הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

החלת העברת אנרגית תהודת קרינה (סריג) לבחינת יעילות טרנסלוקציה מפעיל ידי

10.2K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/54210

⸱

6 ביולי 2016

 ,  , 
1Department of Microbiology and Immunology, Peter Doherty Institute for Infection and Immunity, University of Melbourne

במאמר זה

סיכום

חוקר את יחסי הגומלין בין חיידקים פתוגנים מארחיהם הוא אזור חשוב של מחקר ביולוגי. כאן אנו מתארים טכניקות צורך למדוד טרנסלוקציה מפעיל ידי burnetii Coxiella במהלך להשתקת גנים siRNA שימוש המצע כלאם.

תקציר

Burnetii Coxiella, הגורם הסיבתי של קדחת Q, הוא פתוגן תאיים שנשענת על סוג IV Dot / ICM הפרשת מערכת להקים נישה בשכפול הדנ"א. קבוצה של effectors הם translocated דרך המערכת הזאת לתוך התא המארח כדי לתפעל תהליכים המארח לאפשר את הקמתה של vacuole ליזוזום הנגזרות ייחודי עבור שכפול. השיטה המוצגת כאן כוללת שילוב של שתי טכניקות ומבוססות: להשתקת גנים ספציפית באמצעות siRNA ומדידה של טרנסלוקציה מפעיל באמצעות מצע סריג מבוסס המסתמך על פעילות β-lactamase. במסגרתו קיימים שתי גישות אלה, אנו יכולים להתחיל להבין את התפקיד של גורמים מארחים בתפקוד טרנסלוקציה מפעיל מערכת הפרשת חיידקים. במחקר זה בדקנו את התפקיד של Rab5A ו Rab7A, הוא רגולטורים חשובים של מסלול סחר endocytic. אנו מראים כי השתקת ביטוי גם בתוצאות חלבון לירידה מפעיל translocatioיעילות n. ניתן שיטות אלה לשנות בקלות לבחון פתוגנים תאיים תאיים אחרים כי גם לנצל מערכות הפרשה. בדרך זו, תמונה גלובלית של גורמי מארח מעורבים טרנסלוקציה מפעיל חיידק עשויה להתגלות.

מבוא

Burnetii Coxiella הוא פתוגן תאי ייחודי שגורם קדחת Q הידבקות בני אדם zoonotic. מחלה זו קשורה עם קשת רחבה של מצגות קליניות המשתרעות seroconversion אסימפטומטית לזיהום כרוני מסכנות החיים שבאו לידי לעתים קרובות ככל שנים אנדוקרדיטיס לאחר חשיפת 1. הדבקת בני אדם מתרחשת בעיקר באמצעות השאיפה של אירוסולים מזוהמים מעלי גירת המאגר העיקרי לזיהום, בפרט, פרות חולבות, כבשים ועזים. למרות זיהום Coxiella אצל בעלי חיים אלה הוא בדרך כלל תת-קליני, הזיהום עלול לגרום להפלה ואת עומס החיידקים ניכר בתוך נוזל שלית הלידה יכול לזהם בסביבה המקומית 1. דוגמה של זיהום כגון עומס עצום יכול להיות משני בריאות הציבור ועל ענף החקלאות נצפתה לאחרונה פרוץ קדחת Q שאירעו בהולנד 2. בין 2007 ו2010 למעלה מ -4,000 מקרים של בני אדם קדחת Q אובחנו פרוץ זה היה קשור זיהום משמעותי של חוות עיזים 3. בנוסף, Coxiella הוא נשק ביולוגי פוטנציאלי, כפי שסווג על ידי המרכז האמריקאי לבקרת מחלות ומניעתן, הודות ליציבות הסביבה של חיידקי מנת זיהומיות נמוכה צורך לגרום לתחלואה חמורה ולתמותה 4.

Coxiella קיים בשני שלבים: שלב א 'אורגניזמים, מבודדים ממקורות טבעיים, הם ארסיים מאוד Phase II אורגניזמים הם נחלשו מאוד in vivo. לדוגמא, לאחר קטעי מספר במבחנה של Coxiella burnetii תשע המייל Phase I אורגניזמים, שני חיידקי השלב הופקו המכילות מחיקה כרומוזומליות בלתי הפיכה ותוצאת lipopolysaccharide הקטום (LPS) 5. זן זה, ג burnetii NMII, הוא phenotypically דומה Phase I במודלים בתרבית רקמה ומספק במצב בטוחl לחוקרים ללמוד בפתוגנזה Coxiella במעבדות 5. בשנים האחרונות כמה פריצות דרך במהירות קידמו בתחום הגנטיקה Coxiella. בעיקר, התפתחות המדיה axenic (acidified בינוני ציסטאין ציטראט - ACCM-2) אפשר את הגידול ללא תאים של Coxiella בשני הנוזליים על תקשורת מוצקה 6,7. זה הביא לשיפור ישיר של כלים גנטיים זמינים Coxiella כולל מערכת ביטוי גנים מושרה, וקטורי הסעות ומערכות transposon אקראיים 8-11. לאחרונה, שתי שיטות איון גן ממוקד גם פותחו, לסלול את הדרך לבחינת מועמדים גנים ארסיות ספציפית 12.

בעקבות הפנמה על ידי מקרופאגים מכתשיים, Coxiella משכפל למספרים גבוהים בתוך תא קרום נכנס כינת Coxiella- המכיל vacuole (CCV). CCV דורש סחר endocytic מארח הendosomes המוקדם והמאוחר הגס עד שהוא מבשיל לכדי אברון נגזר ליזוזום 13. לאורך כל התהליך הזה, CCV רוכש גורמים מארחים כי גם מופיעים זמני או להישאר הקשורים vacuole, לרבות, אך לא רק, Rab5, Rab7, CD63 ו LAMP-1 13-15. שכפול של Coxiella בתוך תאי מארחים תלוי לחלוטין מערכת הפרשה Dot מתפקדת במלואה / ICM סוג IVB (T4SS) 8,16,17. מערכת ההפרשה זהו מבנה רב-חלבון הקשורים אבותיהם של מערכות נטייה והוא משתרע הוא ממברנות חיידקי vacuolar לספק חלבונים חיידקיים, כינת effectors, לתוך הציטופלסמה המארח 18. Coxiella T4SS מבחינה פונקציונלית מאוד דומה היטב את המערכת מאופיינת סוג IVB Dot / הפרשת ICM של הלגיונלה pneumophila 19,20. מעניין לציין, כי הפעלת טרנסלוקציה מפעיל T4SS ולאחר אינה מתרחשת עד Coxiella מגיע ליזוזום הנגזרות חומציאברון, כ 8 שעות לאחר הפגיעה 17,21. נכון להיום, מעל 130 effectors Dot / ICM זוהה 9,17,22-24. רבי effectors אלה לשחק תפקידים חשובים סבירים בעת שכפול של Coxiella בתוך תאי מארחים; עם זאת, effectors רק כמה מתאפיינים תפקודי 25-29.

במחקר זה אנו מנצלים assay טרנסלוקציה הקרינה מבוססי המסתמכת על המחשוף של המצע CCF2-AM סריג (להלן המכונה המצע כלאם) באמצעות פעילות β-lactamase בתוך הציטופלסמה התא המארח (איור 1). הגן של עניין הוא התמזג TEM-1 β-lactamase (בום) על פלסמיד כתב המספק ביטוי מכונן. מצע כלאם מורכב משני fluorophores (coumarin ו והעמסה) יוצרות זוג סריג. עירור של תוצאות coumarin ב סריג של וההעמסה ו פליטת קרינה ירוקה בהעדר טרנסלוקציה מפעיל; עם זאת, אם בלהM-מפעיל חלבון היתוך הוא translocated לתוך הציטופלסמה המארחת, כתוצאת β-lactamase פעילות וחותכת את טבעת β-לקטם של מצע כלאם, הפרדת זוג הסריג לייצר פליטת קרינה כחולה הבאות עירור. Assay טרנסלוקציה זה הוכח גם כגישה לזהות חלבונים מפעיל מתוך מגוון רחב של חיידקים תאיים תאיים שונים, כולל ג burnetii, L. pneumophila, L. longbeachae, trachomatis כלמידיה, וחיידק E. coli, סלמונלה Brucella 17,30-35.

כדי לקבוע את התפקיד של גורמי מארח ספציפיים על טרנסלוקציה מפעיל Coxiella אנו מנצלים שיטה מבוססת היטב עבור להשתקת גנים המכונית התערבות RNA, ב RNA התערבות הקטן במיוחד (siRNA). במקור מזוהה elegans Caenorhabditis, התערבות RNA היא תהליך הסלולר אנדוגני משומר המשמש defe המולדNSE מפני וירוסים כמו גם ויסות הגנים 36,37. לאחר עקדת siRNA רצף ספציפי, השפלה של mRNA מתרחשת דרך RISC (מורכב השתקה המושרה RNA) וכתוצאה מכך להשתקת גנים ספציפיים או 38 מציאה. במחקר זה, siRNA שמש למקד שני חלבונים מארחים, Rab5A ו Rab7A, אשר הם רגולטורים חשובים של מסלול endocytic. ההשפעה של השתקת Rab5A ו Rab7A על טרנסלוקציה מפעיל הוברר באמצעות ג burnetii pBlaM-CBU0077. CBU0077 נבחרה כפי שהוא הוצג בעבר להיות translocated ידי מערכת הפרשת Dot / ICM Coxiella של 17.

ניצול הוא להשתקת גני siRNA ואת assay טרנסלוקציה fluorescencebased המתואר כאן, אנחנו מתחילים להקים לחיקוי עבור גורמי המארח טרנסלוקציה של חלבונים מפעילים ידי Coxiella. גישה זו ניתן ליישם במגוון רחב של שניהם חיידקים תאיים תאיים שיש להם secretio דומהמערכות n אחראיות טרנסלוקציה של חלבונים מפעילים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

הערה: כל הנהלים חוקר צמיחה או מניפולציה של Coxiella burnetii RSA439 NMII צריכות להתבצע בתוך רמת זיהום פיזית 2 מעבדה ובתוך ארון בטיחות ביולוגי בהתאם להנחיות מקומיות. תרשים סכמטי של זרימת העבודה assay transfection טרנסלוקציה הפוכה המתואר להלן מוצג באיור 2.

1. הכנת ג תרבות burnetii הבעת CBU0077 התמזגו בטא לקטמאז (pBlaM-CBU0077) (יום 1)

  1. כן 1X ACCM-2 6:
    1. מערבבים את המרכיבים המפורטים בטבלה 1. התאם ל- pH 4.75 עם 6 M NaOH לעקר מסנן (לא החיטוי). ACCM-2 יציב במשך כשלושה שבועות מאוחסנים 4 ° C.
  2. צור ג מניות pBlaM-CBU0077 burnetii.
    1. להדביק הלה 229 תאים עם ג זן burnetii נושאת pBlaM-CBU0077 ומעבר עד vacuol גדולes הם נצפו ברוב המכריע של תאים.
      1. לגדל את ג זן burnetii נושאת pBlaM-CBU0077 בתוך 20 מ"ל ACCM-2 3 מיקרוגרם / מ"ל chloramphenicol המכיל בבקבוק תרבות 75 ס"מ 2 רקמות עם כובע פרקו במשך 7 ימים ב 37 מעלות צלזיוס ב 5% CO 2, 2.5% O 2.
      2. צנטריפוגה ג burnetii pBlaM-CBU0077 התרבות ב 15,000 × גרם במשך 15 דקות ב RT.
      3. Re- להשעות גלולה ב 20 מ"ל DMEM + 10% נסיוב עגל עוברית (FCS) + 3 מיקרוגרם / מ"ל ​​chloramphenicol (מדיה תחזוקה). הסר מדיה מבקבוקון 2% ומחוברות 50 75 ס"מ של תאים 229 הלה. תוספת מחדש מושעה ג burnetii לתאים הלה 229. דגירה של 2 ימים על 37 מעלות צלזיוס 2 5% CO לאפשר זיהום של תאים 229 הלה להקים.
      4. פיצול תאים לתוך הבקבוק בתרבית רקמה 175 ס"מ 2.
        1. הסר מדיה מהבקבוק 75 ס"מ 2 ולשטוף בשכבה פעמיים עם מ"ל 10 מחומם מראש PBS.
        2. הוסף 1 מ"ל of 0.05% טריפסין-EDTA פתרון ומקום התאים ב 37 ° C + 5% CO 2 עבור 3 - 5 דקות כדי לנתק תאים.
        3. Re להשעות תאים 10 מ"ל של התקשורת תחזוקה. הוסף 2 מ"ל של תאים מחדש מושעה לתוך בקבוק 175 ס"מ 2 המכיל 38 מ"ל של התקשורת תחזוקה.
        4. לדגור על 37 מעלות צלזיוס ב 5% CO 2 למשך 3 נוסף - 5 ימים עד 100% confluency הוא הגיע vacuoles גדול הם נצפו.
    2. איסוף supernatant מהבקבוק 175 ס"מ 2, להוסיף 10 מ"ל DH 2 O כדי לכסות את התאים 229 הלה נגוע דגירה במשך 15 דקות כדי lyse התאים הנגועים.
    3. שלב supernatant ותאי lysed ו גלולה ב g 15,000 × במשך 15 דקות ב RT.
    4. Re- להשעות גלולה ב 10 מ"ל DH 2 O. Lyse תאים נוספת על ידי העברת מחדש ההשעיה שוב ושוב באמצעות מחט 23G מצורף מזרק 10 מ"ל לפחות פי 20. גלולה ב g 500 × במשך 5 דקות כדי להסיר פסולת הסלולר.
    5. הסר supernatant גלולה ב 15,000 × גרם במשך 15 דקות ב RT לאסוף ג burnetii.
    6. מחדש להשעות ג burnetii ב DMEM + 10% FCS ולכמת מספר החיידקים לפי 4. לדלל את 1 × 10 9 הגנום / ml באמצעות DMEM + 10 FCS% + 10% sulfoxide דימתיל (DMSO), מניות aliquot 50 μl לתוך צינורות microfuge ולאחסן ב -80 מעלות צלזיוס.
  3. לחסן 10 מ"ל של טרום התחמם chloramphenicol ACCM-2 המכיל 3 מיקרוגרם / מ"ל עם 20 μl של ג burnetii pBlaM-CBU0077 זן 17 (מתוך מניות שנוצרו 1.2 מאוחסן ב -80 מעלות צלזיוס) בבקבוק תרבות 25 סנטימטר 2 רקמות עם כובע פרקו. לגדול התרבות חיידקים למשך 7 ימים ב 37 מעלות צלזיוס ב 5% CO 2, 2.5% O 2.

2. Transfection ההפוך של siRNA וזריעה של הלה 229 תאים (יום 4)

  1. בעת שימוש siRNA הניסיון בפעם הראשונה להכיןsiRNA כדלקמן:
    1. בקצרה בצנטריפוגה siRNA lyophilized על מנת להבטיח כי גלולת siRNA נאספה בתחתית של התחתית.
    2. Re- להשעות את siRNA pelleted לריכוז מניות סופי של 20 מיקרומטר ידי pipetting הנפח המתאים של חיץ siRNA 1x (טבלה 2).
    3. פיפטה הפתרון מעלה ומטה 3 - 5 פעמים כדי לערבב ומניחים על מערבל מסלולית במשך 30 דקות ב RT, צינור היפוך כל 5 - 10 דקות.
    4. בקצרה צנטריפוגות צינור כדי להבטיח את siRNA נאסף בתחתית של התחתית.
    5. Aliquot siRNA לתוך 50 aliquots μl צינורות microfuge ולאחסן ב -20 ° C עד הנדרשים.
    6. כדי ליצור 1 מיקרומטר עובד ריכוז siRNA, פיפטה 950 μl של siRNA 1X חיץ לתוך המניה aliquot 50 μl (20 מיקרומטר) בעת הצורך. הערה: זה ריכוז 1 מיקרומטר עובד ניתן להקפיא מופשר מספר פעמים עבור transfections חזר.
  2. מניחים DMEM + 10% FCS,; 0.05% טריפסין-EDTA ו PBS באמבט מים 37 ° C (או שווה ערך) למשך 30 דקות כדי לחמם לפני השימוש.
  3. הכנת רכיבי transfection:
    ההערה: הפרוטוקול הבא כבר אופטימיזציה עבור הלה 229 תאי microplate 96-היטב עם קירות שחורים תחתית שטוחה, שקופה. אופטימיזציה של כמות מגיב transfection, ריכוז של siRNA וזריעת צפיפות של תאים עשויה להיות נחוצה עבור שורות תאים שונות.
    1. עבור כל טוב, השתמש 0.1 מגיבים transfection μl, 15.9 μl מופחת סרום בינוני (מדיה חיונית מינימאלית המשמשת transfections, עיין בטבלה של חומרים) ו -4 μl של 1 מיקרומטר siRNA (וכתוצאה מכך ריכוז siRNA סופי של 40 ננומטר). השתמש צינורות microfuge נפרד עבור OTP, PLK1, Rab5A ו Rab7A. מדוד כל תנאי assay בשלושה עותקים. דוגמה של פריסת צלחת 96-היטב מוצג באיור 3.
      הערה: פרוטוקול זה משלבת את השימוש שני פקדים: OTP ו PLK1. OTP הואמורכב siRNA ארבע וקיווה כי כבר מותאמת לצמצום השפעות מחוץ יעד ובכך OTP משמש כביקורת שלילית, ללא מיקוד. גם מקושקש siRNA יכול לשמש כביקורת שלילית. פסד של תוצאות ביטוי PLK1 במות תא נרחב בכמה שורות תאים על ידי גרימת מסלולים פרו-אפופטוטיים ולכן siRNA PLK1 משמש כביקורת חיובית עבור transfection שבו מות תא וקושר ליעילות transfection.
      1. עבור כל transfection siRNA הניסיון, לשלב 0.4 מגיבים transfection μl ו 63.6 μl מופחת סרום בינוני בצינור microfuge פרט. וורטקס כל צינורות microfuge ולאפשר רכיבים מורכבים במשך 5 דקות ב RT.
      2. להוסיף 16μl של siRNA כל ניסיוני אל הצינורות המקבילים microfuge המכילים את מורכבות transfection. וורטקס דגירה במשך 20 דקות ב RT. הערה: חשוב שלא יעלה על 30 דקות, כמו יעילות transfection יקטן.
  4. במהלך 20 דקות incubation (2.3.1.2) להוסיף 20 μl של מגיב transfection בינוני + סרום מופחת + siRNA לערבב לתוך הבארות המתאימות של מגש 96-היטב תחתון ברור שטוח, שחור סטרילי.
  5. ברגע תקופת דגירת 20 דקות יושלם, זרע הלה 229 תאים בצפיפות של 3.92 × 10 3 תאים / טוב.
    1. קציר הלה 229 תאים מתוך ומחוברות או תת-ומחוברות 75 ס"מ 2 בקבוק תרבות רקמה DMEM מראש חימם + 10% FCS מחדש להשעות התאים הצפיפות הסופית של 4.9 × 10 4 תאים / מ"ל לפי שיטות סטנדרטיות. כדי להבטיח transfection היעילה לא נפגעת, להכין תאים במהלך תקופת הדגירה 20 דקות (2.3.1.2).
      1. שטפו את בשכבה של הלה 229 התאים פעמיים עם 10 מ"ל של PBS מחומם מראש.
      2. הוסף 1 מ"ל של תמיסת 0.05% טריפסין-EDTA ומקום הלה 229 התאים ב 37 ° C + 5% CO 2 עבור 3 - 5 דקות כדי לנתק תאים.
      3. ולאסוף תאים 9 מ"ל של DMEM מחומם מראש + 10% FCס ספירת תאים באמצעות haemocytometer ולהכין תאי צפיפות סופית של 4.9 × 10 4 תאים / מיליליטר באמצעות DMEM + 10% FCS.
    2. פיפטה 80 μl של הלה 229 תאים בצפיפות של 4.9 × 10 4 תאים / מ"ל לבאר כל שמכילה את מגיב transfection + תערובת בינוני + siRNA מופחתת בסרום. זה מתאים צפיפות תאים של 3.92 × 10 3 תאים / טוב.
      הערה: חיסור רקע נדרש עבור מצע כלאם.
      1. אל תוסיף תאים או siRNA כדי "ריקות" בארות (איור 3). במקום זאת, הוסף 80 μl של DMEM + 10% FCS לבארות אלה להגדיר בשלושה עותקים.
    3. דגירה של 24 שעות ב 37 ° C + 5% CO 2.

3. מדיה שינוי (יום 5)

  1. לאחר 24 שעות, להסיר תקשורת באמצעות מתאם רב המחובר למקור ואקום או ידני עם טפטפת רב ערוצית, ולהחליף עם 100 μl של prewarm הטריed DMEM + 10% FCS.
  2. דגירה במשך שעה 48 נוסף על 37 מעלות צלזיוס + 5% CO 2.
  3. בשלב זה, לבדוק את הכדאיות של תאים באמצעות חזותי מיקרוסקופ אור רגילה. אם transfection ההפוכה הצליחה, מוות תאי משמעותי יקוים ב הבארות המכילות PLK1 siRNA לעומת OTP siRNA.

4. כימות הזנים Coxiella burnetii pBlaM-CBU0077 באמצעות qPCR (יום 7)

  1. לאחר 7 ימים של צמיחה ב ACCM-2 על 37 מעלות צלזיוס ב 5% CO 2, 2.5% O 2 (1.3), צנטריפוגה 10 מ"ל ג burnetii pBlaM-CBU0077 התרבות ב 15,000 × גרם במשך 15 דקות ב RT.
  2. Re- להשעות את גלולה חיידקי 10 מ"ל של טרום חימם DMEM + 10% FCS. כן 1:10 ו 1: 100 דילולים של התרבות (מדגם) באמצעות DH 2 O.
  3. הגדר את הרכיבים הנדרשים עבור qPCR.
    הערה: מיצוי gDNA יכול להתבצע מראש ולאחסן ב -20 ° C until הנדרש.
    1. הכנת תקנים:
      1. חלץ gDNA מ Coxiella burnetii RSA439 NMII זן סוג בר הגדלים ACCM-2 על 37 מעלות צלזיוס ב 5% CO 2, 2.5% O 2 למשך 7 ימים באמצעות ערכת חילוץ gDNA, לפי הוראות היצרן.
      2. מדדו את הריכוז gDNA (ז / μl) באמצעות Nanodrop (או שווה ערך) לעבר ספיגת של 260 ננומטר.
      3. חישוב מספר העותקים הגנום לכל μl באמצעות הנוסחה הבאה להלן, ולהמיר למספר של הגנום / מ"ל.
        figure-protocol-1
      4. התאם את מספר מ"ל / הגנום עד 10 9 / מ"ל (בנפח סופי של 100 μl) בצינור microfuge חדש באמצעות DH 2 O. זה יכול להיות מבושל במשך 10 דקות ומאוחסן ב -20 ° C עד נדרשים.
      5. ביום של הזיהום, לייצר 10 מתקפלים דילולים סידוריים של 10 מיליליטר 8 הגנום / 10 מיליליטר 5 הגנום / מן הגנום 10 9s / ml המלאי.
        1. פיפטה 10 μl של 10 9 הגנום / מ"ל לתוך 90 μl של DH 2 O לייצר 10 8 הגנום / מ"ל. וורטקס לערבב. פיפטה 10 μl של 10 8 הגנום / מ"ל לתוך 90 μl של DH 2 O לייצר 10 7 הגנום / מ"ל. וורטקס וחזור עד 10 מ"ל 5 הגנום /.
    2. הגדרת התגובה qPCR. צור תערובת אב 25 בארות לתת דין וחשבון על כל שגיאות pipetting. עבור כל טוב, השתמש 10 מיקס μl qPCR מאסטר; 2 μl של תערובת פריימר ompA (4.3.2.2) ו -3 μl של DH 2 O.
      הערה: OmpA הוא חלבון חיצוני-קרום של ג burnetii '39 וכן סעיף 82-בסיס-זוג בתוך אזור השמור ביותר נבחר לשימוש כמו בדיקה כפי שתואר לעיל 40.
      1. הגדרת כל תקן (DH 2 O, 10 5, 10 6, 10 7, 10 8, 10 9 הגנום / מ"ל) מדגם (1:10 ו 1: 100 דילול) בתוך 96 היטב PCR להנתק צלחת (לא מרופדת) בשני עותקים או בשלושה עותקים, בהתאמה. הוסף 5 μl של מדגם או רגיל לתוך הבארות המתאימות.
      2. שימוש DH 2 O, לדלל הן פריימר קדימה ompA (5'-CAGAGCCGGGAGTCAAGCT-3 ') ו ompA לאחור תחל (5'-CTGAGTAGGAGATTTGAATCGC-3') לריכוז סופי של 4 מיקרומטר ולשלב לתוך הצינור אותו microfuge.
        הערה: שילוב פריימר ompA ניתן להכין מראש ולאחסן ב -20 ° C עד הנדרשים.
      3. מערבבים 250 μl מיקס מאסטר qPCR, 50 μl תערובת פריימר ompA, 75 μl DH 2 O ו מערבולת לערבב. הוסף 15 μl של תמהיל אמן זה לבארות המכילות גם סטנדרטים או דוגמאות.
      4. מניח כמוסות רצועת 8-מכסת PCR על בארות המתאימים צנטריפוגות דופק צינורות PCR כדי לוודא שהכל נאספו בתחתית הצינורות.
      5. הגדר את התוכנית הבאה על ma PCR כמותיChine: 50 מעלות צלזיוס למשך 2 דקות, 95 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות, ואחריו 45 מחזורים של 95 מעלות צלזיוס במשך 1 שניות ו -60 מעלות צלזיוס למשך 20 שניות (איור 4 א).
    3. נתח את ה- CT (סף מחזור) ערכים מן qPCR:
      1. מעבירים את ערכי ה- CT כדי גיליון אלקטרוני באמצעות פונקציית הייצוא של התוכנית.
      2. צור scatterplot של התקנים 10 5 הגנום / מיליליטר עד 10 מיליליטר 9 הגנום / (מבוטא ערכי יומן). לבטל את כל חריגות ברורות בין הדגימות בשלושה עותקים. צור קו מגמת לוגריתמים ולקבוע את המשוואה של הגרף.
      3. חשב את המספר הכולל של הגנום / מיליליטר במדגם באמצעות המשוואה שנוצרה 4.3.3.2. אל תשכחו לתת דין וחשבון על הדילול הראשוני (1:10 ו 1: 100) של הדגימות.

5. תאים transfected זיהום של היפוך (יום 7)

  1. לאחר חישוב מ"ל / הגנום סך ג ספחתnetii pBlaM-CBU0077 תרבות לשמש זיהום, להתאים תרבית החיידקים מחדש מושעה להדביק תאים בכל משרד הפנים של 300 בנפח סופי של 50 μl / גם באמצעות prewarmed DMEM + 10% FCS.
    הערה: הצפיפות הצפויה של תאי הלה 229 זורעים עם זמן הכפלה רגיל לאחר 72 שעות היא 3.136 × 10 4 תאים / היטב. כמות החיידקים נדרש להדביק בכל משרד הפנים של 300 הוא 9.408 × 10 6 ב 50 μl, אשר משווה ל 1.88 × 10 8 מ"ל / חיידקים.
    1. בעזרת הערך שנמדד (ml / הגנום) qPCR (4.3.3.3), לדלל את החיידקים מחדש מושעה באמצעות FCS מראש חמם ​​DMEM + 10% בנפח סופי של 2 מיליליטר להדביק את תאי transfected ההפוכות.
  2. הסר את המדיה הקיימת מן ריק הפוך תאי transfected.
  3. הוסף 50 μl של החיידקים המדוללים (1.88 × 10 8 חיידקים / מיליליטר) כדי הבארות המתאימות. הוסף 50 μl של DMEM + 10% FCS הוא ריק uבארות ninfected.
  4. דגירה של 24 שעות ב 37 ° C + 5% CO 2.

תוספת 6. של כלאם מצע כדי לקבוע את הרמה של טרנסלוקציה (יום 8)

  1. הכן את הפתרונות לפתרון טעינת 6x המצע כלאם.
    הערה: פתרון A, B ו- C ניתן בתוך ערכת מצע כלאם (עיין בטבלה של חומרים). B פתרון עלול להיווצר משקע ב RT. לחמם את הפתרון הזה על 37 מעלות צלזיוס לפני השימוש ואת המשקע צריך לפזר.
    1. כאשר השימוש בערכה בפעם הראשונה, להוסיף 185 μl של DMSO (מסופק עם ערכת מצע כלאם) אל א הפתרון המיובש בהמשך, לאחסן את הפתרון מחדש מושעה ב -20 ° C.
    2. הכן פתרון 0.1 M Probenicid מראש ולאחסן 1 aliquots מ"ל ב -20 ° C עד לרגע השימוש.
      1. כן 0.4 M NaOH (1.6 גרם ב O 100 מיליליטר DH 2).
      2. כן 100 חיץ פוספט מ"מ Na pH 8 (1.56 גרם לאא 2 PO 4 .2H 2 O ו 1.41 גרם Na 2 HPO 4 O 100 מ"ל DH 2).
      3. ממיסים 1.25 גרם של Probenicid ב 22 מ"ל של 0.4 M NaOH ידי תסיסה נמרצת.
      4. להוסיף 22 מ"ל 100 במאגר פוספט מ"מ Na pH 8 (פתרון יהפוך מעונן) ומערבבים לפזר את המשקע שצורות.
      5. התאם את ה- pH עד 8 (במידת הצורך) באמצעות -1 M NaOH / HCl.
      6. מערבב נמרץ ומחממי מעטה (<50 מעלות צלזיוס) עד הפתרון הוא בעיקר ברור.
      7. מסנן (גודל נקבובי 0.2 מיקרומטר) ו aliquot ב 1 מיליליטר כרכים. aliquots חנות ב -20 ° C.
  2. עבור כל טוב, השתמש 0.06 μl פתרון, 0.54 B פתרון μl, 7.9 μl C פתרון ו -1.5 μl 0.1 M Probenicid. צור מיקס מאסטר עבור 30 בארות על ידי שילוב הראשון 1.8 μl של פתרון A ו- 16.2 μl של פתרון B יחד בתוך שפופרת microfuge. מערבב היטב בעזרת מערבולת. להוסיף 237 μl פתרון של C ו -45 μl של 0.1 M Probenicid. וורטקס לשלב כל components.
    הערה: הפתרון טעינת 6x יציב לתקופה של עד 4 שעות (בחשיכה) אבל צריכים להיות מוכנים קרוב ככל האפשר לפני השימוש.
  3. הוסף 10 μl של פתרון טעינת 6x ישירות לתוך כל הבארות ריקות הפוך טרנספקציה מבלי להסיר את המדיה הקיימת.
  4. דגירה את הצלחת על RT עבור 2 שעות בחושך.
  5. כדי לקבוע את רמת טרנסלוקציה, לכמת את כמות הקרינה באמצעות קורא microplate.
    שים לב: ההליך הבא הוא ספציפי קורא microplate ClarioSTAR. קוראי microplate Equivalent יכולים להיות מנוצלים גם.
    1. צור פרוטוקול עוצמת קרינה חדש באמצעות נקודת קצה כמצב הקריאה.
    2. כוונו את הפרמטרים הבסיסיים כדלקמן:
      1. בחר microplate 96-היטב.
      2. תחת הגדרות אופטיות, בחר 2 multichromatics עם הגדרות המוגדרים על ידי המשתמש הבא: (1) קלט 410-10 עירור ננומטר פליטת ננומטר 520-10. (2) קלט 410-10 עירור ננומטר 450-10 פליטה ננומטר. ודא היטב multichromatics נבחרה.
      3. בחר מיצוע מסלולית בקוטר של 3 מ"מ.
      4. תחת אופטי, בחר אופטי תחתון.
      5. תחת מהירות ודיוק, בחר מדויק. זה מתאים לשמונה אזורים לכל טוב.
    3. התאם את פריסת הצלחת על ידי בחירת הבארות המתאימות כמו דגימות.
    4. מדידת התחלה בחר.
    5. הסר את המכסה והנח את המגש לתוך קורא הצלחת. כדי למנוע מצב שבו יגיע ערכי קרינה מרביים, להבטיח את הערך הרווח מותאם. לשם כך, בצע התאמה רווחת באחת הבארות הנגועות כי כבר transfected הפוך עם siRNA OTP. זו תואמת את טרנסלוקציה הצפויה הגבוהה ביותר.
    6. מדידת ההתחלה בוחרת למדוד כל בארות המתאימים באמצעות קרינה תחתונה לעבר עירור של 410 ננומטר פליטה של ​​שני 450 ננומטר ו 520 ננומטר עבור קרינה כחולה וירוקה, בהתאמה.

7. ניתוח תוצאות:

  1. חשב את היחסשל 450 ננו-מטר ל 520 ננומטר (מכחול לירוק) עבור כל הדגימות הבאות הפחתה ריקה ולהביע יחסית מדגם OTP הנגוע.
    הערה: השלבים הבאים הניתוח מסופקים תכנית גיליונות אלקטרונית פשוטה.
    1. באמצעות פונקציית הייצוא על הקורא microplate, להעביר את ערכי הקרינה גלם המתקבלים עבור שני 520 ננומטר ו -450 ננומטר אורכי גל הפליטה (6.5) לתוך גיליון אלקטרוני.
    2. החישוב הממוצע של קריאות "ריקה" (מדיה בלבד, ללא תאים) עבור אורך גל 520 ננומטר על-ידי הוספת ערכי קרינת גלם 520 ננומטר וחלוקתו במספר הבארות (3). חזור באמצעות הערכים 450 ננומטר אורך גל הריק. ערכים אלה מייצגים את קרינת הרקע בשל הצלחת 96 היטב בתקשורת.
    3. הפחת את קרינת הרקע. באמצעות הערכים שהתקבלו ב 7.1.2 להפחית את הממוצע של אורך גל 520 ננומטר הריק מכל ערכי קרינת ננומטר מדגם 520. חזור על ערכים גל 450 ננומטר.
    4. כדי להשיג את 450: יחס ננומטר 520 להשתמש הערכים המתוקנים הריקים (7.1.3). מחלקים כל ערך קרינה מדגם 450 ננומטר על ידי שלה מקביל 520 ערך ננומטר.
    5. החישוב הממוצע של ערכי היחס OTP נגוע על ידי הוספת 450: ערכי יחס ננומטר 520 (מ 7.1.4) וחלוקתו במספר הבארות (3).
    6. חשב את היחס בין הדגימות ביחס נגוע OTP ידי חלוקת 450: יחס ננומטר -520 מחושב ב 7.1.4 על ידי הממוצע של ערך יחס OTP הנגוע מחושב ב 7.1.5.

תוספת 8. כתם גרעינים לקביעת מספר סלולרי לאחר Assay טרנסלוקציה (יום 8)

  1. בעקבות כימות של קרינה, סר מדיה המכילה פתרון טעינת 6x מכל הבארות או באמצעות מתאם רב ערוצית המחובר למקור ואקום או ידני באמצעות פיפטה רב ערוצים.
  2. הוסף 50 μl של 4% PFA (paraformaldehyde) פתרוןב PBS לכל הבארות המתאימות כדי לתקן תאים. לדגור על RT במשך 20 דקות.
  3. הסר 4% פתרון PFA PBS (לפי 8.1) ולשטוף תאים פעמיים עם 75 μl PBS של.
  4. הוסף 50 μl של כתם גרעיני חדיר תאים עבור DAPI למשל ( '4, 6-diamidino-2-phenylindole), זה טוב. לרכוש תמונות באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי ולכמת את מספר הגרעינים נוכחיים בכל טוב לאחר טיפול siRNA באמצעות תוכנת ניתוח תמונה מתאימה, כגון 41 ImageJ.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

לצורך המחקר הזה, ג burnetii זן pBlaM-CBU0077 נבחר CBU0077 הוכח בעבר להיות מפעיל translocated של מערכת הפרשת Coxiella Dot / ICM 17. לפני ההדבקה, המספר הכולל של ml / הגנום של ג שבעה ימים תרבות burnetii pBlaM-CBU0077 הייתה מנויים באמצעות qPCR. איור 4 מדגי דוגמא של סף המחזור (CT) ערכים צפויים משני תקני הדגימות הבאים qPCR. ערכי CT (המיוצגים בעלילת ההגברה (האיור 4B) ומספרית ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

מערכות הפרשה, ואת החלבונים מפעילים חיידק תחבורת מערכות אלה לתוך הציטופלסמה של תאי מארחים, הם מרכיב חשוב ארסיות שרב חיידקים פתוגניים לנצל להקים זיהום בתוך נישות בשכפול הדנ"א ייחודיות. ההתמקדות של קבוצות מחקר רבות כבר לחקור את יחסי הגומלין בין effectors חיידקי חלבונים מארחים ואת ההשפעה שיש effectors אלה על מסלולים הסלולר מארחים. מחקר מצומצם מאוד, אם בכלל, בדק את פוטנציאל חלבונים מארחים להיות הכרחיים עבור טרנסלוקציה מפעיל חיידק מוצלח.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

למחברים אין מה לחשוף.

תודות

עבודה זו נתמכה על ידי מענקי המועצה הלאומית לבריאות ומחקר רפואי (NHMRC) (מזהה מענק 1062383 ו-1063646) שהוענקו ל-HJN. EAL נתמך על ידי פרס אוסטרלי לתארים מתקדמים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
<חזק>ריאגנטים
חומצת לימוןסיגמאC0759ACCM-2 רכיב בינוני
נתרן ציטראטסיגמאS4641ACCM-2 רכיב בינוני
אשלגן פוספטסיגמא60218ACCM-2 רכיב בינוני
מגנזיום כלורידקלביוכימיה442611ACCM-2 בינוני רכיב
סידן כלורידסיגמאC5080ACCM-2 רכיב בינוני
ברזל גופרתיפישרS93248ACCM-2 רכיב בינוני
נתרן כלוריסיגמאS9625ACCM-2 רכיב בינוני
L-ציסטאיןסיגמאC6852ACCM-2 רכיב בינוני
Bacto-neopeptoneBD211681ACCM-2 בינוני רכיב
חומצות קסאמינופישרBP1424ACCM-2 רכיב בינוני
מתיל בטא ציקלודקסטריןסיגמאC4555ACCM-2 רכיב בינוני
RPMI + GlutamaxThermoFisher Scientific61870-036ACCM-2 רכיב בינוני
כלורמפניקולסיגמאC0378לתרבית חיידקים
ON-TARGETplus בקרה לא ממוקדת בריכה (OTP)DharmaconD-001810-10-05בקרה לא ממוקדת
siGENOME Human PLK1 (5347) siRNA - SMARTpoolDharmaconM-003290-01-005גורם למוות של תאים; מדד יעילות הטרנספקציה
siGENOME Human RAB5A (5968) siRNA - SMARTpoolDharmaconM-004009-00-0005
siGENOME Human RAB7A (7879) siRNA - SMARTpoolDharmaconM-010388-00-0005
5x מאגר siRNADharmaconB-002000-UB-100השתמש במים סטריליים ללא RNase כדי לדלל 5x מאגר siRNA למאגר siRNA 1x
DharmaFECT-1 Transfection ReagentDharmaconT-2001-01לטרנספקציה
Opti-MEM + GlutaMAXThermoFisher Scientific51985-034מדיום סרום מופחת המשמש לטרנספקציה
DMEM + GlutaMAXThermoFisher Scientific10567-014לתרבית תאים וזיהום
סרום עגל עוברי מומת בחום (FCS)Thermo ScientificSH30071.03יכול להשתמש במוצר שווה ערך חלופי
DMSOSigmaD8418לאחסון זן קוקסיאלה
PBSלתרבית תאים
0.05% טריפסין + EDTAThermoFisher Scientific25300-054לתרבית תאים
dH2Oלדילול דגימות ותקנים עבור qPCR
Quick-gDNA Mini PrepZYMO ResearchD3007יכול להשתמש במוצר שווה ערך חלופי כדי לחלץ gDNA
SensiFAST SYBR No-ROX KitBiolineBIO-98020יכול להשתמש במוצר qPCR מאסטר מיקס שווה ערך חלופי לתגובת qPCR
ערכת טעינה של LiveBLAzer FRET-B/G עם CCF2-AMInvitrogenK1032למדידת טרנסלוקציה באמצעות פלואורסצנטיות ויצירת תמיסת הטעינה 6X (מכילה תמיסה A, B, C ו-DMSO)
נתרן הידרוקסידMerck106469רכיב תמיסה Probenicid
נתרן פוספט מונו-בסיסיSigma71505רכיב תמיסת Probenicid
di-נתרן מימן אורתופוספטMerck106586Probenicid רכיב
ProbenicidSigmaP8761רכיב תמיסת Probenicid
DRAQ5 תמיסת בדיקה פלואורסצנטית (5 מ"מ)ThermoFisherScientific62251צבע גרעינים לקביעת חיוניות התא. השתמש ב-1:4000 מדולל ב-PBS. 
תמיסת 4% PFA (paraformaldehyde) ב-PBSSigmaP6148תמיסת קיבוע לתאי HeLa 229
תרבית רקמות 25 ס"מ2 עם מכסה מאווררCorning430639לגידול זן חיידקים
96 Well Flat Clear תחתית פוליסטירן שחור מטופל TC, עטוף בנפרד, עם מכסה,קורנינג3603
בקבוק תרבית רקמות 75 ס"מ2 עם מכסה מאווררCorning430641לגידול תאי HeLa 229
175 ס"מ2 בקבוק תרבית רקמות עם מכסה מאווררCorning431080לגידול תאי HeLa 229
Haemocytometerלכימות תאי HeLa 229
Tear-A-Way 96 Well PCR לוחות4titude4tiude 4ti-0750/TAעבור qPCR תגובה
8-שרשרת מכסה, שטוחהSarstedt65.989.002עבור תגובת qPCR
שם<חזק>חברהמספר קטלוגיComments
Equipment
bench top microfuge
ספסל עליון מערבולת
אורביטלית מערבל
צנטריפוגהEppendorf5810 Rלגלולה תרבית חיידקים
Nanodropלכימות gDNA
Mx3005P QPCR מכונתAligent Technologies401456לכימות גנום קוקסיאלה בתרבית 7 ימים
ClarioSTAR microplate קוראBMG LabTechלמדידת פלואורסצנטיות
בקבוק סטרילי

מקורות

  1. Delsing, C. E., Warris, A., Bleeker-Rovers, C. P. Q fever: still more queries than answers. Adv Exp Med Biol. 719, 133-143 (2011).
  2. Delsing, C. E., Kullberg, B. J., Bleeker-Rovers, C. P. Q fever in the Netherlands from 2007 to. Neth J Med. 68, 382-387 (2010).
  3. van der Hoek, W., et al. Epidemic Q fever in humans in the Netherlands. Adv Exp Med Biol. 984, 329-364 (2012).
  4. Madariaga, M. G., Rezai, K., Trenholme, G. M., Weinstein, R. A. Q fever: a biological weapon in your backyard. Lancet Infect Dis. 3, 709-721 (2003).
  5. Hoover, T. A., Culp, D. W., Vodkin, M. H., Williams, J. C., Thompson, H. A. Chromosomal DNA deletions explain phenotypic characteristics of two antigenic variants, phase II and RSA 514 (crazy), of the Coxiella burnetii nine mile strain. Infect Immun. 70, 6726-6733 (2002).
  6. Omsland, A., et al. Isolation from animal tissue and genetic transformation of Coxiella burnetii are facilitated by an improved axenic growth medium. Appl Environ Microbiol. 77, 3720-3725 (2011).
  7. Omsland, A., et al. Host cell-free growth of the Q fever bacterium Coxiella burnetii. Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 4430-4434 (2009).
  8. Beare, P. A., et al. Dot/Icm type IVB secretion system requirements for Coxiella burnetii growth in human macrophages. MBio. 2, e00175-e00111 (2011).
  9. Chen, C., et al. Large-scale identification and translocation of type IV secretion substrates by Coxiella burnetii. Proc Natl Acad Sci U S A. 107, 21755-21760 (2010).
  10. Voth, D. E., et al. The Coxiella burnetii cryptic plasmid is enriched in genes encoding type IV secretion system substrates. J Bacteriol. 193, 1493-1503 (2011).
  11. Beare, P. A., Sandoz, K. M., Omsland, A., Rockey, D. D., Heinzen, R. A. Advances in genetic manipulation of obligate intracellular bacterial pathogens. Front Microbiol. 2, 97(2011).
  12. Beare, P. A., Larson, C. L., Gilk, S. D., Heinzen, R. A. Two systems for targeted gene deletion in Coxiella burnetii. Appl Environ Microbiol. 78, 4580-4589 (2012).
  13. Howe, D., Shannon, J. G., Winfree, S., Dorward, D. W., Heinzen, R. A. Coxiella burnetii phase I and II variants replicate with similar kinetics in degradative phagolysosome-like compartments of human macrophages. Infect Immun. 78, 3465-3474 (2010).
  14. Heinzen, R. A., Scidmore, M. A., Rockey, D. D., Hackstadt, T. Differential interaction with endocytic and exocytic pathways distinguish parasitophorous vacuoles of Coxiella burnetii and Chlamydia trachomatis. Infect Immun. 64, 796-809 (1996).
  15. Romano, P. S., Gutierrez, M. G., Beron, W., Rabinovitch, M., Colombo, M. I. The autophagic pathway is actively modulated by phase II Coxiella burnetii to efficiently replicate in the host cell. Cell Microbiol. 9, 891-909 (2007).
  16. Beare, P. A. Genetic manipulation of Coxiella burnetii. Adv Exp Med Biol. 984, 249-271 (2012).
  17. Carey, K. L., Newton, H. J., Luhrmann, A., Roy, C. R. The Coxiella burnetii Dot/Icm system delivers a unique repertoire of type IV effectors into host cells and is required for intracellular replication. PLoS Pathog. 7, e1002056(2011).
  18. Segal, G., Shuman, H. A. Possible origin of the Legionella pneumophila virulence genes and their relation to Coxiella burnetii. Mol Microbiol. 33, 669-670 (1999).
  19. Zamboni, D. S., McGrath, S., Rabinovitch, M., Roy, C. R. Coxiella burnetii express type IV secretion system proteins that function similarly to components of the Legionella pneumophila Dot/Icm system. Mol Microbiol. 49, 965-976 (2003).
  20. Zusman, T., Yerushalmi, G., Segal, G. Functional similarities between the icm/dot pathogenesis systems of Coxiella'burnetii and Legionella pneumophila. Infect Immun. 71, 3714-3723 (2003).
  21. Newton, H. J., McDonough, J. A., Roy, C. R. Effector Protein Translocation by the Coxiella burnetii Dot/Icm Type IV Secretion System Requires Endocytic Maturation of the Pathogen-Occupied Vacuole. PLoS One. 8, e54566(2013).
  22. Lifshitz, Z., et al. Computational modeling and experimental validation of the Legionella and Coxiella virulence-related type-IVB secretion signal. Proc Natl Acad Sci U S A. 110, E707-E715 (2013).
  23. Voth, D. E., et al. The Coxiella burnetii ankyrin repeat domain-containing protein family is heterogeneous, with C-terminal truncations that influence Dot/Icm-mediated secretion. J Bacteriol. 191, 4232-4242 (2009).
  24. Weber, M. M., et al. Identification of C. burnetii type IV secretion substrates required for intracellular replication and Coxiella-containing vacuole formation. J Bacteriol. , (2013).
  25. Klingenbeck, L., Eckart, R. A., Berens, C., Luhrmann, A. The Coxiella burnetii type IV secretion system substrate CaeB inhibits intrinsic apoptosis at the mitochondrial level. Cell Microbiol. 15 (4), 675-678 (2013).
  26. Larson, C. L., Beare, P. A., Howe, D., Heinzen, R. A. Coxiella burnetii effector protein subverts clathrin-mediated vesicular trafficking for pathogen vacuole biogenesis. Proc Natl Acad Sci U S A. 110, E4770-E4779 (2013).
  27. Luhrmann, A., Nogueira, C. V., Carey, K. L., Roy, C. R. Inhibition of pathogen-induced apoptosis by a Coxiella burnetii type IV effector protein. Proc Natl Acad Sci U S A. 107, 18997-19001 (2010).
  28. Newton, H. J., et al. A screen of Coxiella burnetii mutants reveals important roles for Dot/Icm effectors and host autophagy in vacuole biogenesis. PLoS Pathog. 10, (2014).
  29. Pan, X., Luhrmann, A., Satoh, A., Laskowski-Arce, M. A., Roy, C. R. Ankyrin repeat proteins comprise a diverse family of bacterial type IV effectors. Science. 320, 1651-1654 (2008).
  30. Charpentier, X., Oswald, E. Identification of the secretion and translocation domain of the enteropathogenic and enterohemorrhagic Escherichia coli effector Cif, using TEM-1 beta-lactamase as a new fluorescence-based reporter. J Bacteriol. 186, 5486-5495 (2004).
  31. de Felipe, K. S., et al. Legionella eukaryotic-like type IV substrates interfere with organelle trafficking. PLoS Pathog. 4, e1000117(2008).
  32. de Jong, M. F., Sun, Y. H., den Hartigh, A. B., van Dijl, J. M., Tsolis, R. M. Identification of VceA and VceC, two members of the VjbR regulon that are translocated into macrophages by the Brucella type IV secretion system. Mol Microbiol. 70, 1378-1396 (2008).
  33. Raffatellu, M., et al. Host restriction of Salmonella enterica serotype Typhi is not caused by functional alteration of SipA, SopB, or SopD. Infect Immun. 73, 7817-7826 (2005).
  34. Wood, R. E., Newton, P., Latomanski, E. A., Newton, H. J. Dot/Icm Effector Translocation by Legionella longbeachae Creates a Replicative Vacuole Similar to That of Legionella pneumophila despite Translocation of Distinct Effector Repertoires. Infect Immun. 83, 4081-4092 (2015).
  35. Mueller, K. E., Fields, K. A. Application of beta-lactamase reporter fusions as an indicator of effector protein secretion during infections with the obligate intracellular pathogen Chlamydia trachomatis. PLoS One. 10, (2015).
  36. Agrawal, N., et al. RNA interference: biology, mechanism, and applications. Microbiol Mol Biol Rev. 67, 657-685 (2003).
  37. Fire, A., et al. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature. 391, 806-811 (1998).
  38. Lam, J. K., Chow, M. Y., Zhang, Y., Leung, S. W. siRNA Versus miRNA as Therapeutics for Gene Silencing. Mol Ther Nucleic Acids. 4, e252(2015).
  39. Martinez, E., Cantet, F., Fava, L., Norville, I., Bonazzi, M. Identification of OmpA, a Coxiella burnetii protein involved in host cell invasion, by multi-phenotypic high-content screening. PLoS Pathog. 10, e1004013(2014).
  40. Jaton, K., Peter, O., Raoult, D., Tissot, J. D., Greub, G. Development of a high throughput PCR to detect Coxiella burnetii and its application in a diagnostic laboratory over a 7-year period. New Microbes New Infect. 1, 6-12 (2013).
  41. Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat Methods. 9, 671-675 (2012).
  42. Prashar, A., Terebiznik, M. R. Legionella pneumophila: homeward bound away from the phagosome. Curr Opin Microbiol. 23C, 86-93 (2014).
  43. McDonough, J. A., et al. Host Pathways Important for Coxiella burnetii Infection Revealed by Genome-Wide RNA Interference Screening. MBio. 4 (1), e00606-e00612 (2013).
  44. Farfan, M. J., Toro, C. S., Barry, E. M., Nataro, J. P. Shigella enterotoxin-2 is a type III effector that participates in Shigella-induced interleukin 8 secretion by epithelial cells. FEMS Immunol Med Microbiol. 61, 332-339 (2011).
  45. Al-Khodor, S., Price, C. T., Habyarimana, F., Kalia, A., Abu Kwaik, Y. A Dot/Icm-translocated ankyrin protein of Legionella pneumophila is required for intracellular proliferation within human macrophages and protozoa. Mol Microbiol. 70, 908-923 (2008).
  46. Geddes, K., Worley, M., Niemann, G., Heffron, F. Identification of new secreted effectors in Salmonella enterica serovar Typhimurium. Infect Immun. 73, 6260-6271 (2005).
  47. Sory, M. P., Boland, A., Lambermont, I., Cornelis, G. R. Identification of the YopE and YopH domains required for secretion and internalization into the cytosol of macrophages, using the cyaA gene fusion approach. Proc Natl Acad Sci U S A. 92, 11998-12002 (1995).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

גלה מאמרים נוספים

בדיקת FRETהשתקת Rab5Aהשתקת Rab7Aרפורטר BlaMאינטראקציה בין מאחס לפתוגןמיקרוביולוגיה תאיתמדידת פלואורסצנציה
החלת העברת אנרגית תהודת קרינה (סריג) לבחינת יעילות טרנסלוקציה מפעיל ידי
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.