החלת העברת אנרגית תהודת קרינה (סריג) לבחינת יעילות טרנסלוקציה מפעיל ידי Burnetii Coxiella במהלך siRNA השתקה

Burnetii Coxiella הוא פתוגן תאי ייחודי שגורם קדחת Q הידבקות בני אדם zoonotic. מחלה זו קשורה עם קשת רחבה של מצגות קליניות המשתרעות seroconversion אסימפטומטית לזיהום כרוני מסכנות החיים שבאו לידי לעתים קרובות ככל שנים אנדוקרדיטיס לאחר חשיפת ^1. הדבקת בני אדם מתרחשת בעיקר באמצעות השאיפה של אירוסולים מזוהמים מעלי גירת המאגר העיקרי לזיהום, בפרט, פרות חולבות, כבשים ועזים. למרות זיהום Coxiella אצל בעלי חיים אלה הוא בדרך כלל תת-קליני, הזיהום עלול לגרום להפלה ואת עומס החיידקים ניכר בתוך נוזל שלית הלידה יכול לזהם בסביבה המקומית ^1. דוגמה של זיהום כגון עומס עצום יכול להיות משני בריאות הציבור ועל ענף החקלאות נצפתה לאחרונה פרוץ קדחת Q שאירעו בהולנד ^2. בין 2007 ו2010 למעלה מ -4,000 מקרים של בני אדם קדחת Q אובחנו פרוץ זה היה קשור זיהום משמעותי של חוות עיזים ^3. בנוסף, Coxiella הוא נשק ביולוגי פוטנציאלי, כפי שסווג על ידי המרכז האמריקאי לבקרת מחלות ומניעתן, הודות ליציבות הסביבה של חיידקי מנת זיהומיות נמוכה צורך לגרום לתחלואה חמורה ולתמותה ^4.

Coxiella קיים בשני שלבים: שלב א 'אורגניזמים, מבודדים ממקורות טבעיים, הם ארסיים מאוד Phase II אורגניזמים הם נחלשו מאוד in vivo. לדוגמא, לאחר קטעי מספר במבחנה של Coxiella burnetii תשע המייל Phase I אורגניזמים, שני חיידקי השלב הופקו המכילות מחיקה כרומוזומליות בלתי הפיכה ותוצאת lipopolysaccharide הקטום (LPS) ^5. זן זה, ג burnetii NMII, הוא phenotypically דומה Phase I במודלים בתרבית רקמה ומספק במצב בטוחl לחוקרים ללמוד בפתוגנזה Coxiella במעבדות ^5. בשנים האחרונות כמה פריצות דרך במהירות קידמו בתחום הגנטיקה Coxiella. בעיקר, התפתחות המדיה axenic (acidified בינוני ציסטאין ציטראט - ACCM-2) אפשר את הגידול ללא תאים של Coxiella בשני הנוזליים על תקשורת מוצקה ^6,7. זה הביא לשיפור ישיר של כלים גנטיים זמינים Coxiella כולל מערכת ביטוי גנים מושרה, וקטורי הסעות ומערכות transposon אקראיים ^8-11. לאחרונה, שתי שיטות איון גן ממוקד גם פותחו, לסלול את הדרך לבחינת מועמדים גנים ארסיות ספציפית ^12.

בעקבות הפנמה על ידי מקרופאגים מכתשיים, Coxiella משכפל למספרים גבוהים בתוך תא קרום נכנס כינת Coxiella- המכיל vacuole (CCV). CCV דורש סחר endocytic מארח הendosomes המוקדם והמאוחר הגס עד שהוא מבשיל לכדי אברון נגזר ליזוזום ^13. לאורך כל התהליך הזה, CCV רוכש גורמים מארחים כי גם מופיעים זמני או להישאר הקשורים vacuole, לרבות, אך לא רק, Rab5, Rab7, CD63 ו LAMP-1 ^13-15. שכפול של Coxiella בתוך תאי מארחים תלוי לחלוטין מערכת הפרשה Dot מתפקדת במלואה / ICM סוג IVB (T4SS) ^8,16,17. מערכת ההפרשה זהו מבנה רב-חלבון הקשורים אבותיהם של מערכות נטייה והוא משתרע הוא ממברנות חיידקי vacuolar לספק חלבונים חיידקיים, כינת effectors, לתוך הציטופלסמה המארח ^18. Coxiella T4SS מבחינה פונקציונלית מאוד דומה היטב את המערכת מאופיינת סוג IVB Dot / הפרשת ICM של הלגיונלה pneumophila ^19,20. מעניין לציין, כי הפעלת טרנסלוקציה מפעיל T4SS ולאחר אינה מתרחשת עד Coxiella מגיע ליזוזום הנגזרות חומציאברון, כ 8 שעות לאחר הפגיעה ^17,21. נכון להיום, מעל 130 effectors Dot / ICM זוהה ^9,17,22-24. רבי effectors אלה לשחק תפקידים חשובים סבירים בעת שכפול של Coxiella בתוך תאי מארחים; עם זאת, effectors רק כמה מתאפיינים תפקודי ^25-29.

במחקר זה אנו מנצלים assay טרנסלוקציה הקרינה מבוססי המסתמכת על המחשוף של המצע CCF2-AM סריג (להלן המכונה המצע כלאם) באמצעות פעילות β-lactamase בתוך הציטופלסמה התא המארח (איור 1). הגן של עניין הוא התמזג TEM-1 β-lactamase (בום) על פלסמיד כתב המספק ביטוי מכונן. מצע כלאם מורכב משני fluorophores (coumarin ו והעמסה) יוצרות זוג סריג. עירור של תוצאות coumarin ב סריג של וההעמסה ו פליטת קרינה ירוקה בהעדר טרנסלוקציה מפעיל; עם זאת, אם בלהM-מפעיל חלבון היתוך הוא translocated לתוך הציטופלסמה המארחת, כתוצאת β-lactamase פעילות וחותכת את טבעת β-לקטם של מצע כלאם, הפרדת זוג הסריג לייצר פליטת קרינה כחולה הבאות עירור. Assay טרנסלוקציה זה הוכח גם כגישה לזהות חלבונים מפעיל מתוך מגוון רחב של חיידקים תאיים תאיים שונים, כולל ג burnetii, L. pneumophila, L. longbeachae, trachomatis כלמידיה, וחיידק E. coli, סלמונלה Brucella ^17,30-35.

כדי לקבוע את התפקיד של גורמי מארח ספציפיים על טרנסלוקציה מפעיל Coxiella אנו מנצלים שיטה מבוססת היטב עבור להשתקת גנים המכונית התערבות RNA, ב RNA התערבות הקטן במיוחד (siRNA). במקור מזוהה elegans Caenorhabditis, התערבות RNA היא תהליך הסלולר אנדוגני משומר המשמש defe המולדNSE מפני וירוסים כמו גם ויסות הגנים ^36,37. לאחר עקדת siRNA רצף ספציפי, השפלה של mRNA מתרחשת דרך RISC (מורכב השתקה המושרה RNA) וכתוצאה מכך להשתקת גנים ספציפיים או ³⁸ מציאה. במחקר זה, siRNA שמש למקד שני חלבונים מארחים, Rab5A ו Rab7A, אשר הם רגולטורים חשובים של מסלול endocytic. ההשפעה של השתקת Rab5A ו Rab7A על טרנסלוקציה מפעיל הוברר באמצעות ג burnetii pBlaM-CBU0077. CBU0077 נבחרה כפי שהוא הוצג בעבר להיות translocated ידי מערכת הפרשת Dot / ICM Coxiella של ^17.

ניצול הוא להשתקת גני siRNA ואת assay טרנסלוקציה fluorescencebased המתואר כאן, אנחנו מתחילים להקים לחיקוי עבור גורמי המארח טרנסלוקציה של חלבונים מפעילים ידי Coxiella. גישה זו ניתן ליישם במגוון רחב של שניהם חיידקים תאיים תאיים שיש להם secretio דומהמערכות n אחראיות טרנסלוקציה של חלבונים מפעילים.

הערה: כל הנהלים חוקר צמיחה או מניפולציה של Coxiella burnetii RSA439 NMII צריכות להתבצע בתוך רמת זיהום פיזית 2 מעבדה ובתוך ארון בטיחות ביולוגי בהתאם להנחיות מקומיות. תרשים סכמטי של זרימת העבודה assay transfection טרנסלוקציה הפוכה המתואר להלן מוצג באיור 2.

1. הכנת ג תרבות burnetii הבעת CBU0077 התמזגו בטא לקטמאז (pBlaM-CBU0077) (יום 1)

1. כן 1X ACCM-2 ^6:
   1. מערבבים את המרכיבים המפורטים בטבלה 1. התאם ל- pH 4.75 עם 6 M NaOH לעקר מסנן (לא החיטוי). ACCM-2 יציב במשך כשלושה שבועות מאוחסנים 4 ° C.
2. צור ג מניות pBlaM-CBU0077 burnetii.
   1. להדביק הלה 229 תאים עם ג זן burnetii נושאת pBlaM-CBU0077 ומעבר עד vacuol גדולes הם נצפו ברוב המכריע של תאים.
      1. לגדל את ג זן burnetii נושאת pBlaM-CBU0077 בתוך 20 מ"ל ACCM-2 3 מיקרוגרם / מ"ל chloramphenicol המכיל בבקבוק תרבות 75 ס"מ ² רקמות עם כובע פרקו במשך 7 ימים ב 37 מעלות צלזיוס ב 5% CO _2, 2.5% O _2.
      2. צנטריפוגה ג burnetii pBlaM-CBU0077 התרבות ב 15,000 × גרם במשך 15 דקות ב RT.
      3. Re- להשעות גלולה ב 20 מ"ל DMEM + 10% נסיוב עגל עוברית (FCS) + 3 מיקרוגרם / מ"ל ​​chloramphenicol (מדיה תחזוקה). הסר מדיה מבקבוקון ^2% ומחוברות 50 75 ס"מ של תאים 229 הלה. תוספת מחדש מושעה ג burnetii לתאים הלה 229. דגירה של 2 ימים על 37 מעלות צלזיוס ₂ 5% CO לאפשר זיהום של תאים 229 הלה להקים.
      4. פיצול תאים לתוך הבקבוק בתרבית רקמה 175 ס"מ ^2.
         1. הסר מדיה מהבקבוק 75 ס"מ ² ולשטוף בשכבה פעמיים עם מ"ל 10 מחומם מראש PBS.
         2. הוסף 1 מ"ל of 0.05% טריפסין-EDTA פתרון ומקום התאים ב 37 ° C + 5% CO ₂ עבור 3 - 5 דקות כדי לנתק תאים.
         3. Re להשעות תאים 10 מ"ל של התקשורת תחזוקה. הוסף 2 מ"ל של תאים מחדש מושעה לתוך בקבוק 175 ס"מ ² המכיל 38 מ"ל של התקשורת תחזוקה.
         4. לדגור על 37 מעלות צלזיוס ב 5% CO ₂ למשך 3 נוסף - 5 ימים עד 100% confluency הוא הגיע vacuoles גדול הם נצפו.
   2. איסוף supernatant מהבקבוק 175 ס"מ ^2, להוסיף 10 מ"ל DH ₂ O כדי לכסות את התאים 229 הלה נגוע דגירה במשך 15 דקות כדי lyse התאים הנגועים.
   3. שלב supernatant ותאי lysed ו גלולה ב g 15,000 × במשך 15 דקות ב RT.
   4. Re- להשעות גלולה ב 10 מ"ל DH ₂ O. Lyse תאים נוספת על ידי העברת מחדש ההשעיה שוב ושוב באמצעות מחט 23G מצורף מזרק 10 מ"ל לפחות פי 20. גלולה ב g 500 × במשך 5 דקות כדי להסיר פסולת הסלולר.
   <li> הסר supernatant גלולה ב 15,000 × גרם במשך 15 דקות ב RT לאסוף ג burnetii.
3. מחדש להשעות ג burnetii ב DMEM + 10% FCS ולכמת מספר החיידקים לפי 4. לדלל את 1 × 10 ⁹ הגנום / ml באמצעות DMEM + 10 FCS% + 10% sulfoxide דימתיל (DMSO), מניות aliquot 50 μl לתוך צינורות microfuge ולאחסן ב -80 מעלות צלזיוס.

2. Transfection ההפוך של siRNA וזריעה של הלה 229 תאים (יום 4)

1. בעת שימוש siRNA הניסיון בפעם הראשונה להכיןsiRNA כדלקמן:
   1. בקצרה בצנטריפוגה siRNA lyophilized על מנת להבטיח כי גלולת siRNA נאספה בתחתית של התחתית.
   2. Re- להשעות את siRNA pelleted לריכוז מניות סופי של 20 מיקרומטר ידי pipetting הנפח המתאים של חיץ siRNA 1x (טבלה 2).
   3. פיפטה הפתרון מעלה ומטה 3 - 5 פעמים כדי לערבב ומניחים על מערבל מסלולית במשך 30 דקות ב RT, צינור היפוך כל 5 - 10 דקות.
   4. בקצרה צנטריפוגות צינור כדי להבטיח את siRNA נאסף בתחתית של התחתית.
   5. Aliquot siRNA לתוך 50 aliquots μl צינורות microfuge ולאחסן ב -20 ° C עד הנדרשים.
   6. כדי ליצור 1 מיקרומטר עובד ריכוז siRNA, פיפטה 950 μl של siRNA 1X חיץ לתוך המניה aliquot 50 μl (20 מיקרומטר) בעת הצורך. הערה: זה ריכוז 1 מיקרומטר עובד ניתן להקפיא מופשר מספר פעמים עבור transfections חזר.
2. מניחים DMEM + 10% FCS,; 0.05% טריפסין-EDTA ו PBS באמבט מים 37 ° C (או שווה ערך) למשך 30 דקות כדי לחמם לפני השימוש.
3. הכנת רכיבי transfection:
   ההערה: הפרוטוקול הבא כבר אופטימיזציה עבור הלה 229 תאי microplate 96-היטב עם קירות שחורים תחתית שטוחה, שקופה. אופטימיזציה של כמות מגיב transfection, ריכוז של siRNA וזריעת צפיפות של תאים עשויה להיות נחוצה עבור שורות תאים שונות.
   1. עבור כל טוב, השתמש 0.1 מגיבים transfection μl, 15.9 μl מופחת סרום בינוני (מדיה חיונית מינימאלית המשמשת transfections, עיין בטבלה של חומרים) ו -4 μl של 1 מיקרומטר siRNA (וכתוצאה מכך ריכוז siRNA סופי של 40 ננומטר). השתמש צינורות microfuge נפרד עבור OTP, PLK1, Rab5A ו Rab7A. מדוד כל תנאי assay בשלושה עותקים. דוגמה של פריסת צלחת 96-היטב מוצג באיור 3.
      הערה: פרוטוקול זה משלבת את השימוש שני פקדים: OTP ו PLK1. OTP הואמורכב siRNA ארבע וקיווה כי כבר מותאמת לצמצום השפעות מחוץ יעד ובכך OTP משמש כביקורת שלילית, ללא מיקוד. גם מקושקש siRNA יכול לשמש כביקורת שלילית. פסד של תוצאות ביטוי PLK1 במות תא נרחב בכמה שורות תאים על ידי גרימת מסלולים פרו-אפופטוטיים ולכן siRNA PLK1 משמש כביקורת חיובית עבור transfection שבו מות תא וקושר ליעילות transfection.
      1. עבור כל transfection siRNA הניסיון, לשלב 0.4 מגיבים transfection μl ו 63.6 μl מופחת סרום בינוני בצינור microfuge פרט. וורטקס כל צינורות microfuge ולאפשר רכיבים מורכבים במשך 5 דקות ב RT.
      2. להוסיף 16μl של siRNA כל ניסיוני אל הצינורות המקבילים microfuge המכילים את מורכבות transfection. וורטקס דגירה במשך 20 דקות ב RT. הערה: חשוב שלא יעלה על 30 דקות, כמו יעילות transfection יקטן.
4. במהלך 20 דקות incubation (2.3.1.2) להוסיף 20 μl של מגיב transfection בינוני + סרום מופחת + siRNA לערבב לתוך הבארות המתאימות של מגש 96-היטב תחתון ברור שטוח, שחור סטרילי.
5. ברגע תקופת דגירת 20 דקות יושלם, זרע הלה 229 תאים בצפיפות של 3.92 × 10 ³ תאים / טוב.
   1. קציר הלה 229 תאים מתוך ומחוברות או תת-ומחוברות 75 ס"מ ² בקבוק תרבות רקמה DMEM מראש חימם + 10% FCS מחדש להשעות התאים הצפיפות הסופית של 4.9 × 10 ⁴ תאים / מ"ל לפי שיטות סטנדרטיות. כדי להבטיח transfection היעילה לא נפגעת, להכין תאים במהלך תקופת הדגירה 20 דקות (2.3.1.2).
      1. שטפו את בשכבה של הלה 229 התאים פעמיים עם 10 מ"ל של PBS מחומם מראש.
      2. הוסף 1 מ"ל של תמיסת 0.05% טריפסין-EDTA ומקום הלה 229 התאים ב 37 ° C + 5% CO ₂ עבור 3 - 5 דקות כדי לנתק תאים.
      3. ולאסוף תאים 9 מ"ל של DMEM מחומם מראש + 10% FCס ספירת תאים באמצעות haemocytometer ולהכין תאי צפיפות סופית של 4.9 × 10 ⁴ תאים / מיליליטר באמצעות DMEM + 10% FCS.
   2. פיפטה 80 μl של הלה 229 תאים בצפיפות של 4.9 × 10 ⁴ תאים / מ"ל לבאר כל שמכילה את מגיב transfection + תערובת בינוני + siRNA מופחתת בסרום. זה מתאים צפיפות תאים של 3.92 × 10 ³ תאים / טוב.
      הערה: חיסור רקע נדרש עבור מצע כלאם.
      1. אל תוסיף תאים או siRNA כדי "ריקות" בארות (איור 3). במקום זאת, הוסף 80 μl של DMEM + 10% FCS לבארות אלה להגדיר בשלושה עותקים.
   3. דגירה של 24 שעות ב 37 ° C + 5% CO _2.

3. מדיה שינוי (יום 5)

1. לאחר 24 שעות, להסיר תקשורת באמצעות מתאם רב המחובר למקור ואקום או ידני עם טפטפת רב ערוצית, ולהחליף עם 100 μl של prewarm הטריed DMEM + 10% FCS.
2. דגירה במשך שעה 48 נוסף על 37 מעלות צלזיוס + 5% CO _2.
3. בשלב זה, לבדוק את הכדאיות של תאים באמצעות חזותי מיקרוסקופ אור רגילה. אם transfection ההפוכה הצליחה, מוות תאי משמעותי יקוים ב הבארות המכילות PLK1 siRNA לעומת OTP siRNA.

4. כימות הזנים Coxiella burnetii pBlaM-CBU0077 באמצעות qPCR (יום 7)

1. לאחר 7 ימים של צמיחה ב ACCM-2 על 37 מעלות צלזיוס ב 5% CO _2, 2.5% O ₂ (1.3), צנטריפוגה 10 מ"ל ג burnetii pBlaM-CBU0077 התרבות ב 15,000 × גרם במשך 15 דקות ב RT.
2. Re- להשעות את גלולה חיידקי 10 מ"ל של טרום חימם DMEM + 10% FCS. כן 1:10 ו 1: 100 דילולים של התרבות (מדגם) באמצעות DH ₂ O.
3. הגדר את הרכיבים הנדרשים עבור qPCR.
   הערה: מיצוי gDNA יכול להתבצע מראש ולאחסן ב -20 ° C until הנדרש.
   1. הכנת תקנים:
      1. חלץ gDNA מ Coxiella burnetii RSA439 NMII זן סוג בר הגדלים ACCM-2 על 37 מעלות צלזיוס ב 5% CO _2, 2.5% O ₂ למשך 7 ימים באמצעות ערכת חילוץ gDNA, לפי הוראות היצרן.
      2. מדדו את הריכוז gDNA (ז / μl) באמצעות Nanodrop (או שווה ערך) לעבר ספיגת של 260 ננומטר.
      3. חישוב מספר העותקים הגנום לכל μl באמצעות הנוסחה הבאה להלן, ולהמיר למספר של הגנום / מ"ל.
         
      4. התאם את מספר מ"ל / הגנום עד 10 ⁹ / מ"ל (בנפח סופי של 100 μl) בצינור microfuge חדש באמצעות DH ₂ O. זה יכול להיות מבושל במשך 10 דקות ומאוחסן ב -20 ° C עד נדרשים.
      5. ביום של הזיהום, לייצר 10 מתקפלים דילולים סידוריים של 10 מיליליטר ⁸ הגנום / 10 מיליליטר ⁵ הגנום / מן הגנום 10 ⁹s / ml המלאי.
         1. פיפטה 10 μl של 10 ⁹ הגנום / מ"ל לתוך 90 μl של DH ₂ O לייצר 10 ⁸ הגנום / מ"ל. וורטקס לערבב. פיפטה 10 μl של 10 ⁸ הגנום / מ"ל לתוך 90 μl של DH ₂ O לייצר 10 ⁷ הגנום / מ"ל. וורטקס וחזור עד 10 מ"ל ⁵ הגנום /.
   2. הגדרת התגובה qPCR. צור תערובת אב 25 בארות לתת דין וחשבון על כל שגיאות pipetting. עבור כל טוב, השתמש 10 מיקס μl qPCR מאסטר; 2 μl של תערובת פריימר ompA (4.3.2.2) ו -3 μl של DH ₂ O.
      הערה: OmpA הוא חלבון חיצוני-קרום של ג burnetii ^'39 וכן סעיף 82-בסיס-זוג בתוך אזור השמור ביותר נבחר לשימוש כמו בדיקה כפי שתואר לעיל ^40.
      1. הגדרת כל תקן (DH ₂ O, 10 ^5, 10 ^6, 10 ^7, 10 ^8, 10 ⁹ הגנום / מ"ל) מדגם (1:10 ו 1: 100 דילול) בתוך 96 היטב PCR להנתק צלחת (לא מרופדת) בשני עותקים או בשלושה עותקים, בהתאמה. הוסף 5 μl של מדגם או רגיל לתוך הבארות המתאימות.
      2. שימוש DH ₂ O, לדלל הן פריימר קדימה ompA (5'-CAGAGCCGGGAGTCAAGCT-3 ') ו ompA לאחור תחל (5'-CTGAGTAGGAGATTTGAATCGC-3') לריכוז סופי של 4 מיקרומטר ולשלב לתוך הצינור אותו microfuge.
         הערה: שילוב פריימר ompA ניתן להכין מראש ולאחסן ב -20 ° C עד הנדרשים.
      3. מערבבים 250 μl מיקס מאסטר qPCR, 50 μl תערובת פריימר ompA, 75 μl DH ₂ O ו מערבולת לערבב. הוסף 15 μl של תמהיל אמן זה לבארות המכילות גם סטנדרטים או דוגמאות.
      4. מניח כמוסות רצועת 8-מכסת PCR על בארות המתאימים צנטריפוגות דופק צינורות PCR כדי לוודא שהכל נאספו בתחתית הצינורות.
      5. הגדר את התוכנית הבאה על ma PCR כמותיChine: 50 מעלות צלזיוס למשך 2 דקות, 95 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות, ואחריו 45 מחזורים של 95 מעלות צלזיוס במשך 1 שניות ו -60 מעלות צלזיוס למשך 20 שניות (איור 4 א).
   3. נתח את ה- CT (סף מחזור) ערכים מן qPCR:
      1. מעבירים את ערכי ה- CT כדי גיליון אלקטרוני באמצעות פונקציית הייצוא של התוכנית.
      2. צור scatterplot של התקנים 10 ⁵ הגנום / מיליליטר עד 10 מיליליטר ⁹ הגנום / (מבוטא ערכי יומן). לבטל את כל חריגות ברורות בין הדגימות בשלושה עותקים. צור קו מגמת לוגריתמים ולקבוע את המשוואה של הגרף.
      3. חשב את המספר הכולל של הגנום / מיליליטר במדגם באמצעות המשוואה שנוצרה 4.3.3.2. אל תשכחו לתת דין וחשבון על הדילול הראשוני (1:10 ו 1: 100) של הדגימות.

5. תאים transfected זיהום של היפוך (יום 7)

1. לאחר חישוב מ"ל / הגנום סך ג ספחתnetii pBlaM-CBU0077 תרבות לשמש זיהום, להתאים תרבית החיידקים מחדש מושעה להדביק תאים בכל משרד הפנים של 300 בנפח סופי של 50 μl / גם באמצעות prewarmed DMEM + 10% FCS.
   הערה: הצפיפות הצפויה של תאי הלה 229 זורעים עם זמן הכפלה רגיל לאחר 72 שעות היא 3.136 × 10 ⁴ תאים / היטב. כמות החיידקים נדרש להדביק בכל משרד הפנים של 300 הוא 9.408 × 10 ⁶ ב 50 μl, אשר משווה ל 1.88 × 10 ⁸ מ"ל / חיידקים.
   1. בעזרת הערך שנמדד (ml / הגנום) qPCR (4.3.3.3), לדלל את החיידקים מחדש מושעה באמצעות FCS מראש חמם ​​DMEM + 10% בנפח סופי של 2 מיליליטר להדביק את תאי transfected ההפוכות.
2. הסר את המדיה הקיימת מן ריק הפוך תאי transfected.
3. הוסף 50 μl של החיידקים המדוללים (1.88 × 10 ⁸ חיידקים / מיליליטר) כדי הבארות המתאימות. הוסף 50 μl של DMEM + 10% FCS הוא ריק uבארות ninfected.
4. דגירה של 24 שעות ב 37 ° C + 5% CO _2.

תוספת 6. של כלאם מצע כדי לקבוע את הרמה של טרנסלוקציה (יום 8)

1. הכן את הפתרונות לפתרון טעינת 6x המצע כלאם.
   הערה: פתרון A, B ו- C ניתן בתוך ערכת מצע כלאם (עיין בטבלה של חומרים). B פתרון עלול להיווצר משקע ב RT. לחמם את הפתרון הזה על 37 מעלות צלזיוס לפני השימוש ואת המשקע צריך לפזר.
   1. כאשר השימוש בערכה בפעם הראשונה, להוסיף 185 μl של DMSO (מסופק עם ערכת מצע כלאם) אל א הפתרון המיובש בהמשך, לאחסן את הפתרון מחדש מושעה ב -20 ° C.
   2. הכן פתרון 0.1 M Probenicid מראש ולאחסן 1 aliquots מ"ל ב -20 ° C עד לרגע השימוש.
      1. כן 0.4 M NaOH (1.6 גרם ב O 100 מיליליטר DH _2).
      2. כן 100 חיץ פוספט מ"מ Na pH 8 (1.56 גרם לאא ₂ PO ₄ .2H ₂ HPO ₄ O 100 מ"ל DH _2).
      3. ממיסים 1.25 גרם של Probenicid ב 22 מ"ל של 0.4 M NaOH ידי תסיסה נמרצת.
      4. להוסיף 22 מ"ל 100 במאגר פוספט מ"מ Na pH 8 (פתרון יהפוך מעונן) ומערבבים לפזר את המשקע שצורות.
      5. התאם את ה- pH עד 8 (במידת הצורך) באמצעות -1 M NaOH / HCl.
      6. מערבב נמרץ ומחממי מעטה (<50 מעלות צלזיוס) עד הפתרון הוא בעיקר ברור.
      7. מסנן (גודל נקבובי 0.2 מיקרומטר) ו aliquot ב 1 מיליליטר כרכים. aliquots חנות ב -20 ° C.
2. עבור כל טוב, השתמש 0.06 μl פתרון, 0.54 B פתרון μl, 7.9 μl C פתרון ו -1.5 μl 0.1 M Probenicid. צור מיקס מאסטר עבור 30 בארות על ידי שילוב הראשון 1.8 μl של פתרון A ו- 16.2 μl של פתרון B יחד בתוך שפופרת microfuge. מערבב היטב בעזרת מערבולת. להוסיף 237 μl פתרון של C ו -45 μl של 0.1 M Probenicid. וורטקס לשלב כל components.
   הערה: הפתרון טעינת 6x יציב לתקופה של עד 4 שעות (בחשיכה) אבל צריכים להיות מוכנים קרוב ככל האפשר לפני השימוש.
3. הוסף 10 μl של פתרון טעינת 6x ישירות לתוך כל הבארות ריקות הפוך טרנספקציה מבלי להסיר את המדיה הקיימת.
4. דגירה את הצלחת על RT עבור 2 שעות בחושך.
5. כדי לקבוע את רמת טרנסלוקציה, לכמת את כמות הקרינה באמצעות קורא microplate.
   שים לב: ההליך הבא הוא ספציפי קורא microplate ClarioSTAR. קוראי microplate Equivalent יכולים להיות מנוצלים גם.
   1. צור פרוטוקול עוצמת קרינה חדש באמצעות נקודת קצה כמצב הקריאה.
   2. כוונו את הפרמטרים הבסיסיים כדלקמן:
      1. בחר microplate 96-היטב.
      2. תחת הגדרות אופטיות, בחר 2 multichromatics עם הגדרות המוגדרים על ידי המשתמש הבא: (1) קלט 410-10 עירור ננומטר פליטת ננומטר 520-10. (2) קלט 410-10 עירור ננומטר 450-10 פליטה ננומטר. ודא היטב multichromatics נבחרה.
      3. בחר מיצוע מסלולית בקוטר של 3 מ"מ.
      4. תחת אופטי, בחר אופטי תחתון.
      5. תחת מהירות ודיוק, בחר מדויק. זה מתאים לשמונה אזורים לכל טוב.
   3. התאם את פריסת הצלחת על ידי בחירת הבארות המתאימות כמו דגימות.
   4. מדידת התחלה בחר.
   5. הסר את המכסה והנח את המגש לתוך קורא הצלחת. כדי למנוע מצב שבו יגיע ערכי קרינה מרביים, להבטיח את הערך הרווח מותאם. לשם כך, בצע התאמה רווחת באחת הבארות הנגועות כי כבר transfected הפוך עם siRNA OTP. זו תואמת את טרנסלוקציה הצפויה הגבוהה ביותר.
   6. מדידת ההתחלה בוחרת למדוד כל בארות המתאימים באמצעות קרינה תחתונה לעבר עירור של 410 ננומטר פליטה של ​​שני 450 ננומטר ו 520 ננומטר עבור קרינה כחולה וירוקה, בהתאמה.

7. ניתוח תוצאות:

1. חשב את היחסשל 450 ננו-מטר ל 520 ננומטר (מכחול לירוק) עבור כל הדגימות הבאות הפחתה ריקה ולהביע יחסית מדגם OTP הנגוע.
   הערה: השלבים הבאים הניתוח מסופקים תכנית גיליונות אלקטרונית פשוטה.
   1. באמצעות פונקציית הייצוא על הקורא microplate, להעביר את ערכי הקרינה גלם המתקבלים עבור שני 520 ננומטר ו -450 ננומטר אורכי גל הפליטה (6.5) לתוך גיליון אלקטרוני.
   2. החישוב הממוצע של קריאות "ריקה" (מדיה בלבד, ללא תאים) עבור אורך גל 520 ננומטר על-ידי הוספת ערכי קרינת גלם 520 ננומטר וחלוקתו במספר הבארות (3). חזור באמצעות הערכים 450 ננומטר אורך גל הריק. ערכים אלה מייצגים את קרינת הרקע בשל הצלחת 96 היטב בתקשורת.
   3. הפחת את קרינת הרקע. באמצעות הערכים שהתקבלו ב 7.1.2 להפחית את הממוצע של אורך גל 520 ננומטר הריק מכל ערכי קרינת ננומטר מדגם 520. חזור על ערכים גל 450 ננומטר.
   4. כדי להשיג את 450: יחס ננומטר 520 להשתמש הערכים המתוקנים הריקים (7.1.3). מחלקים כל ערך קרינה מדגם 450 ננומטר על ידי שלה מקביל 520 ערך ננומטר.
   5. החישוב הממוצע של ערכי היחס OTP נגוע על ידי הוספת 450: ערכי יחס ננומטר 520 (מ 7.1.4) וחלוקתו במספר הבארות (3).
   6. חשב את היחס בין הדגימות ביחס נגוע OTP ידי חלוקת 450: יחס ננומטר -520 מחושב ב 7.1.4 על ידי הממוצע של ערך יחס OTP הנגוע מחושב ב 7.1.5.

תוספת 8. כתם גרעינים לקביעת מספר סלולרי לאחר Assay טרנסלוקציה (יום 8)

1. בעקבות כימות של קרינה, סר מדיה המכילה פתרון טעינת 6x מכל הבארות או באמצעות מתאם רב ערוצית המחובר למקור ואקום או ידני באמצעות פיפטה רב ערוצים.
2. הוסף 50 μl של 4% PFA (paraformaldehyde) פתרוןב PBS לכל הבארות המתאימות כדי לתקן תאים. לדגור על RT במשך 20 דקות.
3. הסר 4% פתרון PFA PBS (לפי 8.1) ולשטוף תאים פעמיים עם 75 μl PBS של.
4. הוסף 50 μl של כתם גרעיני חדיר תאים עבור DAPI למשל ( '4, 6-diamidino-2-phenylindole), זה טוב. לרכוש תמונות באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי ולכמת את מספר הגרעינים נוכחיים בכל טוב לאחר טיפול siRNA באמצעות תוכנת ניתוח תמונה מתאימה, כגון ⁴¹ ImageJ.

לצורך המחקר הזה, ג burnetii זן pBlaM-CBU0077 נבחר CBU0077 הוכח בעבר להיות מפעיל translocated של מערכת הפרשת Coxiella Dot / ICM 17. לפני ההדבקה, המספר הכולל של ml / הגנום של ג שבעה ימים תרבות burnetii pBlaM-CBU0077 הייתה מנויים באמצעות qPCR. איור 4 מדגי דוגמא של סף המחזור (CT) ערכים צפויים משני תקני הדגימות הבאים qPCR. ערכי CT (המיוצגים בעלילת ההגברה (האיור 4B) ומספרית (איור 4C)) יוצאו ונותחו כמתואר 4.3.3. בהתבסס על נתונים נציג לעין, היו 2.31 ​​× 10 8 הגנום / מ"ל ב 10 מ"ל מחדש תלויה תרבית החיידקים (איור 4D). כדי להפיק את הדילול בקטריאלי המתאים (1.88 × 10 8 הגנום / מיליליטר in 2 מ"ל), 1.63 מ"ל של חיידקים resuspended התווסף 370 μl של FCS טרי, מחומם מראש DMEM + 10%. תאים הפוכים טרנספקציה עם siRNA נדבקו כתוצאה מכך עם ג burnetii pBlaM-CBU0077 ב משרד הפנים של 300 למשך 24 שעות.

לאחר דגירה של ההפך תאים נגועים טרנספקציה עם כימות המצע כלאם של טרנסלוקציה מפעיל ניתן לקבוע באמצעות קורא צלחת פלואורסצנטי. בעקבות ניתוח כמתואר 7, כל הערכים ייחסו כי כבר מנורמלים הנגוע OTP יכולים גם להיות מנורמלים הנגוע OTP. רמת טרנסלוקציה מפעיל אחרי שדכאתי של גני מארח יכולה להיות מקובצת לשלוש תוצאות לאחר השוואה לשליטת OTP נגועה: (1) ללא שינוי; (2) גברת טרנסלוקציה מפעיל; (3) ירד טרנסלוקציה מפעיל. ניתוח סטטיסטי לאחר, למשל מבחן t הסטודנטים, שניתן להשתמש בהם כדי לקבוע את המשמעות של כל t ההבדל שנצפהo נגוע שליטה OTP. תוצאת השתקה או Rab5A או Rab7A על טרנסלוקציה מפעיל משלושה ניסויים עצמאיים מוצג באיור 5A. ירידה משמעותית ברמת טרנסלוקציה בום-CBU0077 התרחשו במהלך השתקה שניהם Rab5A ו Rab7A לעומת קבוצת ביקורת OTP (ערך p = 0.0088 (Rab5A) וערך p = 0.0059 (Rab7A), זיווג, מבחן t הסטודנטים). ההשפעה של טיפול siRNA על כדאיות התא גם הוקמה. בעקבות assay טרנסלוקציה, התאים היו קבועים, מוכתם בכתם גרעינים ובהמשך לכמת. כפי שניתן לראות בתרשים 5 ג, למרות טיפול עם או תוצאות Rab5A או Rab7A לירידה כדאיות התא לעומת קבוצת ביקורת OTP (12% ו -31%, בהתאמה), ירידה זו היא לא חמורה כמו PLK1 (97%), בגן הידוע מוות של תאים כדי לגרום (p-value = 0.0102 (Rab5A); p-value = 0.0081 (Rab7A); p-value <0.0001 (PLK1), זיווג, סטודנטים מבחן t). תוצאות אלו מראות כיצד השתקה של המארח geנוס באמצעות siRNA יכול לשנות את הרמות שליליות של טרנסלוקציה מפעיל חיידקים.

איור 1. את מנגנון הפעולה של מצע כלאם במהלך הדבקה. ג burnetii מופנם על ידי תאי מארחים ויוצר vacuole נגזר-ליזוזום כינת vacuole Coxiella המכיל. 24 שעות לאחר ההדבקה, תאים נטענים עם המצע כלאם חדיר קרום שיש לה שני fluorophores להרכיב זוג סריג (א). בהעדר β-lactamase כלומר, לא טרנסלוקציה של מפעיל בום-CBU0077, עירור של coumarin ב 410 תוצאות ננומטר סריג וההעמסה, ציינו כאיתות פלואורסצנטי ירוקה (520 ננומטר) (B). במקרה של מערכת הפרשת Dot / ICM פונקציונלית, חלבון ההיתוך בום-CBU0077 יהיה translocated לתוך התא המארח יהיה CLeave מצע כלאם, אגב פעילות β-lactamase, גרימת הפרדת שני הצבעים וכתוצאה מכך שיבוש סריג ו אות קרינה כחולה (450 ננומטר) לאחר העירור ב 410 ננומטר (C). שני אותות הקרינה הירוקים וכחול יכולים להיות זוהה באמצעות קורא צלחת פלואורסצנטי. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

. איור 2. סקירה סכמטית של Transfection הפוך טרנסלוקציה Assay Workflow יום 1: הכן את ג burnetii pBlaM-CBU0077 תרבות יום 4:. transfect היפוך באמצעות 40 ננומטר siRNA זרע הלה 229 תאים בצפיפות סופית של 3.92 × 3 תאים 10 / גם לתוך מגש 96-גם יום 5:. Chהתקשורת ange יום 7:. לכמת את מ"ל / הגנום הכולל של ג burnetii pBlaM-CBU0077 תרבות באמצעות qPCR ובהמשך להדביק תאי transfected הפוך עם משרד פנים של 300. יום 8:. להוסיף צבע טעינת 6x, מודד קרינה ולכמת מספר סלולארי אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 3. פריסת פלייט 96-גם משמשת הגדרת Transfection הפוך והזריעה של הלה 229 תאים. הבארות "הריקות" (באדום) מכילים מדיה בלבד ואינו צריך תוספת של או siRNA או הלה 229 תאים. SiRNA OTP (בכחול אור עבור בארות נגועות וכחול כהה עבור בארות נגועות) משמש כביקורת ללא מיקוד, שכן הוא כבר מותאםיש פחות תופעות מחוץ היעד. והחום של הבארות ירוקות לייצג את Rab5A ו Rab7A siRNA, בהתאמה. PLK1 siRNA (בצבע צהוב) משמש כמדד ליעילות transfection כאובדן ביטוי PLK1 יכול לגרום מסלולים פרו-אפופטוטיים מוות של תאים נרחבים בתוך רוב מכריע של שורות תאים. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 4. ערכים נציג qPCR Ct משמש לכמת את המספר הכולל של הגנום / מ"ל ב C. burnetii pBlaM-CBU0077 תרבות. (א) התנאים מחזור המשמש qPCR למנות את מספר מ"ל / הגנום בתרבויות Coxiella. ערכי Ct לשני תקני דגימות מיוצגים גרפי (B) ו נומרית (C)פורמטים. (ד) ערכי ה- CT הרגילים היו בממוצע, בגרף לבין קו מגמת לוגריתמי חושב. באמצעות המשוואה ואת הממוצעים של המדגם Ct מעריך את המספר הכולל של מיליליטר / הגנום של ג burnetii תרבות pBlaM-CBU0077 היה נחוש בדעתו להיות 2.31 ​​× 8 10. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

טרנסלוקציה איור 5. ה DOT / ICM מפעיל בום-CBU0077 במהלך siRNA השתקת Rab5A ו Rab7A. הלה 229 תאים היו transfected הפוכה עם siRNA הספציפי Rab5A (ברים חומים), Rab7A (פסים ירוקים), OTP (סורגים כחולים) או PLK1 (פסים צהובים) וטופחו במשך 72 שעות לפני ההדבקה עם ג burnetii זן pBlaM-CBU0077 ב משרד הפנים של 300 למשך 24 שעות. לאחר tהוא התוספת של מצע כלאם, קרינה נמדד באמצעות קורא microplate (א) הטבלה מדגימה את ערכי קרינת גלם המתקבלים בניסוי יחיד לצד 450:. ביחס יחס 520 ננומטר לשליטת OTP נגוע לאחר הפחתת הערכים הריקים (מדיה רק, לא תאים). רמת טרנסלוקציה (B) ואת כדאיות התא (C) מוצגים כאחוז ממוצע ± סטיית התקן ביחס לתאים נגועים טרנספקציה הפוכה OTP משלושה ניסויים עצמאיים. * P-value <0.05; **-ערך p <0.01; **** P-value <0.0001 (זיווג, -test t סטודנטים). נא ללחוץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

טבלה 1. הרכיבים הנדרשים כדי להפוך 1x ACCM-2.

נפח טבלת 2. של siRNA 1x כרית הון הנדרש עבור הידרציה Lyophilized siRNA לריכוז המתאים.

למחברים אין מה לחשוף.