אנו מתארים שיטה ליצירת מודל חייתי של פיברוזיס בכבד בחולדה, ומעריכים את מידת הפיברוזיס על ידי בדיקה היסטולוגית של הכבד. המודל יכול לשמש לחקר התפתחות מחלות כבד וכן לבדיקת יעילותם של חומרים אנטי-פיברוטיים פוטנציאליים.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
במאמר זה
סיכום
תקציר
ארבעה עד שישה בן שבוע, חולדות Wistar זכר שימשו להפקת במודלים של בעלי חיים של פיברוזיס בכבד. התהליך דורש ארבעה שבועות של הממשל של 10 מ"ג / ק"ג dimethylnitrosamine (DMN), נתון intraperitoneally במשך שלושה ימים רצופים בשבוע. זריקות Intraperitoneal בוצעו במנדף כמו DMN הוא hepatoxin ו מסרטן ידוע. יש מודל מספר יתרונות. ראשית, שינויים כבדים ניתן ללמוד ברצף או בשלבים מסוימים של עניין. שנית, בשלב של מחלה כבדה יכול להיות במעקב על ידי מדידה של aminotransferase אלאנין בסרום (ALT) ו aminotransferase aspartate (AST) אנזימים. שלישית, את חומרת הניזק כבד בשלבים שונים יכולה להיות מאושרת על ידי הקרבת חיות בנקודות זמן מיועד, ואחריו בדיקה היסטולוגית של הרקמות הכבדות המוכתמות היונק של מייסון. לאחר ארבעה שבועות של מינון DMN, תוצאת סיסטיק הטיפוסית היא 5 עד 6 בסולם אסחאק. המודל יכול להיות מועתק באופן עקבי כברבשימוש נרחב כדי להעריך את היעילות של תרופות אנטי-fibrotic פוטנציאליים.
מבוא
DMN הוא רעלן ספציפי בכבד חזק. חילוף החומרים, רקמות תפוצתו, והיכולת לגרום לפגיעה כבדה חולדות נמסרו על ידי מגי 1, ואת המכניזם הקשור לניזק hepatocyte מוות של תאים על ידי אפופטוזיס תואר על ידי פריצ'רד ובאטלר 2. ממשל לסירוגין של המתחם הזה נמסר לגרום פיברוזיס כבד כלבים וחולדות 3,4.
המנגנונים ושינויים מורפולוגיים של הפיברוזיס נחקרו בהרחבה באמצעות מודל זה. במחקרים מוקדם באמצעות עכברוש, 3 שבועות טיפול עם DMN מיוצר נמק המורגי centrilobular ואחריו שחמת micronodular ללא steatosis 5. זה היה הראה כי ב סיסטיק מוקדם, קולגן נוצר ....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
כל הניסויים בבעלי החיים אושרו על ידי הוועדה לטיפול ולשימוש חיה של בית הספר למדע שימושי, Temasek הפוליטכני.
1. הכנת DMN
- פיפטה 200 μl של DMN (1 גר '/ מ"ל פתרון המניות) ולהוסיף 19.8 מ"ל של PBS להכין פתרון DMN 10 מ"ג / מ"ל עבור הזריקה.
הערה: DMN הוא מסרטנים. השתמש במנדף להכין את DMN ולבצע זריקות חיה.
2. הזרקת Intraperitoneal של DMN
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
חולדות DMN מטופלים לרדת במשקל ולהיות פחות נמרץ עם מעייל שיער פרוע. יש אובדן משמעותי משקולות הגוף הממוצע של חולדות שטופלו DMN; הראשון לזיהוי לאחר 2 שבועות של טיפול DMN, וההבדל הזה נשאר דרך שבועות 3 ו -4 לאחר טיפול DMN (איור 1 א). כמו החולדות לקבל DMN בשבועות רצופים, פגיעה בכבד וגורמת לו להיות קטן יותר. המדד הכבד; המהווה את אחוז ממשקל כבד במשקל הגוף הסופי היה נמוך משמעותית עבור החולדות שטופלו DMN (איור 1b).
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
תיארנו שיטה לעשות במודל חיה של פיברוזיס בכבד ועל מנת להעריך את חומרת הפיברוזיס. חשוב לספק את המינון הנכון של DMN ו לדבוק בלוח הזמנים של זריקות intraperitoneal שבועיות. ככל שהניסוי מתקדם, חשוב לשקול את החולדות מחדש לחשב את המינון בתחילת כל שבוע של זריקות DMN. זכור כי DMN הוא רעילים צריך להיות מטופלים בקבינט הקטר. אנו מבצעים את זריקות intraperitoneal בקבינט הקטר גם כן. עם הצורך זריקות חוזרות ונשנות, איפוק הנכון והטכניקה של הזרקת חשוב להימנע כניסתה של מזהמים ונזק לאיברים פנימיים. יש .......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
החוקרים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.
תודות
המחברים מודים על תמיכת המימון ממשרד החינוך, סינגפור, מענק מספר MOE2010-IF-1-025.
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| Dimethylnitrosamine | Wako | 147-03781 | |
| פורמלין | סינופארם כימיקלים | F63257009 | |
| אתנול | סיגמא | 64-17-5 | |
| קסילן | פישר | 1330-20-7 | |
| כתמי | |||
| מדעי מיקרוסקופיה | אלקטרונית כחולה אנילין | #42755 | |
| מדעי מיקרוסקופיית אלקטרונים | חומצה פושין | RT42685 | |
| מיקרוסקופיית אלקטרונים | אדומים ארגמן | #26905 | |
| חומצה פוספוטונגסטית הידרט | ALFA AESAR | ALFA40116.4 | |
| חומצה פוספומוליבדית הידרט | סיגמא SG | 221856-25G | |
| המטוקסילין ברזל של וייגרט | Merck | 1.15973.0002 | |
| DPX הרכבה בינונית | Merck | HX066873 | |
| מעבד רקמות | Leica | Leica TP 1020 | |
| מכונת הטבעה | Sakura | Sakura Tissue Tek TEC5 מערכת | |
| Microtome | Leica Leica | RM 2235 | |
| מנתח בדיקות וטרינר | Idexx | Vet Test 8008 |
מקורות
- Magee, P. N. Toxic liver injury; the metabolism of dimethylnitrosamine. Biochem J. 64 (4), 676-682 (1956).
- Pritchard, D. J., Butler, W. H. Apoptosis-the mechanism of cell death in dimethylnitrosamine-induced hepatotoxicity. J Pathol. 158 (3), 253-260 (....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
