הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

ראשוניים האדם Trophoblast דגם תרבית תאים כדי לחקור את ההשפעות המגנות של מלטונין נגד היפוקסיה / נגרמת reoxygenation שיבוש

15.3K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/54228

⸱

30 ביולי 2016

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1INRS-Institut Armand-Frappier

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

כתב יד זה מציג מודל ייחודי במבחנה של תאי ציטוטרופובלסט אנושיים מטוהרים חיסונית שגודלו תחת היפוקסיה/חמצון מחדש. מודל זה מתאים לחקר ההשפעות המגנות של טיפולים מבטיחים, כגון מלטונין, על סיבוכי הריון הקשורים למתח חמצוני מוגבר ושינוי בתפקוד השליה.

תקציר

פרוטוקול זה מתאר כיצד תאי ציטוטרופובלסטים מבודדים מהשליה במועד על ידי עיכול אנזימטי עוקב, ואחריו צנטריפוגה בצפיפות, בידוד שיפוע מדיה וטיהור אימונומגנטי. כפי שנצפה in vivo, תאי ציטוטרופובלסטים חד-גרעיניים בתרבית ראשונית מתמיינים לתאי סינציטיוטרופובלסט מרובי גרעינים לאחר 72 שעות. בהשוואה לנורמוקסיה (8% O2), תאי ציטוטרופובלסטים וילוסים העוברים היפוקסיה/חמצון מחדש (0.5% / 8% O2) עוברים מתח חמצוני מוגבר ואפופטוזיס פנימי, בדומה לזה שנצפה in vivo בסיבוכי הריון כגון רעלת הריון, לידה מוקדמת והגבלת גדילה תוך רחמית. בהקשר זה, טרופובלסטים ראשוניים שגודלו בתנאי היפוקסיה/חמצון מחדש מייצגים מערכת ניסויית ייחודית להבנה טובה יותר של המנגנונים ומסלולי האיתות המשתנים בשליה האנושית ולהקל על החיפוש אחר תרופות יעילות המגנות מפני הפרעות הריון מסוימות. טרופובלסטים ויליים אנושיים מייצרים מלטונין ומבטאים את האנזימים והקולטנים המסנתזים שלו. מלטונין הוצע כטיפול ברעלת הריון והגבלת גדילה תוך רחמית בגלל השפעתו נוגדת החמצון המגנה. במודל התאים הציטוטרופובלסטים הראשוני המתואר במאמר זה, למלטונין אין השפעה על תאי טרופובלסט במצב נורמוקסי אך משחזר את איזון החמצון החיזור של תאי סינציטיוטרופובלסט שהופרעו על ידי היפוקסיה/חמצון מחדש. לפיכך, תאי טרופובלסטים ויליים אנושיים בתרבית ראשונית הם גישה מצוינת לחקר המנגנונים מאחורי ההשפעות המגנות של מלטונין על תפקוד השליה במהלך היפוקסיה/חמצון מחדש.

מבוא

במהלך הריון אדם, תאי cytotrophoblast השליה, אשר הם תאי גזע mononucleated, להתרבות במהירות להתמיין לתאי cytotrophoblast או villous או extravillous. cytotrophoblasts Extravillous לפלוש לשפץ העורקים ספירלה של דופן הרחם. Cytotrophoblasts Villous, מצד שני, ממשיכים להתרבות, להבדיל הפתיל כדי ליצור syncytiotrophoblast multinucleated (להלן syncytium) 1. התחזוקה של הומאוסטזיס trophoblast villous חיונית לרווחתה עוברית הריון בריא. למעשה, trophoblasts villous לאפשר חילופי האם והעובר של חמצן וחומרים מזינים, וכן ליצירת הורמונים חיוניים עבור ההריון. יתר על כן, syncytiotrophoblast הוא תא מהסוג רק במגע ישיר עם מחזור הדם האימהי ומספק מחסום פיזי אימונולוגיים חיוני. לכן, syncytiotrophoblast חייב לעבור אפופטוזיס והחלפת לתחזוקה ההומיאוסטטית וכדי AVOid השליה פתולוגיות 2-5.

הטכניקה פותחה על ידי Kliman et al. 6 בשנת 1986 לבודד cytotrophoblasts villous ראשית ממנהל שליות אדם גרמה מהפכה במחקר שליה בכך שהוא מאפשר בחקר המנגנונים המולקולריים המעורבים בידול trophoblast villous. טכניקה קלסית זו, המבוססת על digestions האנזימטית רציף עם טריפסין ו DNase, ואחריו בידוד במדיה צנטריפוגה הצפיפות (חלקיקי סיליקה colloidal מצופים ידי polyvinylpyrrolidone, או Percoll) מוכר כיום את תקן הזהב עבור לבודד תאי cytotrophoblast villous. הטכניקה יכולה להיות מותאמת על ידי מגנטי immunopurification, הליך שמפריד cytotrophoblasts villous מתאי הלא trophoblastic מבוססים על ביטוי ההפרש של אנטיגנים ספציפיים על פני השטח של תאים אלה. בחרנו ABC אנטיגן לויקוציטים אנושיים (HLA-ABC) בשל העדר הביטוי שלה על membran תא trophoblasticדואר 7,8.

השליה היא איבר שעובר וריאציות דרמטיות ברמות החמצן במהלך הריון. בטרימסטר הראשון, יחס החמצון הוא פיסיולוגי נמוך מאוד (2% O 2) אך עליות לרמות קלות של חמצון (8% O 2) בטרימסטר השני ושלישי. Tuuli et al. 9 תיאר כי רבייה במבחנה של הסביבה trophoblast בתוך villi השליה היא אתגר לשינויים ברמות חמצון עשוי אפילו להוביל לשינויים phenotypical. זהו, אם כן, הציע לאמץ חמצן 8% כפי normoxia לחקות את המתח חמצן נמצא villi השליה במהלך השליש השלישי של ההריון 8,9. חן et al. 10 בהרחבה למדו מספר משתנים הקשורים במתח חמצן תרבית תאי trophoblast והדגימו את החשיבות של קביעת רמות חמצן בסביבת pericellular. רמות חמצן villi נוטות להגדילבשל vasculogenesis. זרימת הדם בעליות villi שלית זמן ורמת החמצן (זן חמצן תגובתי בשפע) היא איתות חשובה שולט vasculogenesis 11,12. בשנת סיבוכי הריון, חוסר vasculogenesis מייצר היפוקסיה, ויותר מכך, וריאציות לסירוגין של חמצון (שנקרא היפוקסיה / reoxygenation). תנאים אלה להוביל לעלייה חריגה סטרס חמצוני, אשר פוגעת השליה 13,14 הכדאיות עוברית. השינויים שתאים trophoblast לעבור in vivo במהלך אירועי היפוקסיה / reoxygenation ניתן חיקה במבחנה כדלקמן: cytotrophoblasts villous נשמרים בתנאי normoxic (8% O 2) עד שהם להתמיין syncytiotrophoblast. לאחר מכן הם חשופים לתנאי חוסר חמצן (0.5% O 2) עבור 4 שעות, ואחריו hr 18 נוסף של normoxia (reoxygenation). באמצעות גישה זו היפוקסיה / reoxygenation, trophoblasts לשעברhibit deregulated מצב חיזור רמות גבוהות של אפופטוזיס המהותי 8, כמו נצפה סיבוכי הריון מסוימים. לפיכך, מדובר שימושי במודל חוץ גופית על מנת להעריך גישות למנוע ולרפא אותן חדשה למאבק סיבוכי הריון הקשורות השליה היפוקסיה / reoxygenation.

תאי שליה לייצר מלטונין, אשר יש פונקציות חשובות, כגון היכולת לייתר סטרס חמצוני ופגיעה בתפקוד השליה 15. כאן, אנו מציגים מודלי הגישה ותא הניסוי נעשו שימוש כדי להמחיש את ההשפעות המגנות של מלטונין בתאי trophoblast שליה ברמה המולקולרית, תאית ופונקציונלית 8.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

שליות התקבלו מייד לאחר משלוחי נרתיקית ספונטניים של הריונות מסובכים בבית צ'אם-St-Luc החולה, מונטריאול, קוויבק, קנדה, עם הסכמת מטופל מושכלת ואישור ועדה אתית (צ'אם-St-Luc חולי INRS-Institut Armand-Frappier, Laval, QC, קנדה).

1. בידוד וטיהור של תאי Villous Cytotrophoblast

  1. פתרונות תקשורת
    1. הכן התקשורת התחבורה ידי השלמת Modified של Dulbecco-גלוקוז גבוהה-בינונית של הנשר (DMEM-HG) עם 1% אנטיביוטי כרך / כרך (10,000 יחידות / פניצילין מ"ל G, 100 מ"ג / סולפט סטרפטומיצין מ"ל) ולאחסן ב 4 ° C..
    2. כן תקשורת התרבות העיקרית על ידי השלמת DMEM-HG עם 10% כרך / כרך בסרום שור עובר (FBS), 25 מ"מ 4- (2-hydroxyethyl) חומצת -1-piperazineethanesulfonic (HEPES), 1% אנטיביוטי כרך / כרך (10,000 יחידות / מ"ל פניצילין G, 100 מ"ג / סולפט סטרפטומיצין מ"ל) ולאחסן ב 4 מעלות צלזיוס. תקשורת חמה 37 ° C לפנילהשתמש.
    3. כן 4 ליטר של תמיסת מלח (0.9% נתרן כלורי משקל / כרך).
    4. כן שונה תמיסת המלח המאוזן של האנק (HBSS) על ידי הוספת 25 HEPES מ"מ ל X 1 HBSS (pH 7.4).
    5. הכן טרי, ארבעה בקבוקי פתרון העיכול עם שונה HBSS (שהוכנו 1.1.4), מגנזיום סולפט (MgSO 4), סידן כלורי (CaCl 2), טריפסין, IV deoxyribonuclease (IV DNase), ו -1% אנטיביוטי כרך / כרך ( 10,000 יחידות / מ"ל פניצילין G, 100 מ"ג / סולפט סטרפטומיצין מ"ל) כפי שמוצג בטבלה 1.
    6. הכין שיפוע תקשורת צנטריפוגה צפיפות
      1. כן פתרון תקשורת צנטריפוגה צפיפות על ידי השלמת תקשורת צנטריפוגה צפיפות עם 10% כרך / כרך HBSS 10x.
      2. הכן 14 צינורות assay עם פתרון התקשורת צנטריפוגה צפיפות שונה HBSS, כמתואר בטבלה 2.
      3. מערבבים כל פתרון צפיפות (שלב 1.1.6.2) במרץ לפני הוספת תוכנו להדרגתיות. בעדינותלהוסיף הפתרונות צפיפות לצינור צנטריפוגות זכוכית 50 מ"ל עם משאבה peristaltic (1 מ"ל / דקה), החל את הריכוז הגבוה ביותר (70%). הימנע טיפות ידי ניקוז הפתרונות בקיר צינור לשמור על הפרדה נכונה של כל שכבה של צבע.
        1. בהיעדרו של משאבת peristaltic, להחיל את השכבות מאוד בעדינות עם טפטפות פסטר.
    7. הכן חיץ ריצה הסופי על ידי השלמת למאגר פועל (ראו טבלה של חומרים) עם 2% אנטיביוטי כרך / כרך / antimycotic (10,000 יחידות / מ"ל פניצילין G, 100 מ"ג / סולפט סטרפטומיצין מ"ל). חנות ב 4 מעלות צלזיוס.
  2. בידוד cytotrophoblast Villous
    הערה: השתמש סטרילי כירורגי ציוד, כלי זכוכית, טפטפות, צלוחיות, וכו '
    1. ביום הבידוד cytotrophoblast villous, באמבט מים 37 מעלות צלזיוס, לחמם הפתרונות digestions (משלב 1.1.5) ו -70 מ"ל של FBS. הערה: השתמש 50 מ"ל של FBS להפסיק את digestions ואתהנותרים 20 מיליליטר עבור שלב ההקפאה (1.2.22) אשר ניתן למקם על קרח מופשר פעם.
    2. לאחר הלידה, להביא את השליה למעבדה במדיום התחבורה קר כקרח (משלב 1.1.1) כמה שיותר מהר (פחות מ 1 שעה).
    3. כאמצעי תחבורה מחק ודם השליה פח אשפה נוזלית. תשקול את השליה וטבלתי תמיסת מלח קר.
    4. למדוד ולנתח את התכונות הבאות: אורך חבל הטבור; לוקליזציה חבל טבור; אורך שליה, רוחב, צורה (סגלגל, discoid); צבע קרום; פתולוגיות מבנה טבורית. הערה: הנתונים מוצגים בסעיף התוצאות.
    5. חותכים את חבל הטבור לצד והחדרתו השליה (כלומר, בבסיסו עם מעגל רדיוס נוסף 1 ס"מ סביב חוט). לטבול 300 מ"ל של תמיסת מקבע רקמות היסטולוגית (פורמלין 10%) לניתוח היסטולוגית לאחר מכן.
    6. חותכים את השליה כולו לקוביות של 5 X 5 X 5 ס"מ. לשטוף ביסודיות (4 פעמים x ~ 1 דק ') ב סול מלוחיםution (0.9%) כדי להסיר תאי דם עד תמיסת מלח ברורה. בטל שטיפה נוזלית.
    7. בתוך זכוכית שעון, להסיר ממברנות השליה ורקמות טחונות להסיר כלי דם הסתיידויות. החזק את כלי דם בחוזקה עם מלקחיים ולהסיר רקמות באמצעות האחורי של מספרי מצנבאום.
      1. מניח שליה טחונה בתוך משפך ביכנר. לשטוף עם כ 100 מ"ל של חיץ מלוחים. המשך וקוצץ עד 30 - 35 גרם של רקמות טחונות מתקבל (פלסטיק לשימוש במשקל סירת מידה). במידת הצורך, לקצץ את שארית ההשליה להשיג עד שלוש נוספות 30 - הכנות 35 גרמו. במהלך תקופה זו, לשים רקמות טחונות בסירה במשקל על קרח.
        הערה: שלב זה ייקח בערך 45 דקות עד 1 שעה.
    8. מוסיפים את 30 - רקמת השליה טחון 35 גרם בבקבוק trypsinizing. העברת 150 מ"ל של 1 פתרון העיכול מוכן (טבלה 1) אל הבקבוק trypsinizing ומערבבים היטב.
    9. מניחים את הבקבוק trypsinizing ברעד באמבט מים במשך 30 דקות במהירות של לא יותר מ 50 מחזורים / דקה ידנית לערבב את בקבוק trypsinizing כל 5 דקות לעיכול הומוגנית.
    10. בסוף לעיכול הראשון, הסר את בקבוק trypsinizing מן האמבטיה במים להטות אותו (45 °) עבור 1 דקות כדי משקע רקמת השליה. עם פיפטה 10 מ"ל סטרילי, להסיר ולסלק כ 80 מ"ל של supernatant. הימנע aspirating הרקמה.
    11. העברת 100 מ"ל של עיכול פתרון 2 (טבלה 1) אל הבקבוק trypsinizing; מערבבים היטב לחזור על שלב 1.2.9.
    12. בסוף לעיכול השני, להסיר את הבקבוק trypsinizing מן האמבטיה במים להטות אותו 45 מעלות במשך 1 דקות. עם פיפטה 10 מ"ל סטרילי, להסיר 80 ​​מ"ל supernatant בעדינות להעביר צינור צנטריפוגות עם מסננת תא (100 רשת מיקרומטר). מעבירים את supernatant מסוננים כוס המכילה 2 מ"ל של FBS בכל פעם בצינור צנטריפוגות מלא.
    13. בצע את העיכול השלישי כמתואר עבורעיכול שני (1.2.11 ו 1.2.12) באמצעות 75 מיליליטר עיכול פתרון 3. במקביל, לבצע שלבים 1.2.15 כדי 1.2.16.1 לעיכול 2.
    14. בצעו את העיכול הרביעי בדיוק כמו עיכול השלישי באמצעות פתרון העיכול 4 (75 מ"ל), אבל לאסוף כמות מקסימלית של supernatant. בצע שלבים 1.2.15 כדי 1.2.16.1 במקביל לעיכול 3, ולבסוף לעיכול 4.
    15. Aliquot supernatant (מ digestions 2, 3 ו -4) לתוך 13.5 מ"ל חלקים, כל חלק לתוך צינור צנטריפוגות אחד 15 מ"ל. עם פיפטה פסטר זכוכית 22.8 ס"מ, מאוד בעדינות ומניחים לאט 1.5 מ"ל של FBS בתחתית כל צינור כדי ליצור שכבה נפרדת. אין לערבב FBS ו supernatant. בצנטריפוגה צינורות ללא בלם במשך 20 דקות ב 1250 XG בטמפרטורת החדר.
      הערה: לאחר צנטריפוגה, 4 שכבות גלויות בצינור, כפי שמוצגות באיור 1 הפרדת תאי טריפסין trophoblast תמנע עיכול הסלולר מוגזם..
    16. עם משאבת ואקום, aspirאכלו וזורקים supernatant (פתרון העיכול) ושכבות FBS, כולל הסרט לבנבן בין שתי השכבות. Resuspend גלולה (להלן trophoblasts ושכבות של תאי דם אדומים) עם 1 מ"ל של מדיום תרבית תאים חמים (שלב 1.1.2; ללא FBS ולא HEPES).
      1. איסוף תאים מושעים מכל הצינורות ולשלב אותם 1 צינור. בואו הצינור לעמוד בטמפרטורת החדר עד סוף כל digestions. הערה: אחרי הכל digestions, התשואה המקובלת היא 3 צינורות של תאי resuspended (אחד לכל עיכול).
    17. הפוך את הווליום עד 15 מ"ל עם מדיום תרבית תאים חמים. צנטריפוגות ב 1,250 XG במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. הסר את supernatant עם משאבת ואקום. הימנע aspirating הגלולה.
    18. בעדינות resuspend גלולה המתקבל 3 צינורות עם 1 מ"ל של מדיום תרבית תאים חמים. פינת התוכן שלהם 1 צינור. כדי להשיג 8 מ"ל, להשלים את נפח עם תרבית תאים בינוניים חם.
    19. מאוד בעדינות שכבת השעית התא על גראד הפרדהient עם פיפטה פסטר. צנטריפוגה ללא בלם במשך 30 דקות ב 507 XG בטמפרטורת החדר.
    20. לאחר צנטריפוגה, לזהות את השכבות השונות של תאי השיפוע עם דלקת חזרה. אתר את השכבות המכילות trophoblast לזהם תאים בין 40 - 50% של מדיום צנטריפוגה הצפיפות. עם משאבת ואקום, להסיר שכבות עליונות (> 50%).
    21. איסוף תאים ממוקם שכבות עניין עם פיפטה פסטר ולהעבירם צינור צנטריפוגות 50 מ"ל. הפוך את הווליום עד 50 מ"ל עם מדיום תרבית תאים. צנטריפוגות במשך 10 דקות ב 1250 XG בטמפרטורת החדר.
    22. בתנאים סטריליים, לבטל את supernatant, resuspend גלולה עם 20 מ"ל של FBS ולספור את מספר התאים באמצעות hemocytometer. על הקרח, מוסיפים 2.22 מ"ל של sulfoxide דימתיל סטרילי (DMSO) ומערבבים בעדינות על ידי היפוך. Aliquot 1.5 מ"ל של תרחיף תאים לתוך צלוחיות קריוגני, להקפיא לילה ב -80 ° C ומעבירים מיכל חנקן נוזלי.
  3. טיהור Trophoblast
    1. התקן את שטיפת מאגרי ריצת טור מסנן חדש על מכשיר הטיהור המגנטי על פי הוראות היצרן. בצע את "התכנית הנקיה" לנקות 1 שלילית, יציאות 1 וחיובים 2 חיוביים, ולאחר מכן להציג את הצינורות 50 מיליליטר תחת כל יציאה על פי הוראות היצרן.
    2. להפשיר את התאים שהוקפאו בשלב 1.2.22 במהירות באמבט מים 37 ° C. העברת תאי צינור 50 מיליליטר ותאי resuspend בעדינות עם 20 מיליליטר של תמיסת חיץ קרה. צנטריפוגה הצינור במשך 5 דקות ב 450 XG ו -4 מעלות צלזיוס.
    3. בטל supernatant. חזור על השלב לשטוף עם חיץ קר. ספירת תאים באמצעות hemocytometer כדי לקבוע כדאיות. חזור על צנטריפוגה (למשך 5 דקות, 450 XG ב 4 ° C). מוציאים בזהירות את supernatant. הוסף 1 מיליליטר של חיץ קר המכיל 1% כרך / כרך של עכבר נוגדנים נגד HLA-ABC. דגירה על 4 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות, mixing דקות כל 5 בעדינות.
    4. הוסף 6 מיליליטר של חיץ קר. צנטריפוגה במשך 5 דקות ב 450 XG ו -4 מעלות צלזיוס. בטל supernatant וחזור על שלב זה. תאים Resuspend ב 1 מ"ל של חיץ קרים המכילים 10% כרך / כרך של חרוזים מגנטיים מצמידים נוגדנים משני אנטי עכבר. דגירה על 4 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות, ערבוב כל 5 דקות בעדינות.
    5. הוסף 6 מיליליטר של חיץ קר. צנטריפוגה במשך 5 דקות ב 450 XG ו -4 מעלות צלזיוס. בטל supernatant ו resuspend במאגר ריצה 5 מ"ל קר.
    6. הפרד את התאים trophoblast באמצעות מכשיר טיהור מגנטי. איסוף תאים בנמל שלילי ולהוסיף 20 מ"ל של חיץ קרים.
      הערה: תאי Trophoblast אינם מכילים את HLA-ABC המורכב, ובכך מופרדים סוגי תאים אחרים ומכוון נמל 1 השלילי.
    7. צנטריפוגה במשך 5 דקות ב 450 XG ו -4 מעלות צלזיוס. בטל supernatant בעדינות resuspend תא 20 מיליליטר בינוני תרבות הראשונית חמה. ספירת התאים מנצליםhemocytometer ga כדי לקבוע כדאיות.
    8. פלייט התאים על הצפיפות הבאה: 0.15 x 10 6 תאים / גם ב 96-גם צלחות, 1.6 x 10 6 תאים / גם ב 24 גם צלחות 4.5 x 10 6 תאים / היטב היטב 6 צלחות. דגירה צלחות על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2.
    9. אשר את הטוהר של התאים trophoblast על ידי זרימת cytometry 16,17 ו / או על ידי immunocytochemistry 18.
      הערה: הטוהר של תאי immunopurified נקבע באמצעות נוגדנים חד שבטיים FITC- מצומדות נגד cytokeratin-7 ו vimentin 17-19. פרוטוקול זה הוא גם מפורט Lanoix et al., 2008 7.
    10. אחרי לפחות 4 שעות, לשטוף את התאים פעמים עם מדיום תרבות חמים כדי להסיר תאים פנויים ולאחר מכן להעביר את הצלחות אל תא normoxia, מורכב 8% O 2 (ראה איור 2, וסעיף 2).

2. במבחנה משרn של normoxia ו היפוקסיה / Reoxygenation

  1. מבצע תא חממה (ראה איור 2 א על Set-up).
    1. במנדף זרימה למינרית, מניחים צלחת פטרי המכילה מים סטריליים בתחתית תא חממה כדי למנוע יובש; אז במקום צלחות תרבית תאים בעבר הכינו או צלוחיות (שלב 1.3.10) על המדפים המעולים של החדר.
    2. מחוץ למכסת המנוע, לצרף את התא (יציאת כניסה) אל צינור הגז (איור 2 א: 5a, B ו- C) כדי להגיע הצינור של גז (8% O 2 או 0.5% O 2) (איור 2 א: 7). פתח בשני יציאות הכניסה ו לשקע של החדר. ברגע זה, רגולטור הגז (איור 2 א: 4) צריך להישאר סגורים.
    3. בזהירות לפתוח את שסתום וסת גז (איור 2 א: 4). סומק על 4 דקות עם זרימת אוויר של 25 ליטר / דקה כדי להחליף את האוויר לגמרי בתוך החדר.
    4. לאחר שטיפת החדר, לסגור את רגולטור הגז אז הכניסה ו ouיציאות tlet של החדר.
    5. ניתק את צינור יציאת מד זרימה (איור 2 א: 5c) מנמל הכניסה של החדר ומקום קאמרי חממת תרבית תאים על 37 מעלות צלזיוס.
    6. חלף באוויר כרגע נוכח צלחות, הצלוחיות ופזר במדיום התרבות ידי מילוי הקאמרי עם hr 1 גז אחרי צעד 2.1.3.
    7. חזור על שלבים 2.1.1 עד 2.1.6 עבור היצירות גז אחרות (למשל, 2% O 2 לתרבות trophoblast השליש הראשון 9).
  2. אשר את אחוז החמצן (תרשים 2B-C)
    1. כדי לאשר את ריכוז חמצן מדיום תרבית תאים (ללא תאים) בתוך החדר, השתמש אלקטרודה חמצן מחוברת למתאם חמצן. חבר את האלקטרודה חמצן מד מתח.
    2. צור עקומת כיול באותו הפתרון (כלומר, מדיום סלולארי תרבות) על ידי חשיפת הפתרון גז עם תוכן חמצן ידוע (למשל, 0% ו21% חמצן). לאחר קריאות מיוצבים עבור כל ריכוז, להציג את האלקטרודה לתוך המדיום בתא.
      הערה: קח את כל המדידה באותו העומק על מנת למנוע הטיות בריכוז חמצן 10.
  3. אינדוקציה של normoxia ו היפוקסיה / reoxygenation ב trophoblasts.
    1. לאחר הוספת תאי trophoblast עיקריים צלוחיות תרבית תאים המתאימות, צלחות או צלחות פטרי, לבצע טיפולים לפי צורך.
    2. במקביל, בתוך החדר, לחשוף תאים לתערובת הגז הרצוי להתרבות תנאים מסוימים כל 24 שעות (איור 3).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

בידוד immunopurification של תאי cytotrophoblast villous מתוך השלית טווח נורמלית שהתקבלה על ידי משלוח נרתיק ניב 1 x 10 8 תאי קיימא. השליה שקלה 350 גרם, היה 19 ס"מ קוטר, 4 ס"מ עם צורה discoid וממברנות שקוף. אין מום טבורית זוהה. חבל הטבור היה לוקליזציה paracentral ובאורך של 56 ס"מ. הטוהר הוערך על ידי cytometry זרימה באמצעות vimentin ו cytokeratin-7 סמנים. יותר מ 98% מכלל התאים היו שליליים עבור vimentin וחיוביות עבור cytokerat...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

ביונקים, התפתחות עוברת תלויה ישירות על תפקוד השליה נאות. מקורותיה ההתפתחותי של הפרעות בריאות מבוססים על ההשערה כי הגורם למחלות לידי ביטוי בשלב מאוחר יותר בחיים יכול להיות נעוצה בהתפתחות מוקדמת וכי השליה יש תפקיד מכניסטית בתכנות עוברי 30-32. השליה היא מתווך המפתח של גדילת עובר ופיתוח: זה מסדיר העברת מזין, מגן מפני חשיפות מזיקות, ויש לו פונקציות האנדוקרינית גדולות. הפיתוח על ידי Kliman et al. של טכניקה לשחזור לבודד cytotrophoblasts העיקרי הקיימא הוא ציון דרך בחקר...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

למחברים אין מה לחשוף.

תודות

נתמך על ידי מענקים ממועצת המחקר למדעי הטבע וההנדסה של קנדה (NSERC) (מס' 262011-2009) למענק CV ו-March of Dimes Social and Behavioral Sciences Research (#12-FY12-179) ל-CV ו-JTS; על ידי מלגות ל-LSF מ-Ministère de l'éducation, de l'Enseignement supérieurs et de la recherche (MEESR)-Fonds de recherche du Québec (FRQ)-Nature et technologies (NT) ו-Fondation Universitaire Armand-Frappier INRS, ל-HC מ-Réseau Québécois en Reproduction-NSERC-CREATE, ל-AAHT מהמכונים הקנדיים לחקר הבריאות (CIHR) ו-FRQ-Santé, ול-JBP מ-NSERC; על ידי מלגה ל-EMAS מה-Conselho Nacional de Desenvolvimento Cientìfico e Tecnològico (CNPq) ו-Program de bourses d'excellence pour étudiants étrangers MEESR-FRQNT.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
מספריים מעוקלים של מצנבאוםשנדון9212ציוד כירורגי (בידוד תאים) (2 יחידות)
מלקחיים ספלינטר פיין 41/2בפישרברנד13-812-42ציוד כירורגי (בידוד תאים) (2 יחידות)
מספריים 4.5 Str DissectionFisherbrand08-940ציוד כירורגי (בידוד תאים) (2 יחידות)
ספוג גזה 10 ס"מ x 10 ס"מבריאותקרדינלית
תבנית אפייה מזכוכית מלבניתפיירקס1105397כלי זכוכית (2.8 ליטר)
משפך BuchnerCoorstek Inc10-356Eכלי זכוכית (קוטר 114 מ"מ)
צפה בזכוכית pyrex9985100EMDכלי זכוכית
תמיסת פורמלין, מאגר ניטרלי, 10%Sigma-AldrichHT501128-4Lתמיסת קיבוע רקמות היסטולוגיות
צלוחיות טריפסיניזציהכלי זכוכית Wheaton355395(יחידה אחת)
צינורות תרבות חד פעמייםKimble73750-13100כלי זכוכית
בורוסיליקט פסטר פיפט (22.8 ס"מ)פישרברנדK63B1367820Cכלי זכוכית
250 מ"ל כוסות זכוכיתפישרברנדKFS14005250
בקבוקי מדיה מזכוכית עם פקקפישרברנדKFS14395250כלי זכוכית (8 יחידות)
50 מ"ל שפופרת קורקס קורנינג8422-A(יחידה אחת)
15 מ"ל צינור צנטריפוגה פוליסטירןקורנינג430791
50 מ"ל צינור צנטריפוגה פוליסטירן430829
מסננת11415038פיפט סרולוגית
100 μ m ניילוןקורנינג431752
תוחם סופגScienceware1199918
500  בקבוקי מ"ל מסנן עליוןנקבוביות: 0.22  ומיקרו; m / בינוני והכנה HBSS
2 מ"ל בקבוקונים קריוגנייםקורנינג430488
מיכל הקפאה, Nalgene Mr. FrostySigma-AldrichC1562-1EA
משאבה פריסטלטיתPharmacia Fine ChemicalsP3 דגם
רועד אמבט מיםפישרדגם 127
משאבת ואקוםABM4EKFS6CX-4
נתרן כלוריפישרברנדEC231-598-3תמיסת מלח 0.9%
האנק' s תמיסת מלח חוצצת (Hbss)Sigma-AldrichH2387כמות: 9.25 (בקבוקון אחד) עבור 1 ליטר של תמיסת עיכול
Hydroxypiperazineethansulphonic Acid (Hepes)Life Technologies15630-08025 מ"ל (1 מ ') עבור 1 ליטר תמיסת עיכול
טריפסין סוג Iסיגמא-אולדריץ'T80039,888 U
דאוקסיריבונוקלאז סוג IVרוש10-104-159-001402,000 U
סידן כלוריסיגמא-אולדריץ'C4901100 מ"מ
מגנזיום סולפטבייקר2500-01800 מ"מ
דולבקו s Modified Eagle Medium High Glucose (Dmem)Life Technologies10564-045
פניצילין/סטרפטומיצין סולפטHycloneSV30010
סרום בקר עובריקורנינג35-010-CV
PercollSigma-AldrichP1644שיפוע צנטריפוגה צנטריפוגה. נפח: 36 מ"ל
איזופרופנולאקרוס42383-001050 מ"ל
דימתיל סולפוקסידסיגמא-אולדריץ472301
מפריד מגנטי אוטומטי Miltenyi Biotecדגם 003
Automacs  טורים Miltenyi Biotec130-021-101
Automacs מריצים Buffer Miltenyi Biotec130-091-221
http://www.miltenyibiotec.com/~/media/Images/Products/Import/0001100/IM0001131.ashx?force=1 פתרון שטיפת Automacs Miltenyi Biotec130-091-222
http://www.miltenyibiotec.com/en/products-and-services/macs-cell-separation/cell-separation-buffers/automacs-rinsing-solution.aspx שיבוט מטוהר אנטי אנושי ABC W6/32Affymetrix eBioscience14-9983-82נוגדן נגד עכבר
אנטי עכבר Igg מיקרו-חרוזיםMiltenyi Biotec130048401
צלחת באר מרובה -  6 באר עם מכסהקורנינג3335משטח קשירת תאים
צלחת באר מרובה -  24 באר עם מכסהקורנינג3337משטח קשירת תאים
צלחת באר מרובה -  96 באר עם מכסהקורנינג3300תא קשירת תא
תא חממה מודולרית Billups-RothenbergMIC-101סט של שניים נחוץ ליצירת נורמוקסיה ותנאי היפוקסיה/חמצון מחדש בו זמנית
מד זרימה יחידBillups-RothenbergSFM3001
50 מ"מ מסנן בשורהWhatman6721-5010PTFE, נקבוביות: 1.0 ומיקרו; m
ווסת גזPro StarPRS301233סט של שניים נחוץ ליצירת נורמוקסיה ותנאי היפוקסיה/חמצון מחדש
צינור גז Class Vi Clear 5/16 Parker100-050701023 חלקים עם ~ 0.5 מ'
17 מ"מ צינור גז מתכוונן מהדקעניבותTHCSS-16
צילינדר גז נורמוקסיה PraxairNI CDOXR1U-Kגודל K (3rd הרכב הטרימסטר: 5% CO2, 8% O2, Bal. N2)
Normoxia Gas Cylinder PraxairNI CDOXR1U-Kגודל K (3rd הרכב הטרימסטר: 5% CO2, 0.5% O2, Bal. N2)
מיקרואלקטרודה חמצן Mi-730מיקרואלקטרודות INC84477
מתאם חמצןמיקרואלקטרודות INC3572
מגיב זיהוי ROS: ס"מ-H2DCFDA InvitrogenC-400
β-hCG ערכת ELISA DRG אינטרנטינלEIA-4115
נוגדן מטוהר אנטי-וימנטיןeBioscience14-9897מארח:
נוגדן אנטי-ציטוקרטין 7 (FITC) לעכבר Abcamab119697מארח: עכבר
Alexa Fluor 488 עז נגד מוס IgG H& L נוגדןLife TechnologiesA-11029
36102073310 מ"ל תאים '

מקורות

  1. Vaillancourt, C., Lanoix, D., Le Bellego, F., Daoud, G., Lafond, J. Involvement of MAPK signalling in human villous trophoblast differentiation. Mini Rev Med Chem. 9 (8), 962-973 (2009).
  2. Gauster, M., Moser, G., Orendi, K., Huppertz, B. Factors involved in regulating trophoblast fusion: potential role in the development of preeclampsia. Placenta. 30, Suppl A 49-54 (2009).
  3. Huppertz, B., Kadyrov, M., Kingdom, J. C. Apoptosis and its role in the trophoblast. Am J Obstet Gynecol. 195 (1), 29-39 (2006).
  4. Lanoix, D., Lacasse, A. A., Reiter, R. J., Vaillancourt, C. Melatonin: the smart killer: the human trophoblast as a model. Mol Cell Endocrinol. 348 (1), 1-11 (2012).
  5. Huppertz, B., Frank, H. G., Reister, F., Kingdom, J., Korr, H., Kaufmann, P. Apoptosis cascade progresses during turnover of human trophoblast: analysis of villous cytotrophoblast and syncytial fragments in vitro. Lab Invest. 79 (12), 1687-1702 (1999).
  6. Kliman, H. J., Nestler, J. E., Sermasi, E., Sanger, J. M., Strauss, J. F., 3rd, Purification, characterization, and in vitro differentiation of cytotrophoblasts from human term placentae. Endocrinology. 118 (4), 1567-1582 (1986).
  7. Lanoix, D., Beghdadi, H., Lafond, J., Vaillancourt, C. Human placental trophoblasts synthesize melatonin and express its receptors. J Pineal Res. 45 (1), 50-60 (2008).
  8. Lanoix, D., Lacasse, A. A., Reiter, R. J., Vaillancourt, C. Melatonin: The watchdog of villous trophoblast homeostasis against hypoxia/reoxygenation-induced oxidative stress and apoptosis. Mol Cell Endocrinol. 381 (1-2), 35-45 (2013).
  9. Tuuli, M. G., Longtine, M. S., Nelson, D. M. Review: Oxygen and trophoblast biology--a source of controversy. Placenta. 32, Supple 2 109-118 (2011).
  10. Chen, B., Longtine, M. S., Nelson, D. M. Pericellular oxygen concentration of cultured primary human trophoblasts. Placenta. 34 (2), 106-109 (2013).
  11. Roberts, J. M., Hubel, C. A. Is oxidative stress the link in the two-stage model of pre-eclampsia. Lancet. 354 (9181), 788-789 (1999).
  12. Burton, G. J., Jauniaux, E. Oxidative stress. Best Pract Res Clin Obstet Gynaecol. 25 (3), 287-299 (2011).
  13. Ji, L., Brkic, J., Liu, M., Fu, G., Peng, C., Wang, Y. L. Placental trophoblast cell differentiation: Physiological regulation and pathological relevance to preeclampsia. Mol Aspects Med. 34 (5), 981-1023 (2013).
  14. Redman, C. W., Sargent, I. L. Placental stress and pre-eclampsia: a revised view. Placenta. 30, Suppl A 38-42 (2009).
  15. Sagrillo-Fagundes, L., Soliman, A., Vaillancourt, C. Maternal and placental melatonin: actions and implication for successful pregnancies. Minerva Ginecol. 66 (3), 251-266 (2014).
  16. Blaschitz, A., Weiss, U., Dohr, G., Desoye, G. Antibody reaction patterns in first trimester placenta: implications for trophoblast isolation and purity screening. Placenta. 21 (7), 733-741 (2000).
  17. Potgens, A. J., Gaus, G., Frank, H. G., Kaufmann, P. Characterization of trophoblast cell isolations by a modified flow cytometry assay. Placenta. 22 (2-3), 251-255 (2001).
  18. Petroff, M. G., Phillips, T. A., Ka, H., Pace, J. L., Hunt, J. S. Isolation and culture of term human trophoblast cells. Methods Mol Med. 121, 203-217 (2006).
  19. Maldonado-Estrada, J., Menu, E., Roques, P., Barre-Sinoussi, F., Chaouat, G. Evaluation of Cytokeratin 7 as an accurate intracellular marker with which to assess the purity of human placental villous trophoblast cells by flow cytometry. J Immunol Methods. 286 (1-2), 21-34 (2004).
  20. Le Bellego, F., Vaillancourt, C., Lafond, J. Isolation and culture of term human cytotrophoblast cells and in vitro methods for studying human cytotrophoblast cells' calcium uptake. Methods Mol Biol. 550, 73-87 (2009).
  21. Mounier, C., Barbeau, B., Vaillancourt, C., Lafond, J. Endocrinology and cell signaling in human villous trophoblast. Methods Mol Biol. 550, 89-102 (2009).
  22. Chen, B., et al. Pomegranate juice and punicalagin attenuate oxidative stress and apoptosis in human placenta and in human placental trophoblasts. Am J Physiol Endocrinol Metab. 302 (9), 1142-1152 (2012).
  23. Reti, N. G., et al. Effect of high oxygen on placental function in short-term explant cultures. Cell Tissue Res. 328 (3), 607-616 (2007).
  24. Pidoux, G., et al. Biochemical characterization and modulation of LH/CG-receptor during human trophoblast differentiation. J Cell Physiol. 212 (1), 26-35 (2007).
  25. Pidoux, G., et al. ZO-1 is involved in trophoblastic cell differentiation in human placenta. Am J Physiol Cell Physiol. 298 (6), 1517-1526 (2010).
  26. Williams, J. L., Fyfe, G. K., Sibley, C. P., Baker, P. N., Greenwood, S. L. K+ channel inhibition modulates the biochemical and morphological differentiation of human placental cytotrophoblast cells in vitro. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 295 (4), 1204-1213 (2008).
  27. Schild, R. L., Schaiff, W. T., Carlson, M. G., Cronbach, E. J., Nelson, D. M., Sadovsky, Y. The activity of PPAR gamma in primary human trophoblasts is enhanced by oxidized lipids. J Clin Endocrinol Metab. 87 (3), 1105-1110 (2002).
  28. Menendez-Pelaez, A., Reiter, R. J. Distribution of melatonin in mammalian tissues: the relative importance of nuclear versus cytosolic localization. J Pineal Res. 15 (2), 59-69 (1993).
  29. Perrone, S., Stazzoni, G., Tataranno, M. L., Buonocore, G. New pharmacologic and therapeutic approaches for hypoxic-ischemic encephalopathy in the newborn. J Matern Fetal Neonatal Med. 25, Suppl 1 83-88 (2012).
  30. Nelissen, E. C., van Montfoort, A. P., Dumoulin, J. C., Evers, J. L. Epigenetics and the placenta. Hum Reprod Update. 17 (3), 397-417 (2011).
  31. Barker, D. J. Intrauterine programming of adult disease. Mol Med Today. 1 (9), 418-423 (1995).
  32. Barker, J. R., Thomas, C. F., Behan, M. Serotonergic projections from the caudal raphe nuclei to the hypoglossal nucleus in male and female rats. Respir Physiol Neurobiol. 165 (2-3), 175-184 (2009).
  33. Yui, J., et al. Functional, long-term cultures of human term trophoblasts purified by column-elimination of CD9 expressing cells. Placenta. 15 (3), 231-246 (1994).
  34. Kilani, R. T., Chang, L. J., Garcia-Lloret, M. I., Hemmings, D., Winkler-Lowen, B., Guilbert, L. J. Placental trophoblasts resist infection by multiple human immunodeficiency virus (HIV) type 1 variants even with cytomegalovirus coinfection but support HIV replication after provirus transfection. J Virol. 71 (9), 6359-6372 (1997).
  35. Knofler, M., Stenzel, M., Husslein, P. Shedding of tumour necrosis factor receptors from purified villous term trophoblasts and cytotrophoblastic BeWo cells. Hum Reprod. 13 (8), 2308-2316 (1998).
  36. Douglas, G. C., King, B. F. Isolation of pure villous cytotrophoblast from term human placenta using immunomagnetic microspheres. J Immunol Methods. 119 (2), 259-268 (1989).
  37. Li, L., Schust, D. J. Isolation, purification and in vitro differentiation of cytotrophoblast cells from human term placenta. Reprod Biol Endocrinol. 13, 71(2015).
  38. Stenqvist, A. C., et al. An efficient optimized method for isolation of villous trophoblast cells from human early pregnancy placenta suitable for functional and molecular studies. Am J Reprod Immunol. 60 (1), 33-42 (2008).
  39. Potgens, A. J., Kataoka, H., Ferstl, S., Frank, H. G., Kaufmann, P. A positive immunoselection method to isolate villous cytotrophoblast cells from first trimester and term placenta to high purity. Placenta. 24 (4), 412-423 (2003).
  40. Lanoix, D., Vaillancourt, C. Cell culture media formulation and supplementation affect villous trophoblast HCG release. Placenta. 31 (6), 558-559 (2010).
  41. Vaillancourt, C., Lafond, J. Human embryogenesis: overview. Methods Mol Biol. 550, 3-7 (2009).
  42. Armant, D. R., et al. Human trophoblast survival at low oxygen concentrations requires metalloproteinase-mediated shedding of heparin-binding EGF-like growth factor. Development. 133 (4), 751-759 (2006).
  43. McCaig, D., Lyall, F. Hypoxia upregulates GCM1 in human placenta explants. Hypertens Pregnancy. 28 (4), 457-472 (2009).
  44. Burton, G. J., et al. Optimising sample collection for placental research. Placenta. 35 (1), 9-22 (2014).
  45. Lanoix, D., et al. Quantitative PCR pitfalls: the case of the human placenta. Mol Biotechnol. 52 (3), 234-243 (2012).
  46. Bilban, M., et al. Trophoblast invasion: assessment of cellular models using gene expression signatures. Placenta. 31 (11), 989-996 (2010).
  47. Novakovic, B., et al. Wide-ranging DNA methylation differences of primary trophoblast cell populations and derived cell lines: implications and opportunities for understanding trophoblast function. Mol Hum Reprod. 17 (6), 344-353 (2011).
  48. Burleigh, D. W., et al. Microarray analysis of BeWo and JEG3 trophoblast cell lines: identification of differentially expressed transcripts. Placenta. 28 (5-6), 383-389 (2007).
  49. Hung, T. H., Skepper, J. N., Charnock-Jones, D. S., Burton, G. J. Hypoxia-reoxygenation: a potent inducer of apoptotic changes in the human placenta and possible etiological factor in preeclampsia. Circ Res. 90 (12), 1274-1281 (2002).
  50. Heazell, A. E., Moll, S. J., Jones, C. J., Baker, P. N., Crocker, I. P. Formation of syncytial knots is increased by hyperoxia, hypoxia and reactive oxygen species. Placenta. 28, Suppl A 33-40 (2007).
  51. Heazell, A. E., Lacey, H. A., Jones, C. J., Huppertz, B., Baker, P. N., Crocker, I. P. Effects of oxygen on cell turnover and expression of regulators of apoptosis in human placental trophoblast. Placenta. 29 (2), 175-186 (2008).
  52. Chen, B., Longtine, M. S., Nelson, D. M. Hypoxia induces autophagy in primary human trophoblasts. Endocrinology. 153 (10), 4946-4954 (2012).
  53. Lanoix, D., Guerin, P., Vaillancourt, C. Placental melatonin production and melatonin receptor expression are altered in preeclampsia: new insights into the role of this hormone in pregnancy. J Pineal Res. 53 (4), 417-425 (2012).
  54. Galano, A., Tan, D. X., Reiter, R. J. Melatonin as a natural ally against oxidative stress: a physicochemical examination. J Pineal Res. 51 (1), 1-16 (2011).
  55. Alers, N. O., Jenkin, G., Miller, S. L., Wallace, E. M. Antenatal melatonin as an antioxidant in human pregnancies complicated by fetal growth restriction--a phase I pilot clinical trial: study protocol. BMJ Open. 3 (12), 004141(2013).
  56. Hobson, S. R., Lim, R., Gardiner, E. E., Alers, N. O., Wallace, E. M. Phase I pilot clinical trial of antenatal maternally administered melatonin to decrease the level of oxidative stress in human pregnancies affected by pre-eclampsia (PAMPR): study protocol. BMJ Open. 3 (9), 003788(2013).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

Beta hCG
ראשוניים האדם Trophoblast דגם תרבית תאים כדי לחקור את ההשפעות המגנות של מלטונין נגד היפוקסיה / נגרמת reoxygenation שיבוש
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.