מאמר שיטה

דור וזיהוי GM-CSF נגזר מכתשיים דמוי מאקרופאגים דנדריטים תאי עכבר מח עצם

17.8K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/54194

⸱

25 ביוני 2016

 ,  ,  ,  ,  , 
1Microbiology and Immunology, University of British Columbia

במאמר זה

סיכום

תאי מח עצם שגודלו עם גורם מגרה מושבת מקרופאגים גרנולוציטים (GM-CSF) מייצרים תרבית הטרוגנית המכילה מקרופאגים ותאים דנדריטיים (DCs). שיטה זו מדגישה שימוש בקשירת MHCII והיאלורונן (HA) כדי להבדיל בין מקרופאגים ל-DCs בתרבית GM-CSF. למקרופאגים בתרבות זו יש קווי דמיון רבים למקרופאגים המכתשית.

תקציר

המקרופאגים ותאים דנדריטיים (DCS) הם תאים חיסוניים מולדים נמצא ברקמות ואיברים הלימפה כי לשחק תפקיד מפתח בהגנה מפני פתוגנים. עם זאת, הם קשים לבודד בכמות מספקת כדי ללמוד אותם בפירוט, ולכן, במבחנת מודלים פותחו. בתרבויות במבחנה של מקרופאגים עצם שמקורם במח ותאי דנדריטיים הם ומבוססים ושיטות בעל ערך עבור מחקרים אימונולוגית. כאן, שיטת culturing וזיהוי הוא DCS ו מקרופאגים מתרבה אחת של תאים במח עצם עכבר העיקרי באמצעות גורם מגרת מושבת מקרופאג גרנולוציט ציטוקינים (GM-CSF) מתוארת. פרוטוקול זה מבוסס על ההליך הוקם ראשון שפותח על ידי ואח 'לוץ. בשנת 1999 עבור DCs עצם שמקורם במח. התרבות היא הטרוגנית, הכוללת MHCII ו hyaluronan fluoresceinated (FL-HA) משמשים כדי להבחין מקרופאגים DCs בשלה ובוגרת. GM-CSF אלה מתקבלים מקרופאגים פרוvide מקור נוח של מקרופאגים נגזר במבחנה כי הדומים מקרופאגים מכתשיים בשני הפנוטיפ ותפקוד.

מבוא

כמה בשיטות תרבות במבחנה תוארו ליצור מקרופאגים עצם שמקורם במח (BMDMs) ו DCs עצם שמקורם במח (BMDCs) באמצעות אחד או שילוב של גורמי גדילה. BMDMs יכול להיווצר על ידי culturing תאים במח העצם או באמצעות גורם מגרה המושבה מקרופאג (M-CSF) או GM-CSF 1,2. לקבלת BMDCs, תוספת של ליגנד FLT3 לתרבות מח עצם מוליד DCs קלאסית plasmacytoid לא חסיד (CD11c גבוה / גבוהה CD11c MHCII lo, B220 + בהתאמה) לאחר 9 ימים בתרבות 3,4. לעומת זאת, תאים שאינם חסידים שנוצרו לאחר 7 עד 10 ימים בתרבות עם GM-CSF לבד 5,6, GM-CSF ו- IL-4 7, או GM-CSF ו FLT3 ליגנד 8,9 ליצור BMDCs יותר מקרוב דומת DCs הדלקתית (גבוה CD11c, MHCII גבוהה CD11b +) 10. בעוד תרבויות חוץ גופית אלה משמשים ליצירת מקרופאגים אוDCS, לא ברור אם כל תרבות מולידה אוכלוסיות טהורות. לדוגמא, אם כי תאים חסידים בתרבויות-CSF GM מתוארים להיות מקרופאגים 5, התאים לא חסידים מאותה התרבות משמשים DCs 6,11-13, עם ההנחה כי הם הומוגנית וכל השתנות שנצפתה היא עקב שלבי ההתפתחות השונים 14,15. יתר על כן, מחקרים מצאו GM-CSF כדי להוות גורם צמיחה חיוני להתפתחות מקרופאג המכתשית in vivo 16,17, וניתן להשתמש במבחנה כדי לייצר מקרופאגים מכתשיים דמוי 16,17,18.

מלבד דבקות, הנהלים להפקה מאקרופאגים DCs ממח עצם מטופלים-CSF GM תרבויות דומים מאוד המצביע על ההטרוגניות יכול להתקיים בתוך תרבויות מח עצם GM-CSF. זה אכן נראה את המקרה כפי שני מסמכים לדווח על נוכחות של BMDMs בשבריר לא חסיד של תרבויות BMDC. במאמר אחד, הם identified אוכלוסייה של תאים כמו CD11c +, CD11b +, באמצע MHCII, MerTK +, ו CD115 +, אשר הביע חתימה ביטוי גנים שדמה יותר מכול מקרופאגים מכתשיים והיה לו יכולת מופחתת להפעיל תאי T 19. המאמר השני בשימוש MHCII ו FL-HA לזהות אוכלוסייה המכתשית מקרופאג דמוי (+ CD11c, MHCII אמצע / נמוך, FL-HA גבוהה) כי היה נבדל לא מפותחים (+ CD11c, MHCII באמצע, FL-HA נמוך) ובוגרת DCS (CD11c +, MHCII גבוהה), הן phenotypically והן מבחינה תפקודית 18. שני העיתונים הללו ממחישים כי GM-CSF תרבויות BMDC הן הטרוגניים, המכילים את שני מקרופאג ואוכלוסיות DC המציין טיפול שיש לנקוט כאשר לפרש נתונים מתרבויות BMDC.

פרוטוקול זה מתאר כיצד לבודד מח עצם, תאי מח עצם התרבות GM-CSF, ולזהות את מכתשי מקרופאג דמויהאוכלוסייה מן DCs בשלה ובוגרת בתרבות מח העצם על ידי cytometry זרימה באמצעות FL-HA מחייב וביטוי MHCII. הליך זה מבוסס על הליך הוקמה של לוץ ואח 6 והוא מסוגל לייצר 5 -. 10 x 10 6 תאים לא חסיד ביום 7 של תרבות 10 מ"ל. התרבות היא שמיש מימים 7 עד 10 ומניבת אוכלוסייה הטרוגנית של מקרופאגים, DCS בשלה ובוגרת, כמו גם אבות חלקים ביום 7. זה מספק שיטה פשוטה לגדול ולבודד במבחנה המכתשית דמוי מקרופאגים בכמויות גדולות.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

עכברים היו מורדמים בהתאם המועצה הקנדית על הנחיות טיפול בבעלי חיים למחקר בעלי חיים אתיים על ידי נהלים שאושרו על ידי אוניברסיטת ועדת טיפול בבעלי חיים קולומביה הבריטית.

1. רכישת השעית מח עצם תא בודד עכבר עצם הירך לבין השוקה

  1. הפעל ארון בטיחות ביולוגית (BSC) 15 דקות לפני תחילת ההליך לטהר אוויר ארון ולאפשר ייצוב זרימת אוויר, אז משטח BSC נקיים / הספרים עם אתנול 70%. הקפד שהטקסט יהיה סטרילי ככל האפשר עבור מכלול של הפרוטוקול. אין לחתוך את העצמות בתנאים לא סטריליים.
  2. הכינו כלי לנתיחה על ידי השריית באתנול 70% (1 זוג מספריים לנתיחה, 2 זוגות מלקחיים), תמיסת מלח מאוזן של האנק עם 5% נסיוב עגל עוברית (HBSS-FCS), צלחות פטרי סטרילי (100 מ"מ x 15 מ"מ), 1 מזרקים מ"ל, 26½ מחטים מד, צינורות אוסף חרוטי (15 מ"ל או 50 מ"ל), ומגבות נייר של BSC.
  3. להרדים את העכבר באמצעותפרוטוקולים שאושרו על ידי ועדת האתיקה במחקר בבעלי החיים של המוסד. תביא לתוך BSC, למקם על גבי מגבות נייר אחד או שתיים ולרסס את העכבר עם אתנול 70%.
  4. ב BSC, לפתוח בסביבה נקייה מחיידקים צלחת סטרילי פטרי, aliquot 10 מ"ל של HBSS-FCS לבסיס 1 - 2 מ"ל אל המכסה.
  5. מניחים את העכבר על הבטן שלה עם הגב כלפי מעלה להרים את העור סביב הסעיפים החזה עם האצבעות של היד הלא דומיננטית. השתמש במספריים לעשות חתך שבו העור יוסר.
  6. יחזיק בשני הקצוות של החתך, קצה אחד עם כל יד ובזהירות לפרק את העור סביב העכבר מהגב אל הבטן, להמשיך למשוך אותו עד שני קצוות נפגשים החתך ב בבטן.
  7. הפוך את העכבר על בטן פונה כלפי מעלה, ועם יד אחת למשוך את החצי התחתון של העור כלפי מטה לכיוון הרגל, לשמור שהפיל את העור עד שהרגליים נחשפות.
  8. החזיקו את כף הרגל של העכבר למעלה וחתך את גידי אכילס מעל מפרק הקרסולרצועות חיבור שרירי רגל בקצה התחתון של עצם השוק עם מספריים. זה מרפה את הרגל מעצמות הרגל.
  9. בעוד מחזיק את הרגל על ​​ידי כף הרגל, לחתוך את השרירים והרצועות במספריים בכל רחבי מפרק הברך בקצה התחתון של עצם הירך לנתק את שרירי הירך מן הרגל התחתונה. שימוש במלקחיים כדי למשוך התירו שרירים בעדינות הרחק שׁוֹקִיתִי ומשטחי ירך. יש להיזהר שלא לנתק את עורק הירך כדי למנוע דימום כבד.
  10. ביד אחת נאחזה ברגל, לחץ כלפי מטה מספריים פתוחים בקצה העליון של עצם הירך במפרק הירך, לסובב את הרגל ומשוכים בעדינות כדי להפריד את הירך מן מפרק הירך תוך שימוש במספריים עוברים את הסינון הסופי חינם הרגל מהגוף.
  11. מנקודה זו ואילך, רק להחזיק את הרקמה עם מלקחיים סטרילית. תחזיק את הרגל בקצה אחד לשלוף את הרגל על ​​אחרים.
    הערה: זה לא צריך לדרוש כוח רב, כפי רצועות חיבור נחתכות בשלב1.9. לחלופין, לחתוך את השוקה בדיוק מעל הקרסול שם העצם הוא התמזג.
  12. החזק את הרגל עד סוף דיסטלי של עצם הירך עם קבוצה אחת של מלקחי סוף הפרוקסימלי של הטיביה שוקית עם אחר, בזהירות לכופף, ועצמות השוק בכיוון ההפוך של מפרק הברך על מנת להפריד אותם מן הירך פיקת הברך.
  13. שימוש במלקחיים כדי לנתץ את הרצועות והשרירים הנותרים עדיין מחוברת עצמות הרגל התחתונה. הנה, להסיר את השוקית יחד עם רקמות החיבור עם מלקחיים כפי שהוא קטן מדי כדי להיות סמוק עבור תאים במח עצם. מניח את השוקה ניקתה על מכסת צלחת פטרי ההפוכה.
  14. החזק את הקצה התחתון של עצם הירך עם קבוצה אחת של מלקחיים פיקת הברך עם אחר, לכופף את פיקת הברך ואת הרקמות הסובבות בכיוון ההפוך של המפרק להסרה. לאחר מכן לנקות את הנותרים רקמות החיבור של הירך; משייך אותם עם מלקחיים, ומניח אותו על מכסת צלחת פטרי ההפוכה. מחק את פיקת הברך.
  15. חזור על 1.7- 1.13 עם הרגל השנייה במידת הצורך. מעבירים את העצמות עד 1.6 מ"ל צינורות microcentrifuge המכילה 1 מ"ל HBSS-FCS סטרילי לתחבורה במידת הצורך.
  16. מניחים את העצמות על מכסה צלחת הפוכה פטרי, עם 1 - 2 מ"ל של HBSS-FCS, להשתמש במלקחיים כדי לנקות רקמות שיורית עדיין מחוברת הטיביה הירך, ולאחר מכן להעביר את עצמות לבסיס של צלחת פטרי המכילה 10 מ"ל של HBSS- FCS. לחלופין, לנקות את העצמות ולהסיר המצורפת רקמות שרירות באמצעות נייר רטוב אתנול 70%.
  17. חותכים כל העצמות בחצי במספריים. חלקית להגן על צלחת פטרי עם מכסה סטרילי תוך צמצום כדי להבטיח את העצמות להישאר בצלחת. לחלופין, לחתוך את הקצה של כל עצם לאפשר שטיפה בשלב הבא.
  18. צרף 26½ המחט G אל מזרק 1 מ"ל, ותנסחו 1 מ"ל HBSS-FCS מצלחת פטרי. הכנס את קצה המחט לתוך סוף פיסת עצם לשטוף את תאי מח עצם (רקמה אדומה רכה בתוך העצמות). הכנס את המחט לתוך הראששל העצם ואת הקצה הפתוח, עד שכל המח בצבע האדום מוסר. שים את העצמות כמו בצבע לבן.
  19. להעביר כל גושים גלויים של מח עצם באמצעות המזרק כמה פעמים כדי ליצור השעית תא בודדת.
  20. מחק את העצמות הסמוקות. השתמש פיפטה 10 מ"ל לערבב את ההשעיה תא היטב ולהעביר אל צינור איסוף. יש לשטוף את צלחת פטרי פעם אחת עם 5 מ"ל של HBSS-FCS לאיסוף תאים שיורית בצלחת. מניחים את התאים על הקרח.
    הערה: מח עצם השעית התא עדיין קיימא אם מאוחסן במשך 2 - 3 שעות ב 4 ° C.

ציפוי 2. Culturing של תאים במח העצם (BMCs)

  1. כן ריאגנטים והאספקה ​​הבאים.
    1. כן תאי דם אדום (RBC) חיץ תמוגה על ידי ביצוע אמוניום כלוריד 0.84% ​​בתמיסה סופית של 2 מ"מ טריס pH 7.2, ואז לעקר ידי סינון דרך מסנן 0.2 מיקרון.
    2. כן תקשורת BMC על ידי הוספת 10% FCS, 20 HEPES מ"מ, חומצת אמינו חיוניות 1x, 55 & #181; M 2-mercaptoethanol, 50 U / ml פניצילין סטרפטומיצין, 1 מ"מ פירובט נתרן, ו -2 מ"מ L- גלוטמין עד בינוני RPMI 1640.
    3. השג זמין מסחרי רקומביננטי GM-CSF או להשתמש GM-CSF המכיל supernatant מן AG8.653 תאי מיאלומה טרנספקציה עם גן GM-CSF 20. קבע את הריכוז של GM-CSF ב supernatant ידי ELISA ומוסיפים את המקבילה של 20 ng / ml לתקשורת BMC.
  2. ספין למטה התאים במח העצם 314 XG במשך 5 דקות. הגלולה היא אדומה, בשל RBCs. ב BSC, לשאוב supernatant באמצעות פיפטה פסטר זכוכית סטרילית מצורף ואקום יניקה, לשחרר את הכדור על ידי הקשה, ולאחר מכן להוסיף 10 מ"ל של חיץ תמוגה RBC. וורטקס כדי resuspend את התאים דגירה במאגר תמוגה RBC בטמפרטורת החדר למשך 5 דקות.
  3. הוסף 10 מ"ל של HBSS-FCS ואז ספין התאים ב 314 XG במשך 5 דקות ו לשאוב supernatant. שים את התא גלולה כמו צבע לבן. Resuspend תאים בנפח הרצוי של התקשורת BMC.
  4. ספירת resuspended-תאים באמצעות hemocytometer לאחר מכתים תאים מתים עם trypan כחול 0.4%.
    הערה: אם מח עצם מאחד הרגל (יחיד הטיביה הירך) משמש, resuspend ב 5 מ"ל של התקשורת BMC, לקחת 10 μl של השעיה התא לדלל אותו עם 70 μl של 0.4% trypan כחול, ומערבבים היטב ולהעביר 10 μl של דילול תא 1/8 לתא hemocytometer. ספירת תאי קיימא ארבעה רביעים: הממוצע של ארבע הספירה ברבע x גורם לדילול x 10 4 = מספר תאים לכל מיליליטר. עצם הירך לבין השוקה מרגל אחת תניב בדרך כלל כ 2 - 4 x 10 7 תאים לאחר תמוגה RBC.
  5. להעריך את המספר 10 מ"ל מנות של תרבויות מח עצם דרושי ניסויים המשך המבוססים על מספר התאים הכוללים דרוש לניסויים בסוף התרבות.
    הערה: כל מנה דורשת 2 x 10 6 תאים במח עצם על זריעה ראשונית ותשואות 5 - 10 x 10 6 תאים ביום 7.
    1. עליquot את המספר הכולל של תאים עבור ציפוי לתוך צינור חדש, ספין למטה ב 314 XG במשך 5 דקות, לשאוב supernatant, ו resuspend התאים ב 4 x 10 מ"ל 6 תאים / מדיה BMC.
  6. הכינו צלחת 100 מ"מ x 15 מ"מ פטרי סטרילית חדשה עם 9.5 מ"ל של התקשורת BMC המכיל 200 ng של GM-CSF (רקומביננטי או מ- GM-CSF המכיל supernatant). הוסף 500 μl של 4 x 10 6 תאים / תאים במח העצם מ"ל למרכז של צלחת פטרי עבור ריכוז סופי של 2 x 10 מ"ל 5 תאים / 10 מ"ל.
    הערה: חשוב להשתמש בצלחת פטרי סטרילית לא צלחת בתרבית רקמה. כמו כן, בעת הוספת התאים, להבטיח תאים נשארים מתרכזות במרכז ולמזער הפרעה את הכלים אחרי הזריעה ובמהלך שינויי תקשורת. דגירת תאים ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2. זהו יום 0 בתרבות.
  7. ביום 3, להוסיף 10 מיליליטר של תקשורת הטריה BMC המכילה 200 ng של GM-CSF על כל מנה של תאי. תשמור על עצמך כדי למזער הפרעת of התאים המרוכזים השעיה. הנפח הכולל של תרבית תאים הוא כעת 20 מ"ל.
  8. שימו לב התאים תחת מיקרוסקופ אור בהגדלה 100X. שים לב רבים שאינם חסידים תאים (עגולה) וכמה תאים חסידים (שטוחים). תאים בקבוצות של שלושה או ארבעה עלי כותרת הדומה של פרח ניתן לראות, המציין שגשוג.
  9. ביום 6 לבצע שינוי תקשורת וחצי. מוציאים בזהירות 10 מ"ל של מדיה לתוך צינור חרוטי 50 מ"ל סטרילי, ספין למטה ב 314 XG במשך 5 דקות, לשאוב וזורקים supernatant.
  10. Resuspend התא גלולה ב 10 מ"ל של התקשורת טריים BMC המכיל 20 ng / ml של GM-CSF, מערבולת בעדינות ומוסיפים לתבשיל תרבית תאים המקורי בנפח כולל של 20 מ"ל. שימו לב התאים תחת המיקרוסקופ.
    הערה: תרבות יום 7 צריכה להיות ב 70% או יותר confluency עם תאים שטוחים חסיד ועננים צפופים של תאים עגולים לא חסידים.

3. איסוף הכנת BMDC ו BMDMs עבור cytometry זרימה

  1. שמור את כל המאגרים ב 4 מעלות צלזיוס.
  2. קציר תאים מהיום 7 עד היום 10. כדי לקצור את התאים, ההעברה ראשונה 10 מיליליטר של supernatant תרבות צינור איסוף 50 מיליליטר חרוטים, ואז להטות את המנה אנכית בכ -30 מעלות לשטוף את המנה על ידי pipetting 10 מ"ל הנותרים תרבות מהחלק העליון של המנה. חזור על זה לשטוף 5 פעמים, בכל פעם סיבוב הצלחת על ידי שליש.
  3. מעביר את 10 מ"ל שאריות תאים לאותו צינור האיסוף וזורק את הצלחת תאים חסידים.
    הערה: השטיפות תסרנה תאים שאינם חסידים חסיד רופף; את התאים החסידים השטוחים עמידים הכביסות. בדרך כלל, בין 5 - 10 x 10 6 תאים לא חסידים צפויים מצלחת אחד בכל יום 7 ו 2 - 5 x 10 6 תאים ביום 10, אם כי לוץ et al. דיווח 10 x 10 6 תאים ביום 10. התאים החסידים לא נלקחים בדרך כלל. עם זאת, אם תאים אלה צריכים להיות לעומת התאים שאינם החסידים, ניתן להסיר הם כדלקמן. הוסף 5 מ"ל של 0.7 mM EDTA ב 1x PBS, pH 7.4 כדי בצלחת לאחר שהתאים לא חסיד יוסרו, לדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות, פיפטה למעלה ולמטה כדי להסיר את התאים חסיד ולאסוף בצינור נפרד.
  4. ספין למטה התאים שנאספו 314 XG במשך 5 דקות ו לשאוב supernatant. Resuspend ב 5 מ"ל מדיה סטרילי BMC ב 4 ° C, מערבולת בעדינות לתערובת, לספור באמצעות כחול hemocytometer trypan.
    הערה: כל מנה תניב 5 - 10 x 10 6 לא חסידי תאים מתרבים יום 7. מעתה ואילך, לבצע את כל השלבים על 4 מעלות צלזיוס.
  5. עבור ניתוח תזרים cytometric, העברה 2 x 10 5 תאים עבור כל דגימה לתוך 5 מיליליטר צינורות קלקר עגול תחתונים, להוסיף 300 μl של חיץ FACS על 4 מעלות צלזיוס (שנאגר פוספט 1x המלוח, 2 EDTA מ"מ ו 2% אלבומין בסרום שור) לכל לִטעוֹם.
  6. ספין תאים למטה 314 XG במשך 5 דקות ו לשאוב supernatant. שים לב גלולה לבנה, אטום גלויה בביתהחלק התחתון של הצינור.
  7. תאים Resuspend ב 100 μl של Ab קולטן Fc ללא תווית לחסום קולטני Fc מחייב (supernatant השתמש 1/10 מ 2.4G2 לייצר קו תא מיאלומה) דגירה במשך 20 דקות ב 4 ° C. לאחר מכן להוסיף 300 μl של חיץ FACS לטעום כל, מערבולת בעדינות, ואז ספין למטה התאים ב 314 XG במשך 5 דקות ו לשאוב supernatant.
  8. תאים Resuspend ב 100 μl של CD11c-PeCy7 על 0.2 מיקרוגרם / מ"ל, כחול Gr1 פסיפיק ברמה של 0.25 מיקרוגרם / מ"ל, MHCII-APC ב 0.05 מיקרוגרם / מ"ל, ו FL-HA בכ 2 מיקרוגרם / מ"ל ​​לזהות מקרופאגים DCs.
    הערה: FL-HA הוכן בבית באמצעות והעמסה ומלח נתרן חומצה היאלורונית תרנגול מסרק כפי שתוארה לעיל 21.
  9. דגירה במשך 20 דקות ב 4 ° C כדי לאפשר מחייב את פני התא. הוספת 300 μl של חיץ FACS לטעום כל, מערבולת בעדינות, ואז ספין למטה התאים ב 314 XG במשך 5 דקות ב 4 ° C ו לשאוב supernatant הערה:. אם ביונוגדנים tinylated משמשים 3.8, לחזור 3.8 - 9 עם-streptavidin ניאון.
  10. שטפו תאים עם עוד 300 μl של חיץ FACS, מערבולת בעדינות לתערובת ספין למטה התאים ב 314 XG במשך 5 דקות. לשאוב supernatant ו resuspend התאים 200 μl של חיץ FACS המכיל 0.1 - 0.2 מיקרוגרם לכל מ"ל של יודיד propidium או DAPI לתייג תאים nonviable. תאים מוכנים כעת תזרים cytometric ניתוח 22.
    הערה: ראה תוצאות ואיור 3 לפרטים של האוכלוסיות וכיצד התאים היו מגודרים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

תרשים זרימה המסכם את השלבים העיקריים של שיטה זו מוצגת באיור 1. הצפיפות והמורפולוגיה של תרבות מח עצם בזמנים שונים של התרבות מוצגות באיור 2. באותו יום 1, התאים הם קטנים ודלילים אבל ביום 3, יש יותר תאים, וחלקם גדולים יותר ועוד כמה החלו לדבוק. במשך היום 6 קיימים חסיד מובהק שברים שאינם חסידים (איור 2 א). התרבות ניתן לקצור מהיום 7 - 10 עם אחוז גבוה יותר של CD11c + תאים נוכחים ביום 10. ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

בכתב היד הזה, אנו מספקים שיטה להפקת מקרופאגים GM-CSF נגזר DCs מתרבה מח עצם עכבר אחת כי הוא עיבוד לוץ et al. 6. ביטוי MHCII ו FL-HA מחייב מבחינה בין DCs בשלה מקרופאגים בתרבות זו (ראו איור 3 ג), אשר בעבר כבר קשה. זה, יחד עם דו"ח נוסף על ידי Helft et al. 19, הדגים הטרוגניות בתוך תרבויות BMDC מושרה GM-CSF שהיו בעבר חשבו להיות DCs בלבד. Helft et al. 19 השתמש תנאי תרבות שונים לגמרי כדי ליצור BMDCs אך גם מצ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

למחברים אין ניגודי אינטרסים כספיים.

תודות

עבודה זו מומנה על ידי המכון הקנדי לבריאות מחקר (CIHR) (גרנט MOP-119,503) ואת למדעי הטבע וההנדסה המועצה של קנדה (NSERC). NSERC גם נתמך studentships הקיץ י"ד ו- AA י"ד נתמך על ידי אוניברסיטת קולומביה הבריטית (UBC) עם פרס המילגה 4 שנים, AA נתמך על ידי CIHR עם פרס שני סטודנט לתואר שני (CGS-M). אנו מודים קלווין Roskelley לסיוע עם מיקרוסקופ השתמשו כדי ליצור את התמונות באיור 2. כמו כן, אנו מכירים תמיכה מן מתחם Cytometry Animal ושפל UBC.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
ציטומטר זרימהBD LSR-II
מיקרוסקופ הפוך אוטומטי לייקה DMI4000 B
צנטריפוגה Thermo FisherST-40R
NuaireNU-425-600
מזרק 1 מ"לBD309659
26 1/2 מחטBD305111
50 מ"ל צינור חרוטי קורנינג357070של המותג פלקון
(1.5 מ"ל)קורנינגMCT-150-C
5 מ"ל פוליסטירן עם תחתית עגולהקורנינג352052
כלי דיסקציהכלי מדע עדין *שונות *מספריים לדיסקציה, מלקחיים דומונט ומלקחיים סטנדרטיים 
המוציטומטר Reichert1490
סטרילי 100 מ"מ x 15 מ"מפטרי צלחת קורנינג351029*פלקון מותג
2-MercaptoethanolThermo Fisher21985-023
אמוניום כלורידBDHBDH0208-500G
סרום בקר אלבומיןפישר BioreagentsBP1600-1
Brefeldin ASigmaB7651-5MG
EDTASigmaE5134-1KGEthylenediaminetetraacetic חומצה
עוברית סרום בקרתרמו פישר16000-044
תמיסת מלח מאוזנת של האנקתרמו פישר14175-095 
HEPESThermo Fisher15630-0804-(2-הידרוקסיאתיל)-1-piperazineethanesulfonic חומצה
L-גלוטמיןSigmaG8540-100G
LPS UltrapureInvivogentlrl-3pelps
MEM תמיסת חומצות אמינו לא חיוניות תרמו פישר11140-050
פניצילין/סטרפטומיצין 100xתרמו פישר15140-122
אשלגן פוספט מונו-בסיסיBDHBDH0268-500 גרם
אשלגן כלוריBDHBDH9258-500 גרם
רקומביננטי GM-CSFPeprotech315-03-A
מסרק תרנגול נתרן היאלורונאט סיגמאH5388-1G*משמש לייצור היאלורונן פלואורסצין
RPMI-1640 תרמו פישר21870-076ללא נתרן פירובט ללא גלוטמין. מדיה חמה ל-37  ° C לפני השימוש.
סודיום כלורידפישר 5271-10   
נתרן פוספט דו-בסיסיסיגמא50876-1 ק"ג
נתרן פירובטסיגמאP5290-100G
טריס (הידרוקסימתיל) אמינומתאןפישר ביוריאגנטיםBP152-5
טריפן כחולסיגמאT8154
קולטן אנטי-FC (ללא תווית), תרבית רקמות סופרנטנטN/AN/Aשיבוט: 2.4G2
Anti-CD11c PeCy7eBioscience25-0114-82שיבוט: N418
Anti-Gr-1 efluor450eBioscience48-5931-82שיבוט: RB6-8C5
Anti-MHCII APCeBioscience17-5321-82שיבוט: M5/114.15.2
Biotinylated Anti-MerTKAbcamBAF591עז פוליקלונלי IgG
Streptavidin PEeBioscience12-4317-87
Propidium IodideSigmaP4170-25MG
DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole)SigmaD9542-5MG
ארון בטיחות ביולוגית *שפופרות אפנדורף

מקורות

  1. Fleetwood, A. J., Lawrence, T., Hamilton, J. A., Cook, A. D. Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (CSF) and macrophage CSF-dependent macrophage phenotypes display differences in cytokine profiles and transcription factor activities: implications for CSF blockade in inflammation. J Immunol. 178 (8), 5245-5252 (2007).
  2. Lari, R., et al. Macrophage lineage phenotypes and osteoclastogenesis--complexity in the control by GM-CSF and. Bone. 40 (2), 323-336 (2007).
  3. Brasel, K., De Smedt, T., Smith, J. L., Maliszewski, C. R. Generation of murine dendritic cells from flt3-ligand-supplemented bone marrow cultures. Blood. 96 (9), 3029-3039 (2000).
  4. Angelov, G. S., Tomkowiak, M., Marcais, A., Leverrier, Y., Marvel, J. Flt3 ligand-generated murine plasmacytoid and conventional dendritic cells differ in their capacity to prime naive CD8 T cells and to generate memory cells in vivo. J Immunol. 175 (1), 189-195 (2005).
  5. Inaba, K., et al. Generation of large numbers of dendritic cells from mouse bone marrow cultures supplemented with granulocyte/macrophage colony-stimulating factor. J Exp Med. 176 (6), 1693-1702 (1992).
  6. Lutz, M. B., et al. An advanced culture method for generating large quantities of highly pure dendritic cells from mouse bone marrow. J Immunol Methods. 223 (1), 77-92 (1999).
  7. Labeur, M. S., et al. Generation of tumor immunity by bone marrow-derived dendritic cells correlates with dendritic cell maturation stage. J Immunol. 162 (1), 168-175 (1999).
  8. Berthier, R., Martinon-Ego, C., Laharie, A. M., Marche, P. N. A two-step culture method starting with early growth factors permits enhanced production of functional dendritic cells from murine splenocytes. J Immunol Methods. 239 (1-2), 95-107 (2000).
  9. Brasel, K., et al. Flt3 ligand synergizes with granulocyte-macrophage colony-stimulating factor or granulocyte colony-stimulating factor to mobilize hematopoietic progenitor cells into the peripheral blood of mice. Blood. 90 (9), 3781-3788 (1997).
  10. Segura, E., Amigorena, S. Inflammatory dendritic cells in mice and humans. Trends Immunol. 34 (9), 440-445 (2013).
  11. West, M. A., et al. Enhanced dendritic cell antigen capture via toll-like receptor-induced actin remodeling. Science. 305 (5687), 1153-1157 (2004).
  12. Veldhoen, M., Hocking, R. J., Atkins, C. J., Locksley, R. M., Stockinger, B. TGFbeta in the context of an inflammatory cytokine milieu supports de novo differentiation of IL-17-producing T cells. Immunity. 24 (2), 179-189 (2006).
  13. Goodridge, H. S., et al. Activation of the innate immune receptor Dectin-1 upon formation of a 'phagocytic synapse. Nature. 472 (7344), 471-475 (2011).
  14. Shalek, A. K., et al. Single-cell RNA-seq reveals dynamic paracrine control of cellular variation. Nature. 510 (7505), 363-369 (2014).
  15. Vander Lugt, B., et al. Transcriptional programming of dendritic cells for enhanced MHC class II antigen presentation. Nat Immunol. 15 (2), 161-167 (2014).
  16. Shibata, Y., et al. GM-CSF regulates alveolar macrophage differentiation and innate immunity in the lung through PU.1. Immunity. 15 (4), 557-567 (2001).
  17. Lacey, D. C., et al. Defining GM-CSF- and Macrophage-CSF Dependent Macrophage Responses by In Vitro Models. J Immunol. 188 (11), 5752-5765 (2012).
  18. Poon, G. F., et al. Hyaluronan Binding Identifies a Functionally Distinct Alveolar Macrophage-like Population in Bone Marrow-Derived Dendritic Cell Cultures. J Immunol. 195 (2), 632-642 (2015).
  19. Helft, J., et al. GM-CSF Mouse Bone Marrow Cultures Comprise a Heterogeneous Population of CD11c(+)MHCII(+) Macrophages and Dendritic Cells. Immunity. 42 (6), 1197-1211 (2015).
  20. Stockinger, B., Zal, T., Zal, A., Gray, D. B. cells solicit their own help from T cells. J. Exp. Med. 183 (3), 891-899 (1996).
  21. de Belder, A. N., Wik, K. O. Preparation and properties of fluorescein-labelled hyaluronate. Carbohydr Res. 44 (2), 251-257 (1975).
  22. Stewart, C. C., Stewart, S. J. Immunophenotyping. Current Protocols in Cytometry. , Wiley, J., & Sons, Inc. Champter 6, Unit 6.2 (2001).
  23. Dearman, R. J., Cumberbatch, M., Maxwell, G., Basketter, D. A., Kimber, I. Toll-like receptor ligand activation of murine bone marrow-derived dendritic cells. Immunology. 126 (4), 475-484 (2009).
  24. Abdi, K., Singh, N. J., Matzinger, P. Lipopolysaccharide-Activated Dendritic Cells: 'Exhausted' or Alert and Waiting. J Immunol. 188 (12), 5981-5989 (2012).
  25. Contreras, I., et al. Impact of Leishmania mexicana Infection on Dendritic Cell Signaling and Functions. PLoS Negl Trop Dis. 8 (9), (2014).
  26. Feng, T., Cong, Y. Z., Qin, H. W., Benveniste, E. N., Elson, C. O. Generation of Mucosal Dendritic Cells from Bone Marrow Reveals a Critical Role of Retinoic Acid. J Immunol. 185 (10), 5915-5925 (2010).
  27. Grauer, O., et al. Analysis of maturation states of rat bone marrow-derived dendritic cells using an improved culture technique. Histochem Cell Biol. 117 (4), 351-362 (2002).
  28. Suzuki, T., et al. Pulmonary macrophage transplantation therapy. Nature. 514 (7523), 450-454 (2014).
  29. Happle, C., et al. Pulmonary transplantation of macrophage progenitors as effective and long-lasting therapy for hereditary pulmonary alveolar proteinosis. Sci Transl Med. 6 (250), (2014).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

GM CSFMHCIIFL HACD11c

מאמרים קשורים