהמשך לשמש כדי לחזות את זהותו של הפסגות ההמוניות שנצפו ספקטרומטריית מסה (ראה סעיף 7).
  2. בחר ולקבל מגוון של בידודים מגוונים פוטנציאלי בצורה כזאת כי הם מכסים את תולדות הגזע של מינים או תת-מין של עניין.
    הערה: מקומות מבודדים האלה יהיו מאוחר יותר על לשמש כדי להדגים את ההשתנות של סמנים ביולוגיים באוכלוסייה (ראה סעיף 8).
  3. ודא כי כל האוסף ועיון לבודד (ים) הם פרוPerly יודפס על ידי תקן הזהב בהתאמה עבור האורגניזם המסוים הזה 18 - 20.
    הערה: זה עשוי לכלול מגוון של (תת) שיטות -typing, אבל תפנה צפוי MLST, אשר עדיין הוא השיטה הסטנדרטית להפגין מגוון גנטי של רוב המינים של חיידקים.
  4. כדי להסיק את הגזע בתוך האוסף, לחשב phylogram מנתוני ההקלדה, למשל, בשיטת קבוצת הזוג המשוקללת עם ממוצע אריתמטי (UPGMA) בתוכנת MEGA6 לנתוני MLST 21. לקבלת נתונים MLST, גם להתייעץ עם מסד נתונים MLST ולהקצות סוגים רצף ומכלולים המשובטים בהתאמה 22.
    הערה: זה יהיה מאוחר יותר לשמש כדי לנתח את congruency של MSPP עם שיטת ההקלדה מהתקן הקודם זהב (ראה סעיף 9).

3. הכינו צלחת MALDI יעד

זהירות: TFA הוא חומצה חזקה. שימוש לא נכון של TFA נושא בסיכון של כוויות עור קשות, פגיעה בעיניים o לגירוי חריףf דרכי הנשימה העליונה אם נשאף. לכן, אמצעי בטיחות מחמיר יש לכבד וציוד מגן אישי המתאים (PPE) כוללים משקפי בטיחות, מגן פנים, כפפות מתאימות, מגפיים, או אפילו בחליפת מגן מלאה נדרש, תוך טיפול TFA. חשיפה אפשרית כדי TFA חייבת להיות נשלטה על ידי טיפול החומר תחת אוורור נאה עם מערכת אוורור פליטה יעילה. במקרה של אוורור מספיק, מונשם עם מסנן אשר חייב לשמש. בנוסף, TFA מזיק החיים ימיים עם השפעות ארוכות טווח ארוך. כל מהדורות של TFA במים פסולים לסביבה יש להימנע.

הערה: לפני שמצאת את הדגימות לתוך מטרת MALDI, לנקות את צלחת היעד ביסודיות אם הצלחת שמשה בעבר.

  1. כן 100 מיליליטר 70% פתרון אתנול מימי באמצעות 30 מ"ל מי deionized ו 70 מיליליטר אתנול טהור.
  2. הכן 250 μl של חומצת 80% מימית trifluoroacetic פתרון (TFA) על ידי ערבוב 50μl מים deionized ו -200 μl 100% TFA בתוך שפופרת התגובה vortexing צינור 1 דקות.
  3. נקה את יעד MALDI על ידי צבת אותו לתוך צלחת זכוכית submersing אותו אתנול מימי 70% במשך כ 5 דקות בטמפרטורת חדר.
  4. שוטפים את היעד תחת מים חמים.
  5. באמצעות ממחטת נייר, לנגב את צלחת היעד באופן אינטנסיבי עם 70% אתנול פתרון מימי כדי להסיר את כל הדגימות קודמות ופסולת פוטנציאלית אחרת.
  6. אם ניקוי נוסף נדרש, לשטוף תחת מים חמים תוך מנגב עם ממחטת נייר.
  7. הסר שיורית, ואפשרות בלתי נראים, מזהמים, על ידי כיסוי פני שטח היעד עם שכבה דקה של 80% TFA המימי (~ 100 μl לכל 96 נקודות) ומוחה כל עמדות היעד נקיות עם ממחטת נייר.
  8. לבסוף, יש לשטוף את היעד להסיר חומצה, לנגב לו להתייבש באמצעות ממחטת נייר, ולהשאיר אותה לפחות 15 דקות בטמפרטורת החדר להתאדות נוזל שיורים.

4. הכנה של45; -Cyano-4-הידרוקסי-cinnamic פתרון מטריקס חומצה המכיל פנימי Calibrant

  1. הכן פתרון מטריקס רווי ידי המסת 10 α-cyano-4-הידרוקסי-cinnamic מ"ג חומצה (HCCA) ב 1 מ"ל של תערובת של אצטוניטריל 50%, 47.5% מים, 2.5% TFA. HCCA שלא נמס שיורית יישאר אם הפתרון הוא רווי.
  2. להוסיף אינסולין אנושי רקומביננטי כקובץ calibrant פנימי. לשם כך, להכין פתרון מניות לריכוז סופי של 10 pg / μl ב 50% אצטוניטריל מימית, aliquot ולאחסן ב -20 ° C לשימוש נוסף.

5. MALDI-TOF ספקטרומטריית מסה

הערה: תנאי התרבות ספציפיים עבור אורגניזמים עניין חייבים לשמש. דוגמאות עבור MALDI-TOF MS ניתן להכין באמצעות הכנה למרוח או החילוץ, בהתאם האורגניזם (ראה סעיף 8.4.1). בעוד שיטת חילוץ חומצה פורמית אתנול מספקת איון מספק של פתוגנים, הכנה למרוח צריכה להתבצע תחת suffתנאי בטיחות ביולוגיים icient כנדרש (ראה סעיף 1). בדרך כלל, אין סיכון של זיהום לאחר היישום של מטריקס, אבל עבור פתוגנים ספציפיים פרוטוקולים ספציפיים איון נדרשים. כך, למשל MALDI-TOF MS של מינים Nocardia דורש תמוגה הקודם של חיידקים במים רותחים, בעקבות משקעים אתנול של חלבונים 23. EI Khéchine et al. שיטה שפותח עבור איון של Mycobacteria ומחמם את מושבות חיידקים על 95 מעלות צלזיוס במשך שעה 1. צינורות בורג מכסה המכילים Tween מי 0.5% 20 24.

  1. הכנה למרוח
    1. מורחים כמות סיכה בגודל של מושבת חיידקים ישירות על עמדה צלחת היעד MALDI ( 'ספוט').
    2. Overlay כל נקודה עם 1 μl של מטריקס או מטריקס הרגיל HCCA המכיל את calibrant הפנימי ולהשאיר להתגבש בטמפרטורת חדר. לקביעת המסה המדויקת של שיא הכיול, שכבה על sp מלאot עם 1 μl מבחן סטנדרטי ו 1 μl של מטריקס HCCA המכיל את calibrant הפנימי.
      הערה: גם כאן, כמו מבחן סטנדרטי תמצית של אלפא Escherichia coli DH5 משמשת מדגים טביעת אצבע חלבון אופיינית MALDI-TOF MS. הוא ממוסמר אותו עם שני חלבונים להאריך את הגבול העליון של הטווח ההמוני לזיהוי.
  2. הפקת שיטה
    1. קציר כחמש מושבות מתרבות צלחת אגר עם לולאה חיסון להשעות ביסודיות 300 μl פעמיים מים מזוקקים בתוך שפופרת 1.5 תגובה מ"ל. להוסיף 900 ​​μl אתנול אבסולוטי ומערבבים היטב על ידי pipetting חוזר על עצמו עד מושבות חיידקים מושעים לחלוטין.
      הערה: בשלב זה אפשר והקים גם לאחסן דגימות ב -20 ° C. בנוסף, איון של פתוגנים יכול להיבדק על ידי פסי 1-10 μl של התמצית לצלחת אגרה מתאימה הבא הדגרתי על תנאי גידול אופטימליים. מוצלחהפעלה מצוינת על ידי בהעדר התפתחותם של חיידקים.
    2. צנטריפוגה מדגם ב 13,000 XG דקות 1, לבטל את supernatant, ולייבש גלולה בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות. Resuspend גלולה ביסודיות על ידי pipetting מעלה ומטה ב 50 μl של חומצה פורמית 70%.
    3. הוסף 50 μl של אצטוניטריל ומערבבים. סור פסול על ידי צנטריפוגה ב 13,000 XG במשך 2 דקות. העברת 1 μl של supernatant על עמדה מדגם על צלחת היעד MALDI ולהשאיר לייבוש למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.
    4. Overlay כל נקודה עם 1 μl של מטריקס HCCA המכיל את calibrant הפנימי ולהשאיר להתגבש בטמפרטורת חדר.
  3. הקלטה של ​​Mass ספקטרה
    הערה: שיא הקטיף מן הספקטרום המוני נעשה באמצעות הנהלים הקבועים מומלצים (אלגוריתם centroid; יחס S / N:. 2; rel סף עצמה: 2%; שיא רוחב 3 מ '/ z, חיסור בסיס: TopHat)
    1. כייל את המכשיר על פי 'protoc היצרניםol.
    2. עבור כל נקודה, לאסוף 600 ספקטרה בצעדים 100-יריות.
      1. עבור אל הכרטיסייה "AutoXecute" של תוכנת ההגדרה של ספקטרומטר מסה. פתח את "השיטה" על ידי שמאלי לחיצה על הכפתור "השיטה" ובחירה למשל השיטה "MBT_AutoX" מהתפריט הנפתח.
      2. שמאל לחץ זכות כפתור "ערוך ..." בתפריט "השיטה" כדי לפתוח את "עורך שיטות AutoXecute". עבור אל הכרטיסייה "הצטברות". בחר את "לסכם" הערך "600" ואת "יריות משביעות הרצון ב" "צעדים ירו" _x_ ערך "100".
  4. הליך כיול ספקטרום פנימי
    הערה: טעויות מדידה דקה אינהרנטי ספקטרומטריית מסה. בהתאם לשימוש מכשיר לסירוגין, טמפרטורת מכשיר כיול מחדש, ערכי המדידות שהתקבלו עשויים להשתנות בין ניסויים. בעקבות כיול המכשיר מראש מדידה כיול ספקטרום שלאחר מדידה אל calibrant הפנימי הוא הדרך המדויקת ביותר כדי להבטיח יכולת השוואת ספקטרום היתר.
    1. בצע את ההליכים הבאים עבור כל רשימת שיא כיול:
      1. התחל דפדפן ספקטרום (למשל, flexAnalysis וספקטרום פתוח:. תפריט "קובץ" → "פתח ...")
      2. צור רשימת בקרה המוני עם שיא calibrant: תפריט "שיטה" → "פתח ...".
      3. בחר שיטה: → MBT_Standard.FAMSMethod "פתח".
      4. רשימת בקרת Mass עריכה: בטל את כל Calibrants.
      5. להוסיף Calibrant שיא בתחתית: תווית שיא: "Insulin_HIStag [M + H] + _ ממוצע"; m_z: "5808.29"; סובלנות [ppm]: "50"; סמן את תיבת הסימון Calibrant.
      6. שמירה בשם, למשל, "רשימת calibrant MSPP".
    2. עבור כל ספקטרום, לבחור את שיא calibrant מהרשימה, לחץ על "אוטומט הקצאה" ולחץ על "אישור".
ove_title "> 6. בדוק את נוהל הכיול הפנימי

  1. ניסיוני לקבוע את המסה המדויקת של שיא הכיול.
    1. הכינו שתי נקודות עם 1 μl מבחן סטנדרטי בכל (שלב 5.1.1). Overlay הראשון עם 1 μl מטריקס HCCA רגיל, השני עם 1 μl מטריקס-ממוסמר calibrant.
    2. השג ספקטרה המונית מכל נקודה (סעיף 5.3), וכלפי פנים לכייל אל הפסגות הרגילות מבחן (סעיף 5.4).
    3. Overlay היא ספקטרה ידי פתיחתם עם דפדפן הספקטרום (למשל, flexAnalysis וספקטרום פתוח: תפריט "קובץ" → "פתח ...") ומציאה לשיא המסה הצפויה (אינסולין m / z = 5,808.29), אשר אמור להיות נוכח הספקטרום ממוסמר-calibrant, אבל לא בספקטרום שהושג עם מטריקס הרגיל.
  2. בדוק כי Calibrant הפיק לא מטושטש על ידי כל ביומרקר אחר של האורגניזם עניין.
    1. הכן שתי נקודות (סעיף 5.1) עם זן ההתייחסות אובה rlay הראשון עם 1 μl מטריקס רגיל, השני עם 1 μl מטריקס-ממוסמר calibrant.
    2. רוכשת ספקטרה המונית משני הכתמים (סעיף 5.3) ו שכבת הספקטרום שהתקבל על ידי פתיחתם עם דפדפן הספקטרום (למשל, flexAnalysis וספקטרום פתוח: תפריט "קובץ" → "פתח ..."). ודא כי שיא calibrant נראה בבירור בספקטרום שהושג עם מטריקס הממוסמר ולא מוסתר על ידי אחר אות סמוך. אם זה אינו המקרה, לבחור calibrant אחר עבור האורגניזם המסוים הזה.
      הערה: שימוש calibrant פנימי ממוסמר מגביר באופן משמעותי את דיוק כדי לקבוע וריאציות של ההמונים סמן ביולוגי. באמצעות שיטה זו, הבדלים המוניים עד 1 Da ניתן לאתר. לחלופין, גם המונים משתנים שמקורם אורגניזמים עשויים לשמש calibrants. עם זאת, על פי הגדרתו, כל ההמונים הנגזרות אורגניזם חייב להיחשב פוטנציאל משתנה, אלא אם כן הוכח אחרת.

"Jove_title"> 7. זיהוי סמנים ביולוגיים יונים בזן עכברי ההפניה

  1. מדוד את הספקטרום ההמוני של זני ההפניה, שימוש מטריקס ממוסמר עם Calibrant הפנימי.
    1. מורח כמות סיכה בגודל של מושבת חיידקים (סעיף 5.1) או 1 μl של תמצית חלבון חיידקים (סעיף 5.2) ישירות על גבי עמדת צלחת יעד MALDI ( 'ספוט').
    2. Overlay כל נקודה עם 1 μl של מטריקס HCCA המכיל את calibrant הפנימי ולהשאיר את צלחת היעד להתגבש בטמפרטורת חדר (סעיף 5.1.2 / 5.2.4).
    3. ספקטרה מונית שיא של זן ההפניה (סעיף 5.3).
  2. מבחינה פנימית לכייל את ספקטרום התייחסות מסת calibrant (כאן: אינסולין m / z = 5,806.29), ולאחר מכן בתהליך מראש על ידי חיסור בסיס (TopHat) והעלמה (פרמטרים: SavitzkyGolay; רוחב: 2 מ '/ z, 10 מחזורים).
    1. התחל דפדפן ספקטרום (למשל, flexAnalysis וספקטרום פתוח: תפריט "קובץ" → "פתח ...; ").
    2. בחר שיטה: "שיטה" תפריט הנפתח → "פתח ...", שמאל-לחץ על שיטת הבחירה, למשל, "MBT_Standard.FAMSMethod" → "פתח".
    3. כיול ספקטרום על ידי בחירה "פנימי ..." מתוך התפריט הנפתח "כיול". נפתח חלון המפרט את שיא calibrant (ים) (סעיף 5.4). שמאלי שיא calibrant (אינסולין) → שמאל ולחץ על "אישור". בחר "ספקטרה תהליך" מתוך התפריט הנפתח "תהליך".
    4. עבור חיסור בסיס להפעלת הספקטרום ברשימת הספקטרום בצד ימין. בחר "פחת Baseline הספקטרום ההמוני" מהתפריט הנפתח "התהליך".
    5. כדי להחליק את הספקטרום, להפעיל את הספקטרום ברשימת הספקטרום בצד ימין. בחר "Smooth Baseline הספקטרום ההמוני" מהתפריט הנפתח "התהליך".
  3. מנתוני רצף הגנום של זן ההתייחסות, לחשב את theoretical monoisotopic משקל מולקולרי של כל אחד החלבונים המקודדים על ידי מתרגם את רצף ה- DNA לתוך רצף החומצות האמיניות המתאים באמצעות עורך יישור רצף. העתק-הדבק רצף החלבון הזה לתוך תיבת קלט בפורטל משאבים ביואינפורמטיקה ExPASy (http://web.expasy.org/compute_pi/). ולחץ על "לחץ כאן" כדי לחשב PI / Mw. במקרה של ג jejuni SSP. doylei לחשב את המסה של 14 סמנים לזיהוי.
  4. העתק את התוצאות לגיליון אלקטרוני, עם עמודה אחת המכילה את מזהה הגן ואת המשקל המולקולרי הבא. מיין השורות לפי משקל מולקולרי מחושב כדי להקל בדיקה קלה יותר של ההמונים. הערה: עמודות אחרות הם אופציונליים; ביאור פונקציונלי עשוי להיות שימושי במיוחד מאוחר יותר לפרשנות.
  5. הוספת טור שני לתוך הגיליון האלקטרוני עבור המשקל המולקולרי של טופס דה-methioninated, הפחתת 135 Da מן המשקל המולקולרי monoisotopic. הערה: הסיבה לכך היא כי חלבונים מסוימים עוברים פוסטשינוי translational ידי הסרת פרוטאוליטים של מתיונין N -terminal.
  6. להקצות לכל המוני סמן ביולוגי שנמדד גדול להמונים שנמדדים זן ההתייחסות מלהסתכל עד המסה נמדדת משולחן הגנום המוכן לעיל (טבלה 1).
  7. אם היונים סמנו הביולוגיים לא ניתן להקצות למוצרי גן חזה, לשקול שינויי posttranslational אחרים (מתילציה, acetylation, prenylation, וכו '; לראות http://www.abrf.org/delta-mass עבור אוסף של שינויים והשינויים ההמוניים הקשורים ). בגין כל שינוי posttranslational ידוע אחר כי הוא ציין בתדירות גבוהה האורגניזמים העניין להוסיף עמודה נוספת בטבלה ולחשב את המשקל המולקולרי מקביל לתהליך עבור הטופס-methioninated דה.
  8. הגדרה אחר כרטיסיית גיליון אלקטרונית, ולהקליט עבור כל סמן ביולוגי יון המסה מזהה בטור בטבלה נפרד.

8. הערכה ביומרקר השתנותבאוכלוסייה

  1. כיול ספקטרה מונית המתקבלת אוסף מבודד, כפי שנעשה עבור זן ההפניה (ים) (סעיף 5.4.2).
  2. זיהוי סמנים ביולוגיים וריאנט של ספקטרה ההמונית. מסת גרסה מאופיינת בהעדר מסה הידועה מספקטרום ההתייחסות והמראה של המוני רומן אינו נוכח בהפניה. ההבדל המוני צריך להיעשות על פי חילופי חומצה אמינית אחת (לוח 2), או שילוב של כל אלה.
  3. באחת לבודד בכל שורה, להקליט המסה הנמדדת עבור כל סמן ביולוגי ואת איזופורם החזויה עמודות הטבלה בהתאמה.
    הערה: לעתים נדירות, כמה משמרות המוניות ניתן לייחס לכמה חילופים שונים של חומצות אמיניות, למשל, הן, N החליף ידי D ו- Q החליף ידי E, ולהיפך, לגרום שינוי מסה של 0.985 Da (טבלה 2). בעיה מהותית זה לא ניתן לפתור על ידי ספקטרומטריית מסה לבד. לכן, isoforms השונה במישור רצף החלבון נתקל באותה המסהחייב להיות כאל סוג MSPP יחיד. רצף סנגר מקביל של גני יון סמן הביולוגיים המסוימים אשר כי בעיה זו לא התרחשה תוך MSPP-הקלדת ג SSP jejuni. doylei לבודד אוסף השתמשו במחקר זה.
  4. אשר סוגי MSPP רומן מאת PCR-הגברת רצף הגנים סמנו הביולוגיים בהתאמה. לעומת זאת, זה גם מהווה אישור כי זהות סמן ביולוגי הוקצה כראוי.
    1. חיידקי תרבות מבודדים תחת תנאי גידול אופטימליים. תרבות ג jejuni SSP. doylei זנים על אגרת קולומביה בתוספת 5% דם כבשים על 37 מעלות צלזיוס בתנאי microaerophilic (5% מ 2, 10% CO 2, 85% N 2). דגירה עבור בקירוב 48 שעות. משתמש בצלחת אגרה נפרדת לכל לבודד כדי למנוע מגע בין שתי.
    2. חלץ הדנ"א הגנומי של הבידודים חיידקי באמצעות מכונות ערכת חילוץ DNA מתאימה / אוטומטיות על פי הוראות היצרן.
    3. להגביר את הגנים סמן ביולוגי בהתאמה באמצעות פריימרים המפורטים בטבלה 3 בצע כל התגובות PCR בתנאים הבאים:. denaturation על 94 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות; חישול ב 55 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות; התארכות ב 72 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות.
    4. לקבוע את רצף ה- DNA של כל amplicon ידי רצף סנגר באמצעות כמות מתאימה של ה- DNA הגנומי (בדרך כלל 600-700 ng של DNA מספיק בריכוז של בערך 100 ng / μl) ואחד פריימרים ההגברה (בדרך כלל זה נעשה על ידי שימוש של ספק שירות).
  5. בטבלה נפרדת (ראה טבלה 4), לרשום את רצף החלבון מוּסָק לכל איזופורם רומן באמצעות כלי תרגום מתאימים (למשל, Transseq: http://www.ebi.ac.uk/Tools/st/) 25.

9. חישוב תולדות גזע MSPP מבוססים השוויתי את בסיס הזהב

  1. לשרשר רצף חומצות אמינו סמן ביולוגי מסוים השייך tסוג שהוא MSPP של המבודד הופך רצף מתמשך אחד באמצעות עורך יישור רצף, כגון BioEdit (http://www.mbio.ncsu.edu/bioedit/bioedit.html) 26 או בגיליון האלקטרוני סמן ביולוגי.
  2. חישוב תולדות גזע על ידי אשכולות כפי שנעשה עבור נתוני הקלדת תקן זהב, למשל, UPGMA אשכולות 21.
  3. השווה את תולדות הגזע MSPP מבוססות לזו שהושגה עם תקן הזהב 4, 13.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

בעבר, הקמנו בהצלחה תוכנית MSPP עבור ג SSP jejuni. jejuni 13. כאן, אנו שמטרתו להאריך את השיטה לאח תת-מין C. SSP jejuni. doylei. בשנת הגדרה ספציפית זו, שבע ג SSP jejuni. doylei מבודד נרכשו מאוסף הבלגי של מיקרואורגניזמים / מעבדה למיקרוביולוגיה UGent BCCM / LMG גנט, בלגיה. כל שבעה המבודד המשמש בניתוחים שלנו היה ממקור אנושי. זן-רצף הגנום ATCC 49349 (LMG 8843), במ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

השלב הקריטי ביותר בהקמת בסכימת MSPP הוא קביעת גנטיות חד-משמעית של זהויות יון סמן ביולוגי. אם לא ניתן לזהות סמן ביולוגי ללא ספק, אז זה צריך להיות מחוץ מהתכנית 13.

ג ערכת SSP jejuni. doylei כוללת 14 יוני סמן ביולוגיים שונים. אלה הם 5 פחות בהשוואה ג SSP jejuni. ערכת MSPP jejuni 13 .the ההבדל המשמעותי ביותר בין לזיהוי ג SSP jejun...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למחברים אין מה לחשוף.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו אסירי תודה לחנה קליינשמידט על התמיכה הטכנית המצוינת. מאמר זה מומן על ידי תוכנית התמיכה בגישה פתוחה של Deutsche Forschungsgemeinschaft וקרן הפרסום של Georg August Universität Göttingen.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
acetonitrileSigma-Aldrich , טאופקירכן, גרמניה34967
Autoflex III TOF/TOF 200 systemBruker Daltonics, ברמן, גרמניהGT02554 G201ספקטרומטר
מסה תקן בדיקת חיידקים BTSBruker Daltonics, ברמן, גרמניה604537
BioTools 3.2 SR1Bruker Daltonics, ברמן, גרמניה263564חבילת תוכנה
Bruker IVD Bakterial Test StandardBruker Daltonics, ברמן, גרמניה82901905 צינורות
Campylobacter jejuni subsp. doylei isolate בלגיה תיאם איסוף מיקרואורגניזמים/המעבדה למיקרוביולוגיה UGent BCCM/LMG גנט, בלגיהLMG8843ATCC 49349; IMVS 1141; NCTC 11951; זן 093
Campylobacter jejuni subsp. doylei isolate בלגיה תיאם אוסף מיקרואורגניזמים/המעבדה למיקרוביולוגיה UGent BCCM/LMG גנט, בלגיהLMG9143Goossens Z90
Campylobacter jejuni subsp. doylei isolate בלגיה תיאם איסוף מיקרואורגניזמים / המעבדה למיקרוביולוגיה UGent BCCM/LMG גנט, בלגיהLMG7790ATCC 49350; CCUG 18265; קספר 71; LMG 8219; NCTC 11847
Campylobacter jejuni subsp. doylei isolate בלגיה תיאם אוסף של מיקרואורגניזמים/המעבדה למיקרוביולוגיה UGent BCCM/LMG גנט, בלגיהLMG9243Goossens N130
Campylobacter jejuni subsp. doylei isolate בלגיה תיאם איסוף מיקרואורגניזמים/המעבדה למיקרוביולוגיה UGent BCCM/LMG גנט, בלגיהLMG8871NCTC A603/87
Campylobacter jejuni subsp. doylei isolate בלגיה תיאם אוסף מיקרואורגניזמים/המעבדה למיקרוביולוגיה UGent BCCM/LMG גנט, בלגיהLMG9255Goossens B538
Campylobacter jejuni subsp. doylei isolate בלגיה תיאם אוסף מיקרואורגניזמים / המעבדה למיקרוביולוגיה UGent BCCM / LMG גנט, בלגיהLMG8870NCTC A613/87
בסיס אגר קולומביה Merck, דרמשטדט, גרמניה1.10455 .0500500 גרם
מצפן עבור FlexSeries 1.2 SR1Bruker Daltonics, ברמן, גרמניה251419חבילת תוכנה
דפיברין דם כבשים Oxoid Deutschland GmbH , וזל, גרמניהSR0051
אתנולSigma-Aldrich , טאופקירכן, גרמניה02854 Fluka
formicacid Sigma-Aldrich , טאופקירכן, גרמניהF0507
HCCA matrixBruker Daltonics, ברמן, גרמניה604531
טישו נייר KimwipesKimtech Science via Sigma-Aldrich, Taufkirchen, גרמניה
MALDI Biotyper 2.0Bruker Daltonics, ברמן, גרמניהחבילת תוכנה
259935 תורן בקבוקוני CryobankMast Diagnostica, ריינפלד, גרמניהCRYO/B
MSP 96 יעד פלדה מלוטשתBruker Daltonics, ברמן, גרמניה224989
QIAamp DNA Mini Kit Qiagen , הילדן, גרמניה51304
אינסולין אנושי רקומביננטיSigma-Aldrich , טאופקירכן, גרמניהI2643
חומצה טריפלואורואצטיתSigma-Aldrich , טאופקירכן, גרמניהT6508
מים, ביולוגיה מולקולרית בדרגהSigma-Aldrich , טאופקירכן, גרמניהW4502
Z188956

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Seng, P., et al. Ongoing revolution in bacteriology: routine identification of bacteria by matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry. Clin Infect Dis. 49 (4), 543-551 (2009).
  2. Bader, O. MALDI-TOF-MS-based species identification and typing approaches in medical mycology. Proteomics. 13 (5), 788-799 (2013).
  3. Sandrin, T. R., Goldstein, J. E., Schumaker, S. MALDI TOF MS profiling of bacteria at the strain level: a review. Mass Spectrom Rev. 32 (3), 188-217 (2013).
  4. Zautner, A. E., et al. Discrimination of multilocus sequence typing-based Campylobacter jejuni subgroups by MALDI-TOF mass spectrometry. BMC Microbiol. 13, 247(2013).
  5. Reil, M., et al. Recognition of Clostridium difficile PCR-ribotypes 001, 027 and 126/078 using an extended MALDI-TOF MS system. Eur J Clin Microbiol Infect Dis. 30 (11), 1431-1436 (2011).
  6. Kuhns, M., Zautner, A. E., et al. Rapid discrimination of Salmonella enterica serovar Typhi from other serovars by MALDI-TOF mass spectrometry. PLoS One. 7 (6), e40004(2012).
  7. Wolters, M., et al. MALDI-TOF MS fingerprinting allows for discrimination of major methicillin-resistant Staphylococcus aureus lineages. Int J Med Microbiol. 301 (1), 64-68 (2011).
  8. Josten, M., et al. Analysis of the matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrum of Staphylococcus aureus identifies mutations that allow differentiation of the main clonal lineages. J Clin Microbiol. 51 (6), 1809-1817 (2013).
  9. Lu, J. J., Tsai, F. J., Ho, C. M., Liu, Y. C., Chen, C. J. Peptide biomarker discovery for identification of methicillin-resistant and vancomycin-intermediate Staphylococcus aureus strains by MALDI-TOF. Anal Chem. 84 (13), 5685-5692 (2012).
  10. Novais, A., et al. MALDI-TOF mass spectrometry as a tool for the discrimination of high-risk Escherichia coli clones from phylogenetic groups B2 (ST131) and D (ST69, ST405, ST393). Eur J Clin Microbiol Infect Dis. , (2014).
  11. Matsumura, Y., et al. Detection of extended-spectrum-beta-lactamase-producing Escherichia coli ST131 and ST405 clonal groups by matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry. J Clin Microbiol. 52 (4), 1034-1040 (2014).
  12. Christner, M., et al. Rapid MALDI-TOF Mass Spectrometry Strain Typing during a Large Outbreak of Shiga-Toxigenic Escherichia coli. PLoS One. 9 (7), e101924(2014).
  13. Zautner, A. E., Masanta, W. O., Weig, M., Groß, U., Bader, O. Mass Spectrometry-based PhyloProteomics (MSPP): A novel microbial typing Method. Scientific Reports. 5, (2015).
  14. The global view of campylobacteriosis. WHO. World Health Organisation (WHO), , Available from: http://www.who.int/foodsafety/publications/campylobacteriosis/en/ (2013).
  15. Dasti, J. I., Tareen, A. M., Lugert, R., Zautner, A. E., Gross, U. Campylobacter jejuni: a brief overview on pathogenicity-associated factors and disease-mediating mechanisms. Int J Med Microbiol. 300 (4), 205-211 (2010).
  16. Zautner, A. E., et al. Seroprevalence of campylobacteriosis and relevant post-infectious sequelae. Eur J Clin Microbiol Infect Dis. 33 (6), 1019-1027 (2014).
  17. Zautner, A. E., Herrmann, S., Groß, U. Campylobacter jejuni - The Search for virulence-associated factors. Archiv Fur Lebensmittelhygiene. 61 (3), 91-101 (2010).
  18. Dingle, K. E., et al. Multilocus sequence typing system for Campylobacter jejuni. J Clin Microbiol. 39 (1), 14-23 (2001).
  19. Dingle, K. E., et al. Molecular characterization of Campylobacter jejuni clones: a basis for epidemiologic investigation. Emerg Infect Dis. 8 (9), 949-955 (2002).
  20. Cody, A. J., et al. Real-time genomic epidemiological evaluation of human Campylobacter isolates by use of whole-genome multilocus sequence typing. J Clin Microbiol. 51 (8), 2526-2534 (2013).
  21. Tamura, K., Stecher, G., Peterson, D., Filipski, A., Kumar, S. MEGA6: Molecular Evolutionary Genetics Analysis version 6.0. Mol Biol Evol. 30 (12), 2725-2729 (2013).
  22. Jolley, K. A., Chan, M. S., Maiden, M. C. mlstdbNet - distributed multi-locus sequence typing (MLST) databases. BMC Bioinformatics. 5, 86(2004).
  23. Verroken, A., et al. Evaluation of Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization-Time of Flight Mass Spectrometry for Identification of Nocardia Species. J Clinl Microbiol. 48 (11), 4015-4021 (2010).
  24. El Khéchine, A., Couderc, C., Flaudrops, C., Raoult, D., Drancourt, M. Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization Time-of-Flight Mass Spectrometry Identification of Mycobacteria in Routine Clinical Practice. PLoS ONE. 6 (9), e24720(2011).
  25. Goujon, M., et al. A new bioinformatics analysis tools framework at EMBL-EBI. Nucleic Acids Research. 38, Web Server issue 695-699 (2010).
  26. Hall, T. A. BioEdit: a user-friendly biological sequence alignment editor and analysis program for Windows 95/98/NT. Nucleic Acids Symposium Series. 41, 95-98 (1999).
  27. Jolley, K. A., et al. Ribosomal multilocus sequence typing: universal characterization of bacteria from domain to strain. Microbiology. 158, 1005-1015 (2012).
  28. Suarez, S., et al. Ribosomal proteins as biomarkers for bacterial identification by mass spectrometry in the clinical microbiology laboratory. J Microbiol Methods. 94 (3), 390-396 (2013).
  29. Teramoto, K., et al. Phylogenetic classification of Pseudomonas putida strains by MALDI-MS using ribosomal subunit proteins as biomarkers. Anal Chem. 79 (22), 8712-8719 (2007).
  30. Teramoto, K., Kitagawa, W., Sato, H., Torimura, M., Tamura, T., Tao, H. Phylogenetic analysis of Rhodococcus erythropolis based on the variation of ribosomal proteins as observed by matrix-assisted laser desorption ionization-mass spectrometry without using genome information. J Biosci Bioeng. 108 (4), 348-353 (2009).
  31. Bernhard, M., Weig, M., Zautner, A. E., Gross, U., Bader, O. Yeast on-target lysis (YOTL), a procedure for making auxiliary mass spectrum data sets for clinical routine identification of yeasts. J Clin Microbiol. 52 (12), 4163-4167 (2014).
  32. Stark, T., et al. Mass spectrometric profiling of Bacillus cereus strains and quantitation of the emetic toxin cereulide by means of stable isotope dilution analysis and HEp-2 bioassay. Anal Bioanal Chem. 405 (1), 191-201 (2012).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

MALDI TOF MS

מאמרים קשורים