כאן, אנו מציגים מודל כבד עכבר אנושי חדש שנוצר בעכברי נוקאאוט של תאים מתווכים של קולטן רעלן Alb (TRECK)/SCID לאחר השתלת תאי גזע כבד אנושיים לא בשלים וניתנים להרחבה.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
דור של כבד עכבר אנושי באמצעות תאי גזע אנושי כבדיה
* These authors contributed equally
במאמר זה
סיכום
תקציר
פותח מודל חדש של בעלי חיים הכולל עכברים כימריים עם כבד אנושי שהוקם באמצעות השתלת הפטוציטים אנושיים. עכברים אלה, שבהם הכבד אוכלס מחדש בהפטוציטים אנושיים פונקציונליים, יכולים לשמש ככלי שימושי לחקר הביולוגיה של תאי הכבד האנושיים, מטבוליזם של תרופות ויישומים פרה-קליניים אחרים. אחד הגורמים המרכזיים הנדרשים להשתלה מוצלחת של הפטוציטים אנושיים בעכברים הוא חיסול ההפטוציטים האנדוגניים כדי למנוע תחרות עם התאים האנושיים ולספק מרחב ומיקרו-סביבה מתאימים לקידום התרחבות והתמיינות של תאי תורם אנושיים. עד כה, הוקמו שני מודלים עיקריים של עכברים לפגיעה בכבד המשתמשים בעכברי fumarylacetoacetate hydrolase (Fah) ו-uroplasminogen activator (uPA). עם זאת, עכברי Fah משמשים בעיקר עם הפטוציטים בוגרים והיישום של מודל ה-uPA מוגבל על ידי ירידה ברבייה. כדי להתגבר על מגבלות אלה, נעשה שימוש בעכברי נוקאאוט תאים מתווכים של קולטן רעלן Alb (TRECK)/SCID להתמיינות in vivo של הפטוציטים אנושיים לא בשלים ויצירת כבד אנושי. תאי גזע כבדיים אנושיים (HpSCs) אכלסו מחדש בהצלחה את הכבד של עכברי Alb-TRECK/SCID שפיתחו אי ספיקת כבד קטלנית לאחר טיפול ברעלן דיפתריה (DT). למודל זה של כבד אנושי בעכברי Alb-TRECK/SCID יהיו יישומים פונקציונליים במחקרים הכוללים מטבוליזם של תרופות ואינטראקציות בין תרופות ויקדם מחקרים אחרים in vivo ו-in vitro.
מבוא
עכברים משמשים בדרך כלל לניסויים פרמצבטיים מכיוון שהמחקר הביו-רפואי בבני אדם מוגבל1; עם זאת, מודלים אלה לא תמיד שימושיים מכיוון שהם עשויים לדמות באופן לא מדויק את ההשפעות שנצפו בבני אדם. רוב התרופות בשימוש רפואי כיום עוברות חילוף חומרים בעיקר בכבד. עם זאת, אותה תרופה יכולה לעבור חילוף חומרים למטבוליטים שונים בכבד של עכברים ובני אדם בגלל הבדלים בין מינים. לפיכך, לעתים קרובות קשה לקבוע במהלך הפיתוח אם תרופה פוטנציאלית מהווה סיכונים כלשהם ליישומים קליניים2,3.
כדי לטפל בבעיה זו, כבדי עכברים "אנושיים" פותחו על ידי גידול תאי כבד אנושיים בתוך עכברים4-6; מודלים אלה מציגים תגובות תרופתיות דומות לאלו שנצפו בכבד האנושי....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
כל הפרוצדורות בבעלי חיים בוצעו בהתאם להנחיות צער בעלי חיים של אוניברסיטת העיר יוקוהמה.
1. דור של במודל העכבר הפגיע בכבד החריף
- הוסף 1 מ"ל של תמיסת 0.85% NaCl phenolized (פנול 0.6 גרם ב 100 מ"ל של תמיסת 0.85% NaCl) עד 1 רעלן דיפתריה מ"ג (DT) כדי להפוך פתרון מניות 1 מ"ג / מ"ל DT. הערה: DT בריכוז של 1 מ"ג / מ"ל ניתן לאחסן כ 2 שנים 3 מעלות צלזיוס עד 8 מעלות צלזיוס.
- סדרתי לדלל את פתרון מניות 1 מ"ג / מיליליטר DT 0.3 מיקרוגרם....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
Alb-TRECK / hepatocytes עכברי SCID המבטא את גן HB-EGF קולטן DT אדם בשליטת אמרגן אלבומין ולהציג השפעות ציטוטוקסיות הבאים DT ממשל 12. כדי להעריך את ההשפעות של טיפול DT על פגיעה בכבד, מינונים DT של 1.5 מיקרוגרם / ק"ג הוזרקו בן 8 שבועות Alb-TRECK / SCID עכברים ואת שינויים פתולוגיים בממשל הכבד 48 שעות שלאחר DT הוערכו היסטולוגית. לעומת עכברי שליטה (שלא טופלו ב- DT), העכברים שטופלו DT הציגו ארכיטקטורה כבדה מאורגנת מראה תיקון עבור גודש עם פ.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
מחקרים שנעשו לאחרונה הראו כי הכבד העכבר ניתן אוכלס מחדש עם hepatocytes אדם, כולל hepatocytes מבוגר בתאי גזע בכבד שגשוג 17. כבדי אוכלס מחדש אלה שימשו דגמים ניסיוניים פרה-קליניים עבור בדיקות סמים מטבוליזם גילוי ופיתוח תרופות 18; בנוסף, סיפקו להם בסביבה vivo עבור התבגרות התא והבחנה 19. המטרה הראשית של המחקר הנוכחי הייתה ליצור מודל עכבר מחלת כבד רומן שאפשר התפשטות hepatocyte בשלה אדם, התבגרות, והבחנה, לרכישת פעילות חילוף חומרי סמים.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
למחברים אין אינטרסים פיננסיים מתחרים לחשוף.
תודות
ברצוננו להודות לפרויקט הגנטיקה של היונקים, המכון המטרופוליטני למדעי הרפואה של טוקיו, על אספקת העכברים. אנו מודים גם ל-S. Aoyama ו-Y. Adachi ממכון המחקר ADME (ספיגה, הפצה, מטבוליזם, הפרשה) וטוקסיקולוגיה, Sekisui Medical Company Ltd., יפן, ול-K. Kozakai ו-Y. Yamada על הסיוע בניתוח LC-MS/MS. עבודה זו נתמכה בחלקה על ידי מענקי סיוע ממשרד החינוך, התרבות, הספורט, המדע והטכנולוגיה (MEXT), יפן ל-Y-W.Z. (18591421, 20591531 ו-23591872); על ידי הפרויקט החדשני והיזמי של ג'יאנגסו להכנסת כישרונות ברמה גבוהה ופרויקט תכנון המדע והטכנולוגיה של ג'יאנגסו (BE2015669); ועל ידי מענקים ל-H.T. לקידום אסטרטגי של מחקר ופיתוח חדשני (S-innovation, 62890004) מסוכנות המדע והטכנולוגיה היפנית.
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| אלבומין אנושי | סיגמא | A6684 | עכבר |
| אנושי CK19 | עכבר דאקו | M088801 | |
| גרעינים אנושיים | Millipore | MAB1281 | עכבר |
| אנושי CK8/18 | Progen | GP11 | חזיר ניסיונות |
| CDCP1 | Biolegend | 324006 | עכבר |
| CD90 | BD | 559869 עכבר | |
| CD66 | BD | 551479 | עכבר |
| GOT/AST-PIII | Fujifilm | 14A2X10004000009 | |
| DMEM/F-12 | Gibco | 11320-033 | |
| FBS | Biowest | S1520 | |
| 0.05% טריפסין-EDTA | Gibco | 25300-054 | |
| רעלן דיפתריה | Sigma | D0564-1MG | |
| אלבומין אנושי ELISA ערכת | Bethyl Laboratories | E88-129 | |
| מזרק (1 מ"ל) | Terumo | SS-01T | |
| 32G 1/2 אינץ' מחט | TSK | PRE-32013 | |
| O.C.T.Compound (118 מ"ל) | Sakura Finetek יפן | 4583 | |
| סדרן תאים מהיר MoFlo | בקמן קולטר | B25982 | |
| DRI-CHEM 7000 | Fujifilm | 14B2X10002000046 |
מקורות
- Muruganandan, S., Sinal, C. Mice as clinically relevant models for the study of cytochrome P450-dependent metabolism. Clin. Pharmacol. Ther. 83, 818-828 (2008).
- Nishimura, T., et al. Using chimeric ....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
תגיות
