מאמר שיטה

תאי בידוד ובתאי Mesangiogenic (MPCs) מן האדם מח עצם

DOI:

10.3791/54225

⸱

15 ביולי 2016

 ,  ,  ,  , 
1Department of Clinical and Experimental Medicine, University of Pisa

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כאן אנו מתארים פרוטוקול אופטימלי וניתן לשחזור מאוד לבידוד תאי אב מזודרמליים (MPCs) ממח עצם אנושי (hBM). MPCs אופיינו בזרימה ציטומטרית וביטוי נסטין. הם הראו את היכולת להוליד תרביות תאים דמויות MSC הגדלות באופן אקספוננציאלי תוך שמירה על הפוטנציאל האנגיוגני שלהן.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

במחקר שמטרתו לבודד תאי סטרומה מזנכימליים (MSCs) שמקורם במח עצם אנושי (hBM) ליישומים קליניים, זיהינו אוכלוסיית תאים חדשה שנבחרה במיוחד לגידול במדיום תוסף סרום אנושי. תאים אלה מאופיינים בתכונות מורפולוגיות, פנוטיפיות ומולקולריות הנבדלות מ-MSCs וקראנו להם תאי אב מזודרמליים (MPCs). MPCs הם עגולים, עם אזור ליבה עבה מאוד; הם מראים היצמדות חזקה ועמידה לטריפסין לפלסטיק. כישלון להרחיב את ה-MPC חשף ישירות שהם איטיים במחזור. זה כפי שמוצע גם על ידי שליליות Ki-67. מצד שני, גידול MPCs במדיום סטנדרטי המיועד להרחבת MSC, הוליד אוכלוסייה של תאים דמויי MSC הגדלים באופן אקספוננציאלי. מלבד הפגנת יכולת התמיינות מזנכימלית, MPCs שמרו על פוטנציאל אנגיוגני, מה שמאשר את אופי האב הקדמון המרובה שלהם. כאן אנו מתארים פרוטוקול אופטימלי בעל יכולת שחזור גבוהה לבידוד ואפיון hBM-MPCs על ידי ציטומטריית זרימה (CD73, CD90, CD31 ו-CD45), ביטוי נסטין וארגון F-actin. ניתנים גם פרוטוקולים להתמיינות מזנגנית ואנגיוגנית של MPCs. כאן אנו מציעים גם מינוח מתאים יותר לתאים אלה, ששמו שונה ל"תאי אב מסנגיוגניים".

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

תאים סטרומה mesenchymal (MSCs) הם בעלי ערך קליני רלוונטי עבור קיבולת בידול רב השושלת שלהם ואת יכולתם לתמוך hemopoiesis, להפריש גורמי גדילה / ציטוקינים כמו גם לשחק תפקיד immunoregulation 1. בהגדרה של ייצור ויישום תא טיפולים מבוססים MSC כבר מושא המחקר קליני הנרחב טרום קליני 2, תוך שימת דגש מיוחד ברגולציה בינלאומית ספציפית את הבטיחות והיעילות של תא מבוסס מוצר רפואי (CBMP) טיפולים 3. MSCs אדם מתורבתים בהרחבה בתקשורת המכיל תוספי ריאגנטים מן החי, כגון בסרום שור העובר (FBS) טריפסין שור. לכן, לצד סיכונים זיהומיות הקשורות מניפולצית תא, חולים גם להתמודד עם חשיפת פריון וכן סיכונים אימונולוגיים צמודים חלבונים, פפטידים או ביומולקולות אחרות מן החי שיכולים נמשך לאחר תא קציר transplantation 4.

כדי לעקוף את הבעיה, אנחנו מתורבתי מח עצמות אדם (HBM) MSCs -derived במדיום חיה ללא, החלפת FBS עם סרום סוג AB אדם אסף (PhABS). בתנאים אלה, לצד MSCs גדל זיהינו אוכלוסיית תא רומן. תאים אלה היו מורפולוגית phenotypically שונה MSCs והראו פרופיל ביטוי גנים ייחודי וכן נכסי הידבקות מאפיין גידול /. הם שמרו הוא mesengenic ו angiogenic פוטנציאל ולכן נקראו תאי mesodermal ובתאים (MPCs) 5. בהמשך לכך, הצלחנו להגדיר תנאי תרבות סלקטיבית לשחזור כדי ליצור MPCs על ציון גבוה של טוהר 6.

בנוסף, אנו חקרנו את תכונות מורפולוגיות ביולוגיות של MPCs. MPCs הראה להיות nestin החיובי, איטי ב אופניים, Ki-67-שליליים, ועם הכרומוזומים מאופיינים טלומרים ארוכים 5. הם הביעו plurשעתוק הקשורים ipotency גורמי אוק-4 ו Nanog ולא רגולטורים MSC Runx2 ו Sox9 7. Phenotypically, MPCs הביע endoglin (CD105) ברמה נמוכה יותר מאשר MSCs כאשר לא היתה להם mesenchymal סמנים CD73, CD90, CD166. MPCs גם הראה בדפוס ייחודי של מולקולות הדבקה מאופיין ביטוי עקבי של PECAM (CD31), integrins αL (CD11a), αM (CD11b), αX (CD11c) וכן β2 integrin (CD18) באופן ספציפי ומקיים מבנים podosome דמוי 8 . במדיה הרחבים MSC סטנדרטיים, MPCs הבדיל מייד לתוך MSCs דרך שלב ביניים המציג את הפעלת תא Wnt5 / calmodulin איתות 9. MPCs גם שומרים על תכונותיהם angiogenic, כפי שהוכח על ידי יכולתם צומחים מתוך spheroids ב מטריקס בעכברים (ECM) תרבויות 3D חלבון. פוטנציאל angiogenic אבד במהירות לאחר בידול MPC לאורך שושלת mesengenic.

כאן אנו מציגים פרוtocols אופטימיזציה לבודד ולאפיין MPCs נקיים במיוחד מדגימות דם HBM. פרוטוקולים לשחזור עבור mesengenic MPC והבחנה angiogenic מתוארים גם.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הערה: לאחר הסכמה בכתב, דגימות HBM התקבלו במהלך ניתוח אורתופדי עבור החלפת מפרק הירך. מיד לאחר osteotomy בצוואר הירך ולפני הירך קודחות מזרק 20 מ"ל המכיל 500 UI של הפרין, שימש לשאוב בע"מ טריים. הפרוטוקול הוא ייחשב נרחב החלים על כל מקור בע"מ.

1. בידוד של תאים mononuclear מח האדם עצם (HBM-MNCs)

  1. לדלל 5 - 10 מ"ל של BM טרי 50 מ"ל, החלת פתרון בופר פוספט של Dulbecco (D-PBS) ומערבבים על ידי היפוך. לא פחות להפיץ 25 מ"ל בשני צינורות חרוטי חדש 50 מ"ל, להוסיף 25 מ"ל של D-PBS על צינור אחד ומערבבים על ידי היפוך.
  2. אפשר הצינורות לעמוד במשך 10 דקות בטמפרטורת חדר, להפרדת שברי עצם ושומן מפתרון.
  3. מוציאים בזהירות שומן צף עם ההשעיה תא פיפטה ולסנן פסטר סטרילית דרך 70 מיקרומטר מסננים מבלי להפריע גלולה שבר העצם.
  4. הגדר ארבעה צינורות 50 מ"ל עם 15 מ"ל של מדיום עבור צנטריפוגה שיפוע צפיפות רציפה (1.077 גרם / מ"ל). ודא כי המדיום הזה הוא בטמפרטורת החדר.
  5. בעדינות שכבה 20 - 25 מ"ל של בדילול BM על גבי בינוני שיפוע צפיפות. בצע פעולה זו בזהירות, לתת זרזיף השעית תא על קירות הצינור כדי למנוע שכבות ערבוב.
  6. לבצע צנטריפוגה שיפוע צפיפות ב 400 XG במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר עם הבלם נכים.
  7. אסוף את הטבעת לבנבן של תאים הממוקמים בין שני השלבים בעזרת פיפטה פסטר סטרילי ולהעביר אותו צינור 50 מ"ל טרי.
  8. שטוף תאים עם מדיום תרבות טרי: גלוקוז נמוך, אדום ללא פנול (1,000 מ"ג / ליטר) הבינוני הנשר השונה של Dulbecco (DMEM), 10% (v / v) ואקווה א.ב. בסרום סוג האדם (PhABS), 2 מ"מ L- גלוטמין ו אנטיביוטיקה (DMEM / 10% PhABS). צנטריפוגה ב 400 XG במשך 5 דקות.
  9. לשאוב supernatant מחדש להשעות גלולה ב 5 - 10 מ"ל של DMEM טריים / 10% PhABS.
  10. המשך ספירת תאים.לקבוע את מספר תאי הדם הלבנים ע"י 1: 1 דילול trypan. זה החל על hemocytometer, ולבחון תחת מיקרוסקופ לעומת שלב. אל תכלול אריתרוציטים קטן ומעוגל מושלם ותאים מתים כחולים מוכתם מן ספירת התאים.
    הערה: מומלץ מאוד כדי אצוות מסך PhABS לביצועים שלהם בהחלמה MPC. PhABS ממקורות ארה"ב נתן תוצאות הטובות ביותר בעוד רוב סר ממוצא שונה הביא תרבויות MPC עם אחוזים גבוהים של תאי MSC הדמויים.

בידוד 2. של MPCs מ-MNCs HBM

  1. הגדר צלוחיות T-75 הידרופובי עם 15 מ"ל של PhABS טרי DMEM / 10% ולתת לאזן pH וטמפרטורה ידי הדגירה טרום ב 37 ° C ב 5% CO 2 למשך 30 דקות.
  2. 4 זרע - 6 x 10 7 HBM-MNCs לכל בקבוק לדגור על 37 מעלות צלזיוס ב 5% CO 2 למשך 48 שעות.
  3. לשאוב ולזרוק תאים בינוניים שאינם חסיד צלוחיות. הוסף 15 מ"ל של PhABS DMEM / 10% טרי לדגור על 37 מעלות צלזיוסב 5% CO 2. לשמור על תרבויות למשך 6 - 8 ימים, שינוי בינוני כל 48 שעות.
    אופציונאלי: כדי להגדיל את תשואת MPC, לא חסידי תאי 2.3 יכולים להיות מחדש מצופים בבקבוק התרבות חדש ומתוחזק כמתואר עבור התרבויות העיקריות.
  4. לשאוב ולזרוק בינוני צלוחיות, לשטוף עם DMEM טריים להוסיף 2 מ"ל של פרוטאז חינם בעלי חיים ניתוק פתרון. לדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך 5 - 15 דקות (למנוע דגירה ממושכת).
  5. הוסף 10 מ"ל של PhABS טרי DMEM / 10%, לשאוב את ההשעיה תא צנטריפוגות ב 400 XG במשך 5 דקות
  6. לשאוב ולזרוק supernatant מחדש להשעות גלולה ב 1 - 2 מ"ל של DMEM טריים / 10 PhABS%. המשך ספירת תאים כמתוארים בשלב 1.10.
    הערה: אל תשתמש טריפסין / EDTA כמו ניתוק מגיב. MPCs הוא טריפסין עמיד. הקרנה מורפולוגי של התרבויות, לפני קטיף תא, מומלצת מאוד כדי להעריך הנוכחות של תאי MSC הדמוי דמוי כישור. בסכום תיקים רב של תאי MSC הדמויים הם דetected, להגדיל את הטוהר של מוצר התא על ידי הסרת התאים המזוהמים באופן סלקטיבי. לשם כך, עיכול טריפסין יכול להתבצע לפני קצירת MPC, על ידי הוספת 2 מ"ל של טריפסין / EDTA 0.05% למשך 2 דקות. תרבויות שטפו פעמיים עם 5 מ"ל של DMEM / 10% PhABS, ולאחר מכן להמשיך פרוטאז טיפול כנ"ל.

אפיון Cell 3.

  1. cytometry זרימה
    1. גדר דגימות כפולות של 10 תאים 5 טריים מנותקים בתמיסת כביסה: D-PBS בתוספת 0.5% (v / v) אלבומין בסרום שור (BSA) ו- 0.02% (w / v) יזיד הנתרן. צנטריפוגה ב 400 XG במשך 5 דקות.
      זהירות: אזיד הנתרן הוא רעיל.
    2. Re- להשעות כדורים ב 200 μl של פתרון כביסה ולהוסיף אנטי CD90, אנטי CD45, אנטי CD73 נוגדנים נגד CD31 מצומדות עם צבעי ניאון ( "TEST"); במקביל להגדיר בקרת isotype ( "CTRL").
      הערה: סכומים של מכתים נוגדנים צריכים להיקבע על ידי טיטרציה או אקורדינג להוראות היצרן.
    3. דגירת דגימות ב 4 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.
    4. צנטריפוגה ב 400 XG במשך 5 דקות. Re להשעות תאי 500 μl של פתרון כביסה ולרכוש לפחות 5 x 10 4 אירועים על תזרים ססגוני cytometer 7 9 10.
    5. נתח את התוצאות על ידי חלקות-נקודה ולהשתמש "CTRL" אירועים שנרשמו להגדיר רביעים.
      הערה: על מנת להגדיר את התרבות כתרבות MPC אחוז CD73 נג CD90 נג CD45 + CD31 + תאים צריך להיות מעל 95%. עבור יישומים ספציפיים מסוימים, כלומר, ניתוח ביטוי גנים, חתוכי ההתאוששות צריך להיות מוגברים עד 97 - 98%.
  2. זיהוי Nestin וניתוח ארגון F- אקטין
    1. פלייט MPCs טרי הפרד, שקופיות קאמרית תרבות (20,000 / 2 ס"מ). אפשר תאים לדבוק ידי דגירת לילה בשעה 37 ° C ב 5% CO 2.
    2. שטפו תאים בתמיסה וסיבי כביסהx ב 4% (w / v) פסקה פורמלדהיד בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות. כדי להסיר מקבע ולהוסיף פתרון כביסה, דגירה במשך 2 דקות ויוצקים.
    3. חזור כביסה פעמיים.
    4. תאי Permeabilize ברה-PBS בתוספת 0.05% (v / v) טריטון X-100 במשך 15 דקות ב RT.
    5. בקצוות ידי משפר אות בחינם חלבון (30 דקות 'ב RT) או פתרון חסימה סטנדרטי (D-PBS בתוספת 3% (w / v) BSA).
    6. סר משפר אות / חסימת פתרון.
    7. להוסיף 7 מיקרוגרם / מ"ל ​​(w / v) של נוגדן ראשוני nestin אנטי אנושי דגירה על 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה בתא humidified. במקביל, השתמש נוגדנים לשלוט isotypic להעריך אותות קרינה ספציפיים לא.
    8. לשטוף שקופיות על ידי הוספת D-PBS, להשאיר למשך 2 דקות ויוצקים. חזור פעמיים.
    9. הוסף 2 מיקרוגרם / מ"ל ​​(w / v) של נוגדנים משני מצומדות צבע פלואורסצנטי דגירה על 4 מעלות צלזיוס במשך שעה 1 בחושך.
    10. לשטוף מחליק כנ"ל.
    11. להוסיף Phalloidin ניאון (5 UI / ml), לעזוב ב RT במשך 30 מ 'ב בחושך לשטוף 3 פעמים ב D-PBS.
    12. הסר את הקירות קאמריים הר שקופיות במדיום הרכבה מימית בתוספת antifade מגיב 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) לגילוי גרעינים. המשך הדמיה 7 9 10.

4. בידול Mesengenic של MPCs

  1. פלייט 2 x 10 4/2 ס"מ MPCs מבודדים טרי צלוחיות תרבות T75 TC שטופלו ולתת תאים לדבוק לילה DMEM / 10% PhABS על 37 מעלות צלזיוס ב 5% CO 2.
  2. החלף DMEM / 10% PhABS עם המדיום סרום מופחת רגיל, כ -200 μl / 2 ס"מ, המיועד (בינוני MSC-RS) הרחבת התא סטרומה mesenchymal. לגדל תאים כדי מפגש (P1-MSCs), בדרך כלל 7 עד 10 ימים מיום האינדוקציה. רענן בינוני כל 2 ימים.
  3. לשאוב ולזרוק בינוני צלוחיות, לשטוף עם המדיום MSC-RS טריים להוסיף 2 מ"ל של פרוטאז חינם בעלי חיים ניתוק פתרון. לדגור על 3776; צלזיוס למשך 5 - 15 דקות (למנוע דגירה ממושכת).
  4. הוסף 10 מ"ל של מדיום MSC-RS טריים, לשאוב את ההשעיה תא צנטריפוגות ב 400 XG במשך 5 דקות
  5. לשאוב supernatant מחדש להשעות גלולה ב 1 - 2 מ"ל של מדיום MSC-RS טריים. המשך ספירת תאים כמתואר בשלב 1.10
  6. המשך-תת תרבות להם על ידי זריעת 3 - 5 x 10 תאים 3/2 ס"מ. לגדל תאים כדי מפגש (P2-MSCs).
  7. קציר תאים על ידי עיכול פרוטאז כמתואר משלב 4.3 לשלב 4.5 והמשך אפיון כמפורט בסעיף 3.
    הערה: אחוז של CD73 + CD90 + CD45 נג תאי CD31 נג נמוך מ -95% היה מצביע רק בידול חלקי ודורש מעבר תרבות נוספת.
  8. P2-MSCs פלייט ב 2 x 10 4 / cm 2 בשישה גם צלחות TC שטופלו ולגדול מפגש במדיום MSC-RS.
  9. מארק שתי בארות כמו "אין הבדל" ולרענן בינוני MSC-RS.
  10. מארק שני גםים כמו "osteo" ולהחליף בינוני עם 200 μl / 2 ס"מ של מדיום osteogenic סטנדרטי, שתוכננה במיוחד עבור בידול MSC.
  11. מארק שתי בארות כמו "Adipo" ולהחליף בינוני עם 200 μl / 2 ס"מ של מדיום adipogenic סטנדרטי, שתוכננה במיוחד עבור בידול MSC.
  12. לשמור על תרבויות על 37 מעלות צלזיוס ב 5% CO 2 על ידי שינוי התקשורת כולה כל 48 שעות.
    הערה: מומלץ מאוד להשתמש תקן זמינה מסחרי מדיה הבחנה עבור שחזור מבחן. אחרי 2/3 שבועות בתנאי הבחנה, משקעי סידן להופיע בתרבויות מושרות osteogenic, תוך הצטברות טיפות שומנים תאיות ניכרת בתא מושרה adipogenic.
  13. לשאוב ולזרוק תקשורת ותרבות ולאחר מכן לשטוף עם D-PBS.
  14. תקן התרבויות על ידי הוספת 1 מ"ל של 4% (w / v) פסקה פורמלדהיד במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר.
  15. כדי להסיר מקבע להוסיף D-PBS, דגירה במשך 2 דקות ויוצקים. חזור כביסהפעמיים.
  16. כתם אחד "אין הבדל" יחד עם שני "osteo" מסומן בארות בתמיסת ניאון ספציפית hydroxyapatite ואחד "אין הבדל" יחד עם שני "Adipo" מסומן בארות 200 פתרון אדום ננומטר הנילוס. דגירה במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר 11,12.
  17. הסר מכתים פתרונות ולשטוף D-PBS פעמיים.
  18. הסר D-PBS, להוסיף D-PBS בתוספת 50% (v / v) גליצרין והמשך הדמיה 7 9 10.

5. MPC אליפטית Assay הנבטה

  1. כדי לייצר spheroids 3D, שכב 20 טיפות μl של השעיה MPC מבודדים טרי (1.5 x 10 4 תאים / ירידה) על המשטח הפנימי של מכסה צלחת פטרי.
    הערה: ככל טיפות טיפול עלולות להוביל לקרע שלהם, זה מאוד לא מומלץ להניח להם עודף.
  2. בזהירות להשתמש במכסה כדי לסכם בצלחת פטרי המכילות D-PBS כדי למנוע תלוי טיפות אידוי. לדגור על 37 מעלות צלזיוס ב 5% CO 2לילה כדי לאפשר לתאים המצרפי spheroids 3D.
  3. גדר ג'ל סמיך של מטריקס בעכברים (ECM) חלבונים על ידי הוספת 300 aliquots μl של חלבוני ECM סטנדרטיים צלחת תרבות מראש בקירור 24 גם, ו לדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.
  4. בזהירות להתהפך מכסת צלחת פטרי בעדינות להרים את spheroids בעזרת פיפטה פסטר סטרילית.
  5. נח spheroids על ג'ל חלבון ECM, להוסיף 700 aliquots μl של מדיום גידול תא האנדותל VEGF-עשיר רגיל ו לדגור על 37 מעלות צלזיוס ב 5% CO 2.
  6. לאחר 24 שעות ו 7 ימים של תרבות, לצלם את תרבויות 3D בהספק הגדלת 4X. להעריך מבצבצות spheroids החלת תוכנת ניתוח תמונה על ידי מדידת המרחק הרדיאלי בין תא הפולש האחרון והקצה אליפטית. צעדים חזרו יחד לפחות 20 בכיוונים שונים. המרחק הממוצע הוא ייחשב כחיובי כאשר 50 מיקרומטר או מעל.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

התנאים תרבות סלקטיבית המתואר כאן אפשרו את הבידוד של רומן חסיד וכמעט חַד צוּרָתִי אוכלוסיית תאים כמו 1.0% של HBM-MNCs (0.5 - 2.0 x 10 6 HBM-MNCs מן 5 - 10 מ"ל של דגימות BM טרי) 5,6 . זיהינו הגדולות האלה (40 - 60 מיקרומטר קוטר), מעוגל, שוקט, תאים Ki-67-שליליים כמו MPCs 5. מורפולוגית, הם מאופיינים בכושר-ביצת עין ייחודי עם אזור ליבה עבה מוקף בפריפריה דקה שטוחה מראה המון filopodia בהספק בהגדלה גבוה יותר (חצים לבנים ב א 1. איור 1). התארכות פולאר של גבול התא החיצוני הוא נצפה לעיתים קרובות (חיצים שחורים ב א 1. איור 1). מורפולוגיה כזו היא שונה בבירור מן מראה תא סטרומה mesenchymal הטיפוסי בצורת הכישור דיווח בתרבויות MSC סטנדרטיות. Cytometry זרימה הראתה מעל 95% של MPCs המבודד טרי להביע CD31 ו CD45 בעוד מ 'esenchymal סמנים הקשורים CD90 ו CD73 13 היו (א .2 איור 1) לגילוי. אנו רואים קבוצה המוגבלת הזאת של ארבעה אנטיגנים כמו אינדיקציות על MPCs. בהמשך סימני ההיכר של MPCs הם הפצה המקווקו F- אקטין חושף מספר מבנים דמויי podosome (אדום באיור 1 א .3) וביטוי אינטנסיבי של nestin (ירוק באיור 1 א .3), אשר לא זוהה בתאים מוכתם נוגדן שליטה isotypic (מידע לא מוצג).

MPCs Culturing ב RS סטנדרטי שנועד בינוני עבור תוצאות הרחבה MSC התמיינות מהירה לתאים MSC דמוי גדל באופן אקספוננציאלי (איור 1 ב'1). לאחר שני קטעים תאים לבסוף לעבור הפנוטיפ שלהם CD73 נג CD90 נג CD45 + CD31 + כדי CD73 + CD90 + CD45 נג CD31 נג (איור 1 ב .2). תוך כדי כך, MPCs מחדש organize F- אקטין לתוך סיבי מתח תוך ביטוי nestin הופך מרותק כמה תאים נדירים (איור 1 ב .3). בידול MPC mesengenic לתוך פנוטיפ MSC הדמוי מובהק מתרחש באמצעות שני צעדים ברורים שעולים מורפולוגיה תאים שונות. לאחר שבוע במדיום MSC RS אוכלוסייה שיורית של תאים דמויי MPC עדיין לזיהוי בתוך שכבת ומחוברות של שטוח, תאים רב-קנים מצולעים (P1-MSCs באיור 2 א). קטע נוסף נדרש כדי להשיג תרבות חַד צוּרָתִי כמעט של תאי MSC הדמוי דמוי כישור (P2-MSCs באיור 2 א). אקספוננציאלית גדל אלה תאים יכולים להתמיין אוסטאובלסטים או adipocytes בקלות כאשר מועברים לתוך התקשורת סלקטיבית עבור 2 שבועות לפחות, ובכך אישר הטבע MSC שלהם. בתרבויות מושרות osteogenic, משקעי סידן יכולים להיות מזוהים על ידי או כתם Alizarin-S colorimetric או צבעי ניאון ספציפיים (ירוק B איור 2). לאחר תאים אינדוקציה adipogenicלהראות הצטברות אגל השומנים כפי שעולה גם כתם אדום אדום שמן colorimetric או פלורסנט הנילוס (אדום B איור 2).

הקלדת MPC אושרה על ידי הנבטת assay אנגיוגנזה. MPCs הראה יכולתם לפלוש (למעלה מ -50 מיקרומטר) ג'ל murine ECM חלבון מן spheroids 3D לאחר 24 שעות VEGF-גירוי (איור 2 ג). לאחר תאים פולשים שבוע התגלו ב 300 - 600 מרחק מיקרומטר. לעומת זאת, יכולת פלישה אבדה P2-MSCs לאחר בידול mesengenic (איור 2 ד).

figure-results-1
איור 1. MPCs מבודדים טרי יש מאפיינים ייחודיים. Culturing HBM-MNCs ב DMEM / 10% PhABS במשך שבעה ימים מוליד אוכלוסייה של MPCs שקט (א) להבחין בקלות בין MSCs (B) נא ללחוץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

figure-results-2
איור 2. MPCs להתמיין MSCs Standard ו- הצג הנבטה אנגיוגנזה במבחנה. החלפת DMEM / PhABS עם RS זמינים מסחרית שנועדה בינוני להרחבת MSC מפעילה אינדוקציה mesengenic של MPCs. אחרי שבוע בתרבות כמה MPCs שיורית עדיין לגילוי (P1-MSCs) תוך מעבר נוסף במדיום MSC-RS מוביל אוכלוסייה של תאים MSC דמוי ומחוברות (P2-MSCs, ברים בקנה מידה = 100 מיקרומטר). P2-MSCs סופני להתמיין osteocytes או adipocytes תחת הגירוי הנכון, כפי שהיא מתגלה על ידי בתצהיר סידן (ירוק B) וצבירת אגל השומנים (אדום B, ברים בקנה מידה = 200 מיקרומטר), בהתאמה. MPCs להראות הנבטה עקבית spheroids ב ג'ל חלבון murine ECM (C) בשעה הבדל עם P2-MSCs (D, ברים בקנה מידה = 1.0 מ"מ). נא ללחוץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

בעשורים האחרונים, MSCs נחקרו בהרחבה והוערכו פרה-קלינית ליישום אפשרי בטיפול בהפרעות שונות של עצמות/מפרקים, אימונולוגיות, נוירולוגיות, לב וכלי דם, מערכת העיכול והמטולוגיות14,15. הבידוד הקל והזול של MSCs רב-פוטנטיים, מרקמות רבות ושונות, יחד עם היעדר אימונוגניות משמעותית16, תורמים להפיכת תאים אלה לאחת מאוכלוסיות התאים המעניינות ביותר ליישום בטיפולים מבוססי תאים. עם זאת, השכיחות הנמוכה מאוד ברקמת המקור מייצגת מגבלה גדולה ליישום MSCs במרפאות, מה שמאלץ את הרחבת התאים הללו, במבחנה, לפני העירוי או ההשתלה.

תרביות MSC מורחבות חשפו דרגות גבוהות של הטרוגניות ושונות17-19 , מה שמקשה על הגעה להסכמה לגבי פרוטוקולי ייצור ואפיון MSC. יתר על כן, מחקרים אחרונים הצביעו על נוכחות של אבות קדמונים מרובים in vivo MSC במגוון רחב של רקמות, התורמים להטרוגניות תרבית10,20. למעשה, הוצע כי תנאי תרבית מסוימים עשויים לבחור או פשוט לקדם תת-אוכלוסיות ספציפיות של אבות MSCs הנמצאים באחוזים שונים בדגימות "גולמיות" ולא מעובדות כמו מח עצם (hBM-MNCs) או רקמות שומן (מקטע כלי דם סטרומלי)2. לפיכך, השונות באוכלוסיות התאים היוזמים MSC יחד עם המספר הרב של פרוטוקולי העשרה/בידוד ותרבית שונים המיושמים, מהווים מכשול גדול להגדרה של טיפולים מבוססי MSC אפשריים.

גורם מכריע המשפיע על ההטרוגניות של תרביות MSC הוא תוספי סרום21. בידינו, החלפת FBS ב-PhABS בתרביות ראשוניות מ-hBM-MNCs, בשילוב עם זריעה בצפיפות גבוהה על פלסטיק הידרופובי, הובילה לבידוד של אוכלוסיית תאים חדשה בעלת דבקות גבוהה עם מאפיינים ביולוגיים מובהקים בשם MPCs5,6. ראינו כי תוספת של אחוזים קטנים של PhABS לתרביות ראשוניות של FBS אפשרה גם בידוד MPC, מה שמרמז על נוכחות של חומרים מעוררי MPC בסרום האנושי6. כרגע, פרוטוקול הבידוד/אפיון MPC הוא שיטה ייחודית הזמינה להשגת MPCs כמעט טהורים. הפרוטוקול הותאם בקפידה והוא ניתן לשחזור מאוד להקרנה איכותית של תכשירי MPC לפני יישומים נוספים.

MPCs יכולים לשמש כמקור לייצור MSC, ובכך להגביל את השונות המוצגת על ידי שימוש בחומר מוצא לא מקוטע. ההגדרה המדויקת של השלבים המרובים המאפיינים התמיינות מזנגנית של MPC שדווחה9 תאפשר התרחבות תאים מזנכימלית מסונכרנת. עם זאת, מצב אחרון זה יכול להתממש אך ורק באמצעות אוכלוסיית MPC מטוהרת מאוד, כתוצאה מאפיון תוצרי התאים המתקבלים על ידי הפרוטוקול המתואר כאן, תוצאות בעלות חשיבות מכרעת. שיטת בידוד זו דווחה ומאפשרת התאוששות MPC עם טוהר בדרך כלל בסביבות 95%. עם זאת, שונות של תורם/מטופל יחד עם השונות הקשורה לאצוות השונות של סרום מאוגד אנושי מיושם, עלולה להוביל לאחוז משמעותי של תאים דמויי MSC מבודדים יחד עם MPCs, בתנאים סלקטיביים.

לא ברור אם תאים דמויי MSC "מזהמים" אלה יכולים לנבוע מאבות ה-in vivo השונים האחרים המתוארים במח עצם22 או מהתמיינות MPC לא מבוקרת וספונטנית. בכל מקרה, אחוז עקבי של תאים דמויי MSC בתוצרי MPC מבטל את האפשרות ליישם תאים אלה כחומר מוצא הומוגני להרחבת ה-MSC. לפיכך, כאן הוצעה שיטה פשוטה וזולה, המבוססת על עמידות MPC לעיכול טריפסין, מה שמגביר את טוהר מוצרי ה- MPC. תוצאות דומות או אפילו טובות יותר בטיהור תרביות MPC יכולות להיות מושגות על ידי מיון תאים פלואורסצנטיים או מגנטיים המבצע דלדול CD73 ו/או CD90, אך מאריך משמעותית את זמן התהליך ומגדיל את העלויות.

יתר על כן, MPCs הראו ביטוי של סמנים הקשורים לפלוריפוטנטיות ו-Nestin, כולם אבדו במהירות במהלך התמיינות מזנגנית7. בדיקת הנבטה חשפה יכולת MPC לפלוש לג'ל חלבון ECM של עכברים. יחד, תוצאות אלה מצביעות על כך שיש להתייחס ל-MPCs כאב קדמון לא בוגר יותר, השומר על פוטנציאל אנגיוגני. עם זאת, ההתלהבות הראשונית לגבי פוטנציאל ההתמיינות המזודרמלי של MPCs דועכת. למעשה, לאחר יותר מ-7 שנים של מחקרים על MPCs, פוטנציאל מזנגני ואנגיוגני תוארו בהרחבה5-9, אך עדיין חסרה התמיינות כלפי כל תא אחר ממוצא מזודרמלי. לפיכך, כאן אנו מציעים הגדרה חדשה וקפדנית יותר של תאים אלה כ"תאי אב מסנגיוגניים", תוך שמירה על ראשי התיבות MPCs.

אנו גם מאמינים שרוב המחלוקות לגבי הפוטנציאל האנגיוגני של MSC יכולות להיות קשורות להרכב ההטרוגני של תרביות מורחבות המורכבות מתת-אוכלוסיות של MPCs ו-MSCs באחוזים משתנים23.

לבסוף, MPCs יכולים גם למלא תפקיד מכריע ביישום CBMPs הרלוונטיים לשחזור רקמות, מכיוון שתאים אלה יכולים גם לתמוך בניאו-וסקולריזציה. למעשה, מחקרים עתידיים על התחדשות צריכים לקחת בחשבון שצמיחת הרקמה החדשה שנוצרה צריכה להיות נתמכת על ידי ניאו-אנגיוגנזה במקביל. הקיום המשותף של פוטנציאל מזנגני ואנגיוגני ב-MPCs יכול לשפר משמעותית את פוטנציאל ההתחדשות של גישות טיפוליות חדשות הכוללות תאים מעניינים אלה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למחברים אין אינטרסים פיננסיים מתחרים או ניגודי אינטרסים אחרים.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מחברים במיוחד רוצה להודות ד"ר פאולו פרחי, במחלקה כירורגית, רפואיים לפתולוגיה מולקולרית Critical Care Medicine, אוניברסיטת פיזה, למתן דגימות מח עצם ובקיאותו-אבות osteo אדם

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
מטריצת ממברנת מרתף MatrigelBD Bioscience (סן חוזה, קליפורניה-ארה"ב)354230חלבוני ECM עכבריים
ריכוז מלאי: 100% (9 - 12 מ"ג/מ"ל)
ריכוז סופי: 100%
תמיסת מלח חוצצת פוספט של Dulbecco (D-PBS)Sigma (סנט לואיס, מיזורי, ארה"ב)D8537
70 μ m מסנניםMiltenyi Biotec (BergischGladbach, גרמניה)130-095-823
Ficoll-Paque PREMIUM GE Healthcare (אופסלה, שוודיה)17-5442-03בינוני לצנטריפוגה שיפוע בצפיפות לא רציפה
סרום אנושי מסוג AB (PhABS)LONZA (Walkersville MD-USA)14-490Eריכוז סופי: 10%
Glutamax-IThermoFisher (Waltham,  MA ארה"ב)35050-038L-גלוטמין מיוצב
ריכוז מלאי: 100x
ריכוז סופי: 2 מ"מ
אלבומין סרום בקר (BSA)סיגמא (סנט לואיס, מיזורי, ארה"ב)A8412ריכוז מלאי: 7.5%
ריכוז סופי: 0.5%
נתרן אזידסיגמא (סנט לואיס, מיזורי, ארה"ב)S8032ריכוז סופי: 0.02%
פניצילין/סטרפטומיצין (Pen Strep)Gibco ( גרנד איילנד, ניו יורק, ארה"ב)15070-063אנטיביוטיקה
ריכוז מלאי: 5,000 UI/ml פניצילין, 5,000 & #956; גרם/מ"ל סטרפטומיצין
ריכוז סופי: 50 UI/ml פניצילין, 50 μ גרם/מ"ל בקבוק תרבית סטרפטומיצין
T-75 לתרביות תרחיףגריינר ביו-וואן  (פריקנהאוזן, גרמניה)658 190
בקבוק תרבית T-75 TC מטופלGreiner Bio-one  (פריקנהאוזן, גרמניה)658170
TrypLE SelectThermoFisher (Waltham,  MA ארה"ב)12563-011תמיסת ניתוק פרוטאזות ללא בעלי חיים
ריכוז מלאי: 1x
ריכוז סופי: 1x
טריפסין/EDTAThermoFisher (Waltham,  MA ארה"ב)15400-054פנול אדום חופשי
ריכוז מלאי: 0.5%
ריכוז סופי: 0.25%
נוגדן נגד CD90 APC  (CD90)MiltenyiBiotec (BergischGladbach, גרמניה)130-095-402ריכוז סופי: 1:40
נוגדן anti-CD45 APC-Vio770 (CD45)MiltenyiBiotec (BergischGladbach, גרמניה)130-096-609ריכוז סופי: 1:40
נוגדן anti-CD73 PE (CD73)MiltenyiBiotec (BergischGladbach, גרמניה)130-095-182ריכוז סופי: 1:40
נוגדן anti-CD31 PE Vio-770 (CD31)MiltenyiBiotec (BergischGladbach, גרמניה)130-105-260ריכוז סופי: 1:40
נוגדן IgG1 APC של עכברMiltenyiBiotec (BergischGladbach, גרמניה)130-098-846ריכוז סופי: 1:40
נוגדן IgG2a APC Vio770 של עכברMiltenyiBiotec (BergischGladbach, גרמניה)130-096-637ריכוז סופי: 1:40
נוגדן IgG1 PE של עכברMiltenyiBiotec ( BergischGladbach, גרמניה)130-098-845ריכוז סופי: 1:40
נוגדן IgG1 PE Vio-770MiltenyiBiotec (BergischGladbach, גרמניה)130-098-563ריכוז סופי: 1:40
גלוקוז נמוך Dulbecco Modified Eagle Medium  (DMEM)ThermoFisher (וולת'אם,  MA ארה"ב)13-1331-82פנול ללא אדום מינימלי חיוני בינוני
ריכוז מלאי: 1,000 מ"ג/ליטר גלוקוז
סרום בקר עוברי  (FBS)ThermoFisher (וולת'אם,  MA ארה"ב)10500ריכוז מלאי: 0.2 מ"ג/מ"ל
ריכוז סופי: 2 μ גרם/מ"ל
מגיב אנטי-פייד Prolong Gold עם 4',6-diamidino-2-phenylindoleInvitrogen (Waltham, MA,  ארה"ב)P-36931מדיום הרכבה מימי + DAPI
ריכוז סופי: 1x
ParaformaldehydeSigma (סנט לואיס, מיזורי, ארה"ב)P6148Fixative
ריכוז סופי: 4%
LAB-TEK מגלשות תא דו-בארותסיגמא (סנט לואיס, מיזורי, ארה"ב)C6682
נוגדן נגד נסטין [שיבוט 10C2]Abcam (קיימברידג', בריטניה)ab2035ריכוז מלאי: 1 מ"ג/מ"ל
ריכוז סופי: 7 μ גר'/מ"ל
Alexa Fluor 555 PhalloidinThermoFisher (Waltham,  MA ארה"ב)A34055ריכוז מלאי: 200 UI/ml
ריכוז סופי: 5 UI/ml
Triton X-100Euroclone (מילאנו, איטליה)EMR237500ריכוז סופי: 0.05%
MesenPRO RS בינוני  (מדיום MSC-RS)ThermoFisher (וולת'אם,  MA ארה"ב)12746-012
Alexa Fluor 488 ערכת SFX נגד עכברThermoFisher (Waltham,  MA ארה"ב)A31619נוגדן משני נגד עכבר עיזים + משפר אותות
ריכוז מלאי: 2 מ"ג/מ"ל
ריכוז סופי: 2 μ גרם/מ"ל
פסטר פיפטהKartell Labware  (Noviglio (MI), איטליה )329
StemMACS AdipoDiff  מדיהMiltenyiBiotec (BergischGladbach, גרמניה)130-091-679
StemMACS OsteoDiff  מדיהMiltenyiBiotec (BergischGladbach, גרמניה)130-091-678
בדיקת מינרליזציה של עצם OsteoimageLONZA (Walkersville MD-USA)PA-1503תמיסת צביעה פלואורסצנטית ספציפית הידרוקסיאפטיט
50 מ"ל צינור חרוטי פוליסטירןגריינר ביו-וואן (Kremsmü nster
אוסטריה)		227261
Nile RedThermoFisher (Waltham,  MA ארה"ב)N1142תמיסת צביעה פלואורסצנטית לשומנים
ריכוז מלאי: 100 מ"מ
ריכוז סופי: 200 ננומטר
גליצריןסיגמא (סנט לואיס, מיזורי, ארה"ב)G2289ריכוז סופי: 50%
צלחות פטרי פוליסטירןסיגמא (סנט לואיס, מיזורי, ארה"ב)P5606
צלחות 24 בארותגריינר ביו-וואן GmbH (פריקנהאוזן, גרמניה)662160
מדיום גידול אנדותל, EGM-2 BulletKit  (EGM-2)LONZA (ווקרסוויל MD-ארה"ב)CC-3162מדיום גידול תאי אנדותל עשיר ב-VEGF
Leica Qwin Image Analisys SoftwareLeica (Wetzlar, גרמניה)תוכנת ניתוח תמונה

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Stoltz, J. F., et al. Stem Cells and Regenerative Medicine: Myth or Reality of the 21th Century. Stem Cells Int. 2015, 734731(2015).
  2. Pacini, S. Deterministic and stochastic approaches in the clinical application of mesenchymal stromal cells (MSCs). Front Cell Dev Biol. 2, 50(2014).
  3. Galvez, P., Clares, B., Hmadcha, A., Ruiz, A., Soria, B. Development of a cell-based medicinal product: regulatory structures in the European Union. Br Med Bull. 105, 85-105 (2013).
  4. Herberts, C. A., Kwa, M. S., Hermsen, H. P. Risk factors in the development of stem cell therapy. J Transl Med. 9, 29(2011).
  5. Petrini, M., et al. Identification and purification of mesodermal progenitor cells from human adult bone marrow. Stem Cells Dev. 18 (6), 857-866 (2009).
  6. Trombi, L., et al. Selective culture of mesodermal progenitor cells. Stem Cells Dev. 18 (8), 1227-1234 (2009).
  7. Pacini, S., et al. Constitutive expression of pluripotency-associated genes in mesodermal progenitor cells (MPCs). PLoS One. 5 (3), 9861(2010).
  8. Pacini, S., et al. Specific integrin expression is associated with podosome-like structures on mesodermal progenitor cells. Stem Cells Dev. 22 (12), 1830-1838 (2013).
  9. Fazzi, R., et al. Mesodermal progenitor cells (MPCs) differentiate into mesenchymal stromal cells (MSCs) by activation of Wnt5/calmodulin signalling pathway. PLoS One. 6 (9), 25600(2011).
  10. Tormin, A., et al. CD146 expression on primary nonhematopoietic bone marrow stem cells is correlated with in situ localization. Blood. 117 (19), 5067-5077 (2011).
  11. Greenspan, P., Mayer, E. P., Fowler, S. D. Nile red: a selective fluorescent stain for intracellular lipid droplets. J Cell Biol. 100 (3), 965-973 (1985).
  12. Wang, Y. H., Liu, Y., Maye, P., Rowe, D. W. Examination of mineralized nodule formation in living osteoblastic cultures using fluorescent dyes. Biotechnol Prog. 22 (6), 1697-1701 (2006).
  13. Horwitz, E. M., et al. Clarification of the nomenclature for MSC: The International Society for Cellular Therapy position statement. Cytotherapy. 7 (5), 393-395 (2005).
  14. Wang, S., Qu, X., Zhao, R. C. Clinical applications of mesenchymal stem cells. J Hematol Oncol. 5, 19(2012).
  15. Si, Y. L., Zhao, Y. L., Hao, H. J., Fu, X. B., Han, W. D. MSCs: Biological characteristics, clinical applications and their outstanding concerns. Ageing Res Rev. 10 (1), 93-103 (2011).
  16. Le Blanc, K., Tammik, C., Rosendahl, K., Zetterberg, E., Ringden, O. HLA expression and immunologic properties of differentiated and undifferentiated mesenchymal stem cells. Exp Hematol. 31 (10), 890-896 (2003).
  17. Phinney, D. G. Biochemical heterogeneity of mesenchymal stem cell populations: clues to their therapeutic efficacy. Cell Cycle. 6 (23), 2884-2889 (2007).
  18. Phinney, D. G. Functional heterogeneity of mesenchymal stem cells: implications for cell therapy. J Cell Biochem. 113 (9), 2806-2812 (2012).
  19. Tolar, J., Le Blanc, K., Keating, A., Blazar, B. R. Concise review: hitting the right spot with mesenchymal stromal cells. Stem Cells. 28 (8), 1446-1455 (2010).
  20. Corselli, M., et al. The tunica adventitia of human arteries and veins as a source of mesenchymal stem cells. Stem Cells Dev. 21 (8), 1299-1308 (2012).
  21. Bieback, K., et al. Human alternatives to fetal bovine serum for the expansion of mesenchymal stromal cells from bone marrow. Stem Cells. 27 (9), 2331-2341 (2009).
  22. Watson, L., Elliman, S. J., Coleman, C. M. From isolation to implantation: a concise review of mesenchymal stem cell therapy in bone fracture repair. Stem Cell Res Ther. 5 (2), 51(2014).
  23. Pacini, S., Petrini, I. Are MSCs angiogenic cells? New insights on human nestin-positive bone marrow-derived multipotent cells. Front Cell Dev Biol. 2, 20(2014).

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

Flow CytometryCD31 CD45NestinF Actin

מאמרים קשורים