Method Article

ניתוח של המוח המיטוכונדריה באמצעות מיקרוסקופ סידורי בלוק פן אלקטרונים סורק

DOI:

10.3791/54214

⸱

July 9th, 2016

 ,  ,  ,  ,  , 
1Virginia Tech Carilion Research Institute, 2Renovo Neural Incorporated

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הדמיה וניתוח מיטוכונדריאלי מרקמת מוח של יונקים היא משימה מאתגרת. כאן, אנו מתארים כיצד ניתן להשתמש בניתוח שחזור תלת מימדי (תלת מימד) ממיקרוסקופ אלקטרונים סורק בלוק סדרתי (SBFSEM) כדי לקבל תובנות על הניתוח המורפולוגי והנפחי של אברון ייצור אנרגיה קריטי זה.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המוח האנושי הוא איבר זוללי אנרגיה אנרגיה שמסתמכת בעיקר על גלוקוז כמקור דלק. גלוקוז catabolized ידי המיטוכונדריה במוח באמצעות הגליקוליזה, חומצה תלת-קרבוקסיליות (TCA) זירחון מחזור חמצוני (OXPHOS) מסלולים לייצר את האנרגיה בתאים בצורת אדנוזין אדנוזין (ATP). ירידת ערך של ייצור ATP במיטוכונדריה גורמת להפרעות המיטוכונדריה, המציגי קליני עם תסמינים נוירולוגיים myopathic בולטים. פגמים מיטוכונדריאלי נוכחים גם הפרעות התפתחותיות (הפרעת ספקטרום האוטיזם למשל) והפרעות ניווניות (למשל amyotrophic טרשת לרוחב, אלצהיימר ופרקינסון). לפיכך, יש התעניינות מוגברת בתחום לביצוע ניתוח 3D של מורפולוגיה המיטוכונדריה, מבנה והפצה הן לפי מדינות בריאות מחלה. מוח המורפולוגיה המיטוכונדריה היא מגוונת מאוד, עם כמה המיטוכונדריה במיוחד אלההאזור הסינפטי להיות בטווח של קוטר <200 ננומטר, שהוא מתחת לגבול הרזולוציה של מיקרוסקופ אור המסורתית. הבעת חלבון פלואורסצנטי ירוק mitochondrially במיקוד (GFP) במוח מגביר באופן ניכר את זיהוי organellar ידי מיקרוסקופיה confocal. עם זאת, זה לא להתגבר על אילוצים על הרגישות של זיהוי של המיטוכונדריה בגודל קטן יחסית ללא oversaturating התמונות של המיטוכונדריה גדול בגודל. בעוד במיקרוסקופ אלקטרונים הילוכים סדרתי שימש בהצלחה לאפיין המיטוכונדריה ב הסינפסה העצבית, טכניקה זו היא מאוד זמן רב במיוחד כאשר משווים דגימות מרובות. מיקרוסקופיה אלקטרונים סורקים סדרה לחסום פנים (SBFSEM) הטכניקה כוללת בתהליך אוטומטי של חתך, בלוקי הדמיה של רכישת רקמות ונתונים. כאן, אנו מספקים פרוטוקול לבצע SBFSEM של אזור מוגדר מהמוח מכרסם לשחזר במהירות ולדמיין מורפולוגיה המיטוכונדריה. טק זהnique יכול לשמש גם כדי לספק מידע מדויק על מספר המיטוכונדריה, נפח, גודל והפצה באזור המוח מוגדר. מאז רזולוציית התמונה המתקבלת היא גבוהה (בדרך כלל פחות מ -10 ננומטר) פגמים מורפולוגיים ברוטו המיטוכונדריה יכול גם להתגלות.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המיטוכונדריה הם אברונים דינמיים אשר משנים את צורתם ומיקומם תלוי רמזים הסלולר וצרכימים, באינטראקציה הדוקה עם שלד תא תא, ובתגובה לאירועים סלולריים כמו זרמי סידן בנוירונים 1. המיטוכונדריה גם אינטראקציה עם אברונים תאיים אחרים למשל reticulum endoplasmic, אשר בתורו מסדיר הדינמיקה שלהם המטבוליזם 2. מורפולוגיה מיטוכונדריאלי מראה ההטרוגניות של סוגי תאים שונים כלומר. את הצורה של אברון משתנית צינורי לזה מורכב יריעות, צקי אליפסות 3. הוכח כי חלבוני מחזור היתוך וביקוע המיטוכונדרי יכולים לווסת את המיקום, גודל, צורה והפצה של המיטוכונדריה 4. יתר על כן, שינויים בצורת המיטוכונדריה המשויכים ניווניות של מערכת עצבים, פלסטיות עצבית, ניוון שרירים, איתות סידן, דור מיני חמצן תגובתי כמו גם תוחלת חיים ומות תא להפליל that תא ספציפי מורפולוגיה המיטוכונדריה היא קריטית לשמירה על תפקוד סלולארי רגיל 5-11.

פונקצית bioenergetic גדולה של המיטוכונדריה היא ליצור אדנוזין אדנוזין (ATP) על ידי ביצוע סדרה של תגובות מטבוליות שכוללות פירוט מלא של חומרי הזנה (גלוקוז כלומר, חומצות-שומן או אמינו חומצות) דרך מחזור TCA ו OXPHOS מסלולי 12. המוח האנושי מהווה רק 2% ממשקל הגוף אולם היא צורכת ~ 20% מהאנרגיה הכוללת המיוצר מה שהופך אותו באנרגיה מאוד תובעני איבר 13. לכן זה לא מפתיע כי תפקוד המיטוכונדריה בבני האדם מוביל למספר רב של ביטויי נוירולוגיות 14-17. מוטציות גנטיות רכיבי OXPHOS הפוגעות מובילים דור ATP להפרעות המיטוכונדריה 17,18, אשר הן קבוצה הטרוגנית קליני של הפרעות עם שכיחות של ~ 1: 5,000 אנשים, ואחד הגורם השכיח ביותר של מ 'פרעות etabolic אצל ילדים ומבוגרים. גירעון של ATP נגזרות המיטוכונדריה משפיע על מערכות איברים מרובות עם איברים בדרישת אנרגיה גבוהה כגון מוח, לב ושרירי שלד להיות מושפעים בעיקר בחולים אלו 14,17,18. בשנים האחרונות, מחקרים רבים סיפקו ראיות תפקוד המיטוכונדריה הן הפרעות התפתחותיות ו ניווניות 15-17,19,20. מאז המיטוכונדריה חיוני קריטיים להתפתחות המוח ותפקודו, קיים הכרח לפתח פרוטוקולים שיכולים לנתח שינויים במורפולוגיה המיטוכונדריה מוח, מבנה, גודל, מספר והפצה תחת שני המדינות בריאות וחולות. מודלים עכבר עם חלבון פלואורסצנטי ירוק mitochondrially במיקוד (GFP) הופקו לדמיין תנועות המיטוכונדריה ולוקליזציה במוח 21,22. אמנם זה הוא כלי שימושי מאוד לבחון תנועתיות המיטוכונדריה והפצה כללית, ישנם כמה חסרונות אשר includדואר רזולוציה מוגבלת ורגישות של מיקרוסקופ פלואורסצנטי. תכונות אלה מקשות לעקוב אחר המיטוכונדריה בגודל קטן יחסית. באופן דומה, מיקרוסקופי אלקטרוני הילוכי סדר נוצל בהצלחה כדי להציג המיטוכונדריה הסינפטי 23, אך שיטה זו היא זמן רב מאוד. מורפולוגיה מיטוכונדריאלי ידועה להיות מאוד דינמי כפי שהם עוברים מחזורי ביקוע ואיחוי רציפים, וברוב התאים המיטוכונדריה לשמור על רשת מחוברת ביותר 24-26. נוירונים ביותר מקוטבים תאים דנדריטים עם מרובי אקסונים מורחבים, ואת המיטוכונדריה יוצר רשת רשתי המחובר בגוף התא ייתכן שיהיה צורך להפריד כפי שהם עושים את דרכם דרך neurites אלה (איור 1). זה עושה המיטוכונדריה המוח מאוד מגוונת בגודל ובצורה. לדוגמה, באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים סורק לחסום פנים סדרתי (SBFSEM) טכניקה, צפינו בעבר כי ההבדל בהיקף או גודל mitochondr extrasynapticIA למיטוכונדריה נוכחים במסופים העצבים יכול להיות הרבה כמו שש עשר לקפל 27.

קיימות מספר גישות לביצוע נפח מנתח 28, הכולל TEM סעיף סדר 29, קלטת אוטומטית איסוף ultramicrotome 30 SEM, ממוקד אלומת יוני SEM 31, ו SBFSEM 32. ניתוח SBFSEM יש יתרונות בכך שהיא כוללת את הרזולוציה כדי לספק נתונים כמותיים על הצורה, גודל מורפולוגיים, הפצת מספר אברונים כגון המיטוכונדריה באזורים עד 1 מ"מ של המוח. המבצע הטכני הוא גם הכי פחות תובעני, עם רכישת נתונים וניתוח במסגרת היכולות של מעבדות ביולוגיות רבות שאין להן ניסיון EM קודם. הופעתו של מכשירים מסחריים להפקת תמונות בסעיף דמוי סדרתי עשתה ניתוח ultrastructural 3D של רקמות טכניקה שיגרתית, אשר נוסף מאפשרת ניתוח volumetric משוחד בצורה מהירה דיר 28 . SBFSEM תואר לראשונה והשתמש בתחום הנוירוביולוגיה בשנת 2004 32, על בסיס רעיון הוצג על ידי לייטון בשנת 1981 33. מחקרים רבים מאז הקים טכניקה זו ככלי מרכזי בניתוח שחזור של מעגלים עצביים 34. יתר על כן, עבור פרויקטים בקנה מידה הרבה יותר קטן, הוא מספק ניתוח שחזור לזהות אברונים הסלולר 27,35-39. מאז, התמונות רכשו נגזרות אלקטרוני פיזור בחזרה מתח נמוך, פרוטוקולים מכתימים חדשים המשלבים טכניקות מכתימות מתכות כבדות ידועות שונות פותחו כדי להגדיל את הרזולוציה 40.

במאמר זה, אנו מספקים פרוטוקול עבור ניצול הדמיה במיקרוסקופ אלקטרונים 3D וניתוח נפח של המיטוכונדריה במוח מבוסס על שיטות שבעבר שימשו על ידינו ואחרים 38,39,41. השיטות שלאחר עיבוד רקמות משמש תוארו בעבר על ידי Deerinck ואח40.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

משפט ואתיקה: הנהלים הקשורים בנושאים בעלי חיים אושרו על ידי ועדת טיפול בבעלי חיים מוסדיים השתמש (IACUC) באוניברסיטת וירג'יניה טק.

זהירות: אמצעי זהירות קיצונית יש לנקוט בעת טיפול והשלכת מספר מרכיבים בשימוש בפרוטוקול זה. לפני השימוש, מקומיים הנחיות מוסדיות ושיטות בריאות ובטיחות חייבים יוקמו אחריו, במיוחד עבור tetroxide אוסמיום, אשר תנודתי רעילה במיוחד תצטט uranyl, שהוא גם מתכות כבדות ומקור הרדיואקטיביות, וחנק עופרת, שהוא רעל מתכות כבד. Thiocarbohydrazide (TCH) יכול לפרק לייצר גזים נפיצים ורעילים, אם טיפל באופן שגוי. מוסדות רבים יצטרכו מתקן הליבה EM שבו ריאגנטים אלה מנוצלים באופן שגרתי והוא יכול לספק סיוע.

1. הכנת רקמת המוח והדמיה SBFSEM

  1. להרדים צעיר - עכבר שחור C57 (~ 2 בן 4 חודשים) (זן C57BL / 6-י) באמצעות 4 - 5% isoflurane בעקבות ההנחיות המוסדיות. אשר הרדמה על ידי ניטור אובדן טונוס שרירים, חוסר תנועות רצוניות ותגובות גירויים מרתיעים כמו קמצוץ זנב.
  2. הצמד את העכבר על מגש לנתיחה ולעשות חתך בעור לאורך קו אמצע גחון. ודא חתכים נוספים בעור לחשוף את החזה של העכבר. לחתוך את הסרעפת, ובזהירות לנתח את חלל בית החזה לאורך בפריפריה כדי לחשוף את הלב הפועם, ולאחר מכן לבצע חתך על העלייה הימנית.
  3. באמצעות צינורית פרפר, cannulate החדר השמאלי. Perfuse העכבר transcardially באמצעות 10 - 20 מ"ל של חיץ מלוחים פוספט (PBS) pH 7.2, עד exsanguination אושר על ידי שינוי צבע של הכבד.
    הערה: שינוי הצבע של כבד משמש כמדריך כדי לקבוע את מידת exsanguination. ודאו שינויי צבע כבד מפני חום אדמדם חיוורים ורודים.
  4. Perfuse העכבר transcardially באמצעות 10 - 20 מ"ל של 2% glutarאלדהיד ו -4% paraformaldehyde שנעשה חיץ 0.10 M cacodylate (7.2 pH), כדי לתקן את רקמת המוח במהירות מבפנים. קיבוע מנוטר על ידי התבוננות התקשות הזנב.
    הערה: הכן 0.10 M cacodylate חיץ (pH 7.2) על ידי המסת 2.14 גרם של cacodylate נתרן 80 מ"ל מים, להוסיף חומצה הידרוכלורית כדי להתאים את ה- pH, ולהפוך את נפח 100 מ"ל עם מים.
  5. בעקבות זלוף, לערוף את העכבר, לנתח את המוח, ואחריו קיבעון חיץ 0.10 M נתרן cacodylate (7.2 pH) המכיל glutaraldehyde 2% ו -4% paraformaldehyde למשך 48 שעות ב 4 o C.
  6. לאחר 48 שעות לעשות 400 חלקים העטרה מיקרומטר באמצעות vibratome ואז בזהירות לנתח את האזור של עניין במוח (למשל, בהיפוקמפוס) תחת המיקרוסקופ לנתיחה 42. בזהירות לחתוך את הרקמה ולצלם תמונה לשימורי אורינטציה.
    הערה: הודעת שיטות עיבוד של מכתים רקמות SBFSEM משלבת מגוון של שיטות מכתימות מתכות כבדותכדי לשפר את הרזולוציה ומבוססים על השיטה שפותחה בעבר על ידי Deerinck ואח 40.
  7. שטוף את הרקמות קבועות glutaraldehyde 3 פעמים, 5 דקות כל אחד 0.1 M cacodylate חיץ (pH 7.2).
  8. כן פתרון חומצה טאני 0.1% על ידי המסת חומצת טאני ב 0.1 M נתרן cacodylate חיץ (pH 7.2). מערבולת עד שהיא נמסה ולסנן דרך 0.45 מיקרומטר מסנן, במידת הצורך.
  9. Postfix הרקמות עם cacodylate שנאגרו 0.1% חומצה טאני ידי דוגרים מגיב 1 מ"ל עבור 30 - 60 דקות ב RT.
    הערה: זמן הדגירה תלוי בגודל רקמות, אבל 30 דקות עובדות הכי טובות ברוב הרקמות.
  10. לשטוף רקמות 3 פעמים, 5 דקות כל אחד ב חיץ cacodylate (pH 7.2).
  11. ממיסים פרוציאני אשלגן 0.3 גרם 0.86 גרם נתרן cacodylate ב 10 מ"ל מזוקקים H 2 O (DH 2 O). שמור את הפתרון פרוציאני אשלגן על הקרח. רק לפני השימוש, מוסיפים 10 מ"ל של 4% tetroxide אוסמיום (OSO 4).
  12. כתם הרקמות עם 2% osפתרון mium-פרוציאני במשך 90 דקות, על הקרח. לשטוף 3 פעמים, 5 דקות כל אחד ב DH 2 O.
  13. הכן 1% thiocarbohydrazide פתרון (TCH) על ידי המסת 0.1 גרם TCH ב 10 מ"ל DH 2 O. ממיסים ב 60 ° C על ידי מתערבל כל 10 דקות עד להמסה מלאה. שימו לב להוראות הבטיחות בזמן הטיפול TCH, במיוחד לטפל כדי למנוע שימוש של מתכות, חימום לטמפרטורה גבוהה, או פתרון המאפשר להתייבש.
  14. פנק את הדגימות עם 1 מוכן טרי% TCH במשך 20 דקות ב RT. לשטוף 3 פעמים, 5 דקות כל אחד ב DH 2 O.
  15. לדלל 4% OSO 4 ל -2% עם DH 2 O, רקמות הכתם עם tetroxide אוסמיום מימית 2% על ידי דוגרים במשך שעה 1. לשטוף רקמות 3 פעמים, 5 דקות כל אחד עם DH 2 O.
  16. דגירה דגימות O / N ב אצטט uranyl 1% ב DH 2 O על 4 מעלות צלזיוס.
  17. כן פתרון aspartate יתרון וולטון (כפי שתואר על ידי Deerinck ואח 40).
    1. ממיסים 0.998 גרם L-Aspartate ב 250 מ"ל DH 2 Oולאחר מכן להוסיף 10 N אשלגן הידרוקסידי (KOH) באופן dropwise עד pH מגיע 5.5. לאחר תקנון pH, להוסיף 0.066 גרם של חנקת הובלה 10 מיליליטר אספרטית מניות חומצה וחומה עד 60 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות.
  18. לשטוף רקמות ב DH 2 O ו דגירה עם כתם aspartate יתרון וולטון למשך 30 דקות בתנור C 60 °. לשטוף 3 פעמים, 5 דקות כל אחד ב DH 2 O.
  19. מייבשי דגימות באמצעות סדרה של אלכוהול עבורן באמצעות פתרונות צוננים של 20%, 50%, 75%, 85% אתנול 95% במשך 5 דקות כל אחד, ואחריו 100% אתנול 3 פעמים, 10 דקות כל אחד.
    הערה: השתמש 100% אתנול מבקבוק טרי נפתח, כמו אתנול נפתחה סופג מים מהאוויר ולגרום הטבעה להיכשל. incubations יותר יהיה צורך עם דגימות רקמה גדולות.
  20. לשטוף דגימות 2 פעמים, 15 דקות כל אחד ב פרופילן אוקסיד.
  21. הפוך שרף הטבעה פלסטיק באמצעות שרף 25 מ"ל, 10.5 מ"ל DDSA (dodecenyl אנהידריד succinic), 15.5 מ"ל NMA (אנהידריד מתיל nadic) ו 1 מ"לDMP-30 (פנול 2,4,6-טריס dimethylaminomethyl). מערבב את השרף על ידי רועד. ספין ולאפשר שרף לעמוד עד נחישות בועות.
    הערה: זהו מתכון קושי בינוני סטנדרטי. סוגים אחרים של מיקרוסקופיה אלקטרונית (EM) שרף פלסטיק ניתן להשתמש, אך יש לבדוק עם מדגם שליטה שאינם חיוניים מראש שלא כל שרפים לעבוד SBFSEM.
  22. דגירה הרקמות O / N ב 50: לערבב 50 של תחמוצת שרף פרופילן הטבעה, בבקבוקון כי הוא הכתיר בהתחלה, אז לא אטום אחרי 2 hr כך פרופילן אוקסיד מתאדה על פני תקופת 8 על - 10 שעות.
  23. מעביר את הרקמות שרפו הטבעה טריה 100% צלוחיות נקיות עבור שעה 2.
  24. דגימות שבץ שרף הטבעה טריה, בתוך תבניות שטוחות המכילות מודפסות מדבקות נייר, ולרפא אותם בתנור על 60 מעלות צלזיוס למשך 48 שעות. אחרי בערך שעה 1, בודק את מיקום רקמות ויישור שוב, ולהתאים במידת הצורך.
  25. חתוך דגימות לאזור של עניין הר על פיני אלומיניום באמצעות גליןדבק מגע cyanoacrylate גרם או שרף אפוקסי מוליך, אז מעיל עם מי כסף להדביק סביב הצדדים של הבלוק כדי לספק נתיב מוליך לפין אלומיניום.
  26. לבחון דגימות רקמות באמצעות מערכת מיקרוסקופ אלקטרונים סורק מצויד הבמה ultramicrotome ב-קאמרית גלאי אלקטרונים backscattered נמוך kV 32.
    הערה: קבל instrument- והאתר אימון במיקרוסקופ אלקטרונים סורק (SEM) להשתמש ולהיות משתמש מורשה. לחלופין, בשיתוף עם מתקן חוקר או ליבה עבור פרויקטים קטנים עשוי להיות אפשרי. אימון קרינה ייתכן גם שיהיה צורך כמו SEMs ליצור צילומי רנטגן.
  27. כדי לדמות את הדגימות, השתמש את ההגדרות הבאות: 2.25 ק ו, ב 5 - 10 ננומטר / פיקסל ברזולוציה, עם גדלים בשדה בין 80 - 250 מיקרומטר x, y (תחום אחר גדלים אפשריים), ועובי פרוס של 50 - 100 ננומטר, עם סך של 250 - 600 פרוסות בתוך 16 - פרק זמן של 20 שעות.
    הערה: הגדרות שונות מהותית בין מיקרוסקופים שונים, אינדידגימות vidual, ואת הרזולוציה הרצויה. הגדרות אלה צריכות להפיק תמונות כי הם לפירוש בקלות עבור דגימות רבות.

2. ניתוח מערך נתוני ההדמיה

הערה: תוכנת J התמונה / פיג'י משמשת כדי לנתח את הנתונים והוא מסתמך על תוסף TrakEM2. צעדי עיבוד מקדימים עשויים להתבצע באמצעות מגוון רחב של תוכנות, ועלולים להיות נרחב או קטין בהתאם לרמת ניסיון ואת הערימות שהושגו. התמורות העיקריות באמצעות תוכנת קוד פתוח (ImageJ Ver 1.50b, פיג'י להוריד 1 Oct 2015) מתוארים כאן.

  1. המרת תמונות בפורמט TIFF 8 קצת מתמונות 16 סיבי הקניינית המקוריות על ידי פתיחת התוכנה ובחירת פריטי תפריט → תמונת סוג → 8 סיבי.
    1. אם ההמרה ניגודיות / בהירות אוטומטית במהלך שלב זה אינו אידיאלי עבור תמונות, לפתוח מחדש את תמונות 16-bit, ו תמונה העיתונות → התאם → בהירות / ניגודיות. בחר טווח שמתאים את כל התמונות, ולחץ על החל. ואז לבצע גonversion. הערה: בחלק SEMs, צעד זה עשוי לדרוש תוכנה יצרנית מיקרוסקופ.
    2. במידת הצורך, בשל תנועת תמונות פסולה בין פרוסות (למשל. להיסחף בשל טעינה), לרשום / ליישר את ערימות תמונה (פריטי תפריט Plugins → רישום → לינארית StackAlignmentWithSIFT). ברוב תוכנות רישום, להגדיר עבור "תרגום בלבד" מצב ולא "גוף נוקשה".
      הערה: גישות רבות ותוכנה תפעלנה: עבודות תוספת הרישום לנפות עבור יישומים רבים ויש גרסת מחסנית וירטואלית.
      1. במידת הצורך, להגדיל את גודל הבד לפני רישום (תמונה → התאם → CanvasSize) או להפחית אותו תחום עניין (תמונה → Crop).
        הערה: החלק להיסחף או מפשק אותן למעלה ולמטה עלול להתרחש, ומנסה תוספים אחרים או תוכנה עשוי להניב תוצאות טובות יותר. אפשרויות ידניות זמינות גם (למשל. ImageJ / פיג'י, ManualLandmarkSelection → רישום Plugins →).
    3. אם דסירed, תמונות גוניות כקטן, יותר לניהול גודל (למשל. 25%) באמצעות ImageJ (Scale → תמונה).
  2. הפעל את התוכנה, → בחר קובץ רצף יבוא → תמונה ולאחר מכן בחר את קבצי TIFF.
  3. הפעל את התוסף ידי בחירת קובץ → TrakEM2 החדש → (בלנק). שתי חלון תפתחנה; אחת מנהלת הפרויקט area_lists והשני מנהלת מעקב, והוא מכונה בשם "בד '.
  4. טען את ערימת התמונה לתוך התוסף על ידי ביצוע לחיצה ימנית על יבוא הבד. בחר יבוא ולחץ על ערימת יבוא. בתוך האפשרויות המוקפצות, סמן את התיבה עבור ערימות וירטואליות.
    הערה: למרות ערימות התמונה כבר נפתחות בתוכנה, הם חייבים גם להיות נפתחו התוסף. המחשב עלול לפעול בצורה חלקה יותר אם תיבת הערימות הווירטואליות מסומנת.
  5. לאחר mipmaps נוצר הערימה נטענת, קליק ימני על שם הפרויקט מתחת לחלון התוסף. קליק ימני על "פרויקט חדש" ב col התבניתטור ה, ובחר 'להוסיף ילד חדש "עבור פרויקט זה. קליק ימני שוב כדי לבחור 'area_list'.
  6. הגדר את קנה המידה Z-ציר הפרויקט להסכים עם ההגדרות מיקרוסקופ אלקטרונים המקורי על ידי לחיצה ימנית על הבד, ולאחר מכן לחץ על תצוגה ובחר כיול. כמו כן, להגדיר את Z-המידה על ידי בחירת כל השכבות בחלון התוסף, לחץ על זכות לבחור המידה Z ועובי.
  7. לחץ וגרור את 'הפרויקט' וכל הילדים 'לתוך פרויקט האובייקטים בסעיף כדי ליצור את "רשימות האזור' תחת לשונית 'Z השטח' בחלון הבד.
  8. בחר את 'רשימת האזור' ועל שמאל לחץ כדי לבחור ולהגדיר צבע. עכשיו, להשתמש בכלי המכחול להתחקות אובייקטים כגון המיטוכונדריה, בתמונות מיקרוסקופ אלקטרונים. 'Shift + הלחיצה' השתמשתי למלא במעגל סגור, "Ctrl + לגלול 'כדי להתקרב ולהתרחק, ו' Alt + לחיצה 'לפנות סמן מברשת צבע לתוך מחק.
  9. בחר בשני תחומים של ~ 10 - 15 מיקרומטרעל ידי 10 - 15 מיקרומטר בפינה השמאלית העליונה לפינה הימנית התחתונה של התמונה ולזהות כל המיטוכונדריה בתוך אזורים אלה כדי לאפשר דגימה של המיטוכונדריה משוחדת בכל בסיס הנתונים.
  10. על 'בד', להתבונן להתחקות המיטוכונדריה לאורך חלקים. הערה: המיטוכונדריה הוא די כהים / אברונים המופיעים צפופים, בסדר גודל דומה בקוטר גלילי רופף. Cristae הייחודית שהוקמה על ידי הקרום הפנימי וניתן להבחין בקלות בתוך אברון זה.
  11. כאשר סיימו עם התחקות, לחץ לחיצה ימנית על area_list תחת לשונית Z השטח, בחר באפשרות 'צג ב -3 D ". זה יריץ את תוסף צופה 3D כדי לצפות שחזור 3D של התמונה לייחס.
    1. כדי לבצע מדידות נפח המיטוכונדריה, אובייקט נבחר הצופה 3D, לחץ על הכרטיסייה 'הערוך' ובחר 'מאפיינים חפצים. אומדן נפח המיטוכונדריה מופיע יחד עם כמה מדידות אחרות.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו מדגימים כי מורפולוגיה המיטוכונדריה המוח והגודל הוא הטרוגני-תאים תת עצביים שונים. מיקרוסקופיה Confocal על תרביות נוירונים בצפיפות נמוכה transduced בהבעת lentivirus חלבון פלואורסצנטי ירוק mitochondrially במיקוד הראה כי המיטוכונדריה המתגוררים soma העצבית ליצור רשת רשתי, ואילו הגרים neurites דיסטלי להפגין מורפולוגיה מוארך בדידים (איור 1 א.ב.). באמצעות טכניקת SBFSEM, המורפולוגיה המיטוכונדריה, הגודל, הנפח וההפצה נותחו במוח העכבר. תלת...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המורכבות של מערכת העצבים מהוות אתגר משמעותי בשחזור כרך גדולה של רקמה וניתוח המורפולוגיה וההפצה של אברונים כגון המיטוכונדריה עם רזולוציה נאותה. מספר תאים כולל נוירונים, oligodendrocytes ו האסטרוציטים עם תהליכים רבים המורחבת בשלושה ממדים אינטראקציה בתוך רקמת המוח 43. מאז המיטוכונדריה מתגוררת היא סומה של תאים ותהליכים רחוקים, המורפולוגיה המיטוכונדריה היא pleomorphic מאוד במערכת העצבים (איור 1). מידע מבני 3D הולם עם רזולוציה מספיק ולכן לא ניתן נרכש על ידי ש...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים מצהירים שאין להם אינטרסים פיננסיים מתחרים. אמילי קיי בנסון היא עובדת בשכר של Renovo Neural Inc., וגרהם ג'יי קיד משמש כמנהל מדעי של 3DEM ב-Renovo Neural Inc., שהיא ספקית מסחרית של שירותי SEM סדרתיים וניתוחים.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו מודים לסידני ווקר על העזרה הטכנית. עבודה זו נתמכה בחלקה על ידי מענק מהמכון הלאומי לבריאות (1R01EY024712-01A1).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
עכברי C57BL/6Jמעבדת ג'קסון 664
IsofluraneVETone, שם מסחרי Fluriso501017
מגש דיסקציהפישר מדעי S65105 
מספריים לדיסקציהטד פלה בע"מ1316
צינורית פרפרExel International26704
מאגר פוספט מלחסיגמא-אולדריץ'P4417-100TAB
מסנן (0.45 מיקרון)EMD MilliporeNC0813356
דיסקציה מיקרוסקופאולימפוסSZ61
מערכת חיתוך ויברטוםטד פלה בע"מ.Vibratome 3000
נתרן קקודילאטEMS12300
חומצה טאניתEMS21700
אשלגן פרוציאנידJ.T. Baker14459-95-1
תמיסת אוסמיום טטרוקסיד 4%EMS19150
תיוקרבוהידרזידEMS21900
L-חומצה אספרטיתסיגמא-אולדריץ'A93100
אשלגן הידרוקסידאקרוס אורגני43731000
עופרת חנקתיתEMS17900
EMbed-812 ערכת הטבעה EMS14120מכילה Embed 812  שרף, DDSA, NMA ו-DMP-30.
גלוטראלדהיד 25% דרגת EMPolysciences Inc.1909
ParaformaldehydeEMS19202
אורניל אצטטEMS22400
אתנולEMS15055
תחמוצת פרופילןEMS20400
עובש הטבעהEMS70907
סיכת דגימת אלומיניוםEMS70446
כסף קולואידי נוזלEMS12630
סכין גילוחEMS72000
סופר דבק (בקרת ג'ל לוקטיט)Loctite234790חנויות חומרה/יצירה נושאות פריט זה
אפוקסי מוליךטד פלה בע"מ.16043
מיקרוסקופ אלקטרונים סורקZeissSigma סמנכ"
ל אולטרה-מיקרוטום בתא עבור SEMGatan Inc.3View2יכול להיות מתוכנן עבור SEMs אחרים
חיתוך מיקרוסקופ להכנת סיכותGatan Inc.מסופק כחלק ממערכת
גלאי אלקטרונים מפוזר לאחור של קילו-וולט נמוךGatan Inc.חבילת עיבוד 3V-BSED
ImageJ / פיג'י ImageJ ver 1.50b, FIJI download 1 באוקטובר 2015<a href="http://zoi.utia.cas.cz/files/imagej_api.pdf">http://zoi.utia.cas.cz/files/imagej_api.pdf
http://rsb.info.nih.gov/ij/
http://www.icmr.ucsb.edu/programs/3DWorkshop/Uchic-2015_FIJI_Tutorial.pdf
http://fiji.sc/TrakEM2
3View

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Kasahara, A., Scorrano, L. Mitochondria: from cell death executioners to regulators of cell differentiation. Trends Cell Biol. 24, 761-770 (2014).
  2. Friedman, J. R., et al. ER tubules mark sites of mitochondrial division. Science. 334, 358-362 (2011).
  3. Bereiter-Hahn, J., Voth, M., Mai, S., Jendrach, M. Structural implications of mitochondrial dynamics. Biotechnol J. 3, 765-780 (2008).
  4. Campello, S., Scorrano, L. Mitochondrial shape changes: orchestrating cell pathophysiology. EMBO Rep. 11, 678-684 (2010).
  5. Trimmer, P. A., et al. Abnormal mitochondrial morphology in sporadic Parkinson's and Alzheimer's disease cybrid cell lines. Exp Neurol. 162, 37-50 (2000).
  6. Chen, H., Chan, D. C. Mitochondrial dynamics--fusion, fission, movement, and mitophagy--in neurodegenerative diseases. Hum Mol Genet. 18, 169-176 (2009).
  7. Li, Z., Okamoto, K., Hayashi, Y., Sheng, M. The importance of dendritic mitochondria in the morphogenesis and plasticity of spines and synapses. Cell. 119, 873-887 (2004).
  8. Romanello, V., et al. Mitochondrial fission and remodelling contributes to muscle atrophy. EMBO J. 29, 1774-1785 (2010).
  9. Szabadkai, G., et al. Drp-1-dependent division of the mitochondrial network blocks intraorganellar Ca2+ waves and protects against Ca2+-mediated apoptosis. Mol Cell. 16, 59-68 (2004).
  10. Yu, T., Robotham, J. L., Yoon, Y. Increased production of reactive oxygen species in hyperglycemic conditions requires dynamic change of mitochondrial morphology. Proc Natl Acad Sci U S A. 103, 2653-2658 (2006).
  11. Scheckhuber, C. Q., et al. Reducing mitochondrial fission results in increased life span and fitness of two fungal ageing models. Nat Cell Biol. 9, 99-105 (2007).
  12. Scheibye-Knudsen, M., Fang, E. F., Croteau, D. L., Wilson, D. M., 3rd,, Bohr, V. A. Protecting the mitochondrial powerhouse. Trends Cell Biol. 25, 158-170 (2015).
  13. Macke, J. H., et al. Contour-propagation algorithms for semi-automated reconstruction of neural processes. J Neurosci Methods. 167, 349-357 (2008).
  14. Parikh, S. The neurologic manifestations of mitochondrial disease. Dev Disabil Res Rev. 16, 120-128 (2010).
  15. Frye, R. E., Rossignol, D. A. Mitochondrial dysfunction can connect the diverse medical symptoms associated with autism spectrum disorders. Pediatr Res. 69, 41-47 (2011).
  16. Beal, M. F. Mitochondrial dysfunction in neurodegenerative diseases. Biochim Biophys Acta. 1366, 211-223 (1998).
  17. DiMauro, S., Schon, E. A. Mitochondrial disorders in the nervous system. Annu Rev Neurosci. 31, 91-123 (2008).
  18. DiMauro, S., Schon, E. A. Mitochondrial respiratory-chain diseases. N Engl J Med. 348, 2656-2668 (2003).
  19. Calkins, M. J., Manczak, M., Mao, P., Shirendeb, U., Reddy, P. H. Impaired mitochondrial biogenesis, defective axonal transport of mitochondria, abnormal mitochondrial dynamics and synaptic degeneration in a mouse model of Alzheimer's disease. Hum Mol Genet. 20, 4515-4529 (2011).
  20. Anitha, A., et al. Downregulation of the expression of mitochondrial electron transport complex genes in autism brains. Brain Pathol. 23, 294-302 (2013).
  21. Misgeld, T., Kerschensteiner, M., Bareyre, F. M., Burgess, R. W., Lichtman, J. W. Imaging axonal transport of mitochondria in vivo. Nat Methods. 4, 559-561 (2007).
  22. Takihara, Y., et al. In vivo imaging of axonal transport of mitochondria in the diseased and aged mammalian CNS. Proc Natl Acad Sci U S A. 112, 10515-10520 (2015).
  23. Shepherd, G. M., Harris, K. M. Three-dimensional structure and composition of CA3→CA1 axons in rat hippocampal slices: implications for presynaptic connectivity and compartmentalization. J Neurosci. 18, 8300-8310 (1998).
  24. Wang, C., et al. Dynamic tubulation of mitochondria drives mitochondrial network formation. Cell Res. 25 (10), 1108-1120 (2015).
  25. Glancy, B., et al. Mitochondrial reticulum for cellular energy distribution in muscle. Nature. 523, 617-620 (2015).
  26. Chen, H., Chan, D. C. Mitochondrial dynamics in mammals. Curr Top Dev Biol. 59, 119-144 (2004).
  27. Chavan, V., et al. Central presynaptic terminals are enriched in ATP but the majority lack mitochondria. PLoS One. 10, e0125185(2015).
  28. Peddie, C. J., Collinson, L. M. Exploring the third dimension: volume electron microscopy comes of age. Micron. 61, 9-19 (2014).
  29. Harris, K. M., et al. Uniform serial sectioning for transmission electron microscopy. J Neurosci. 26, 12101-12103 (2006).
  30. Hayworth, K. J., et al. Imaging ATUM ultrathin section libraries with WaferMapper: a multi-scale approach to EM reconstruction of neural circuits. Front Neural Circuits. 8, 68(2014).
  31. Bushby, A. J., et al. Imaging three-dimensional tissue architectures by focused ion beam scanning electron microscopy. Nat Protoc. 6, 845-858 (2011).
  32. Denk, W., Horstmann, H. Serial block-face scanning electron microscopy to reconstruct three-dimensional tissue nanostructure. PLoS Biol. 2, e329(2004).
  33. Leighton, S. B. SEM images of block faces, cut by a miniature microtome within the SEM - a technical note. Scan Electron Microsc. , 73-76 (1981).
  34. Briggman, K. L., Denk, W. Towards neural circuit reconstruction with volume electron microscopy techniques. Curr Opin Neurobiol. 16, 562-570 (2006).
  35. Shomorony, A., et al. Combining quantitative 2D and 3D image analysis in the serial block face SEM: application to secretory organelles of pancreatic islet cells. J Microsc. 259, 155-164 (2015).
  36. Pinali, C., Kitmitto, A. Serial block face scanning electron microscopy for the study of cardiac muscle ultrastructure at nanoscale resolutions. J Mol Cell Cardiol. 76, 1-11 (2014).
  37. Miyazaki, N., Esaki, M., Ogura, T., Murata, K. Serial block-face scanning electron microscopy for three-dimensional analysis of morphological changes in mitochondria regulated by Cdc48p/p97 ATPase. J Struct Biol. 187, 187-193 (2014).
  38. Traka, M., et al. WDR81 is necessary for purkinje and photoreceptor cell survival. J Neurosci. 33, 6834-6844 (2013).
  39. Ohno, N., et al. Mitochondrial immobilization mediated by syntaphilin facilitates survival of demyelinated axons. Proc Natl Acad Sci U S A. 111, 9953-9958 (2014).
  40. Deerinck, T. J., Bushong, E. A., Thor, A., Ellisman, M. H. NCMIR methods for 3D EM: A new protocol for preparation of biological specimens for serial block face scanning electron microscopy. , University of California San Diego. San Diego, CA. Available at http://ncmir.ucsd.edu/sbfsem-protocol.pdf (2010).
  41. Ohno, N., et al. Myelination and axonal electrical activity modulate the distribution and motility of mitochondria at CNS nodes of Ranvier. J Neurosci. 31, 7249-7258 (2011).
  42. Hammer, S., Monavarfeshani, A., Lemon, T., Su, J., Fox, M. A. Multiple Retinal Axons Converge onto Relay Cells in the Adult Mouse Thalamus. Cell Rep. 12, 1575-1583 (2015).
  43. Kasthuri, N., et al. Saturated Reconstruction of a Volume of Neocortex. Cell. 162, 648-661 (2015).
  44. Conchello, J. A., Lichtman, J. W. Optical sectioning microscopy. Nat Methods. 2, 920-931 (2005).
  45. Denk, W., Strickler, J. H., Webb, W. W. Two-photon laser scanning fluorescence microscopy. Science. 248, 73-76 (1990).
  46. Bohorquez, D., Haque, F., Medicetty, S., Liddle, R. A. Correlative Confocal and 3D Electron Microscopy of a Specific Sensory Cell. J Vis Exp. , e52918(2015).
  47. Fiala, J. C. Reconstruct: a free editor for serial section microscopy. J Microsc. 218, 52-61 (2005).
  48. Cardona, A., et al. TrakEM2 software for neural circuit reconstruction. PLoS One. 7, e38011(2012).
  49. Helmstaedter, M., Mitra, P. P. Computational methods and challenges for large-scale circuit mapping. Curr Opin Neurobiol. 22, 162-169 (2012).
  50. Helmstaedter, M., Briggman, K. L., Denk, W. High-accuracy neurite reconstruction for high-throughput neuroanatomy. Nat Neurosci. 14, 1081-1088 (2011).
  51. Saalfeld, S., Cardona, A., Hartenstein, V., Tomancak, P. CATMAID: collaborative annotation toolkit for massive amounts of image data. Bioinformatics. 25, 1984-1986 (2009).
  52. Giuly, R. J., Martone, M. E., Ellisman, M. H. Method: automatic segmentation of mitochondria utilizing patch classification, contour pair classification, and automatically seeded level sets. BMC Bioinformatics. 13, 29(2012).
  53. Jakobs, S., Wurm, C. A. Super-resolution microscopy of mitochondria. Curr Opin Chem Biol. 20, 9-15 (2014).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Serial Block Face Scanning Electron MicroscopyMitochondrial Morphology AnalysisBrain Mitochondria ImagingElectron Microscopy TechniqueMitochondria Volume MeasurementMitochondria Distribution StudyMitochondria Number QuantificationRodent Brain Tissue PreparationUltrastructural Characteristics AnalysisMitochondria Compartment Classification

Related Articles