הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

תרבות של Macrophage מושבה מגרה פקטור בדיל אדם המקרופאגים מונוציטים הנגזר

30.6K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/54244

⸱

30 ביוני 2016

 , 
1Experimental Atherosclerosis Section, National Heart, Lung, and Blood Institute, National Institutes of Health

במאמר זה

סיכום

מוצג פרוטוקול לתרבית תאים של מקרופאגים שמקורם בגורם מגרה מושבת מקרופאגים (M-CSF). הפרוטוקול משתמש בשימור בהקפאה של מונוציטים יחד עם התמיינות בתפזורת שלהם למקרופאגים. לאחר מכן ניתן לזרוע מקרופאגים שנקטפו לבארות תרבית בצפיפות התאים הנדרשת לביצוע ניסויים.

תקציר

מוצג פרוטוקול לתרבית תאים של מקרופאגים שמקורם בגורם מגרה מושבת מקרופאגים (M-CSF). לצורך התחלת ניסויים, מונוציטים טריים או קפואים מתורבתים בצלוחיות למשך שבוע אחד עם M-CSF כדי לגרום להתמיינות שלהם למקרופאגים. לאחר מכן, ניתן לקצור את המקרופאגים ולזרוע אותם לבארות תרבית בצפיפות התאים הנדרשת לביצוע ניסויים. השימוש במספרים מוגדרים של מקרופאגים במקום במספרים מוגדרים של מונוציטים כדי ליזום תרביות מקרופאגים לניסויים מניב תרביות מקרופאגים שבהן ניתן להשיג את צפיפות התאים הרצויה באופן עקבי יותר. שימוש במונוציטים שמורים בהקפאה מפחית את התלות בזמינות התורם ומייצר תרביות מקרופאגים הומוגניות יותר.

מבוא

חקר מקרופאגים מתורבתים הוא מודל שימושי להבנת תפקודם של תאים אלה בדלקת, כפי שקורה בפלאק טרשת עורקים. כאשר המחקר מתמקד במחלות אנושיות הכוללות מקרופאגים, כדאי לחקור מקרופאגים אנושיים ראשוניים ולא מקרופאגים לא אנושיים כדי למנוע הבדלים בין מינים. כמו כן, ניתן להימנע מההשפעות של טרנספורמציה תאית על ידי שימוש במקרופאגים ראשוניים ולא בקווי תאים של מקרופאגים. למטרה זו, מקרופאגים המובחנים ממונוציטים המבודדים מדם אנושי משמשים כאמצעי להשגת מקרופאגים אנושיים ראשוניים.

מקרופאגים ברקמות עשויים להיות שוכנים בתוך רקמות או עשויים להיגזר ממונוציטים הנודדים לרקמה ומתמיינים למקרופאגים 1. הוגדרו שני סוגים של מקרופאגים אנושיים שמקורם במונוציטים הנבדלים זה מזה לא רק במורפולוגיה אלא גם בביטוי גנים ובתפקוד התא 2. שני סוגים אלה מתקבלים ממונוציטים המובחנים למקרופאגים בנוכחות M-CSF + סרום בקר עוברי (FBS) ומונוציטים המובחנים למקרופאגים בנוכחות גורם מגרה מושבת גרנולוציטים-מקרופאגים (GM-CSF) + FBS 2-6. מניסיוננו (תצפית שלא פורסמה), שימוש בסרום אנושי ולא ב-FBS מייצר את סוג ה-GM-CSF ללא קשר אם M-CSF או GM-CSF כלולים במדיום ההתמיינות. מקרופאגים מסוג M-CSF נוטים להיות מוארכים יותר מאשר מקרופאגים מסוג GM-CSF, הדומים לביצים מטוגנות במורפולוגיה שלהם. על החוקרים להכיר בכך שמקרופאגים אנושיים שמקורם ב-M-CSF ו-GM-CSF אינם זהים למה שנקרא מקרופאגים שמקורם במח עצם עכבר M1 ו-M2 6.

במהלך מחקר באמצעות מקרופאגים מובחנים M-CSF שמקורם במונוציטים אנושיים, חווינו קושי הקשור לזמינות של מונוציטים ליזום ניסויים ושונות בצפיפות התאים המתקבלת של מקרופאגים במהלך התמיינות של מונוציטים למקרופאגים. כדי להתגבר על בעיות אלה, פיתחנו את הפרוטוקול הבא שבו מונוציטים מוקפאים עד שהם נדרשים לשימוש, ומונוציטים מובחנים בכמויות גדולות למקרופאגים שניתן להסיר אותם מצלוחיות התרבית ולצפות אותם בצפיפות התאים הרצויה כדי לקבל תרביות אחידות יותר מניסוי לניסוי.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

Leukapheresis בוצע תחת פרוטוקול המחקר של הסובייקט אנושי שאושר בידי מכוני הלאומיים לוח סקירה מוסדית הבריאות.

1. ניתוק ו Cryopreservation של מונוציטים

  1. להשיג תאים mononuclear ידי leukapheresis התורמים אדם, ולהעשיר מונוציטים ידי elutriation צנטריפוגה רציפה נגד זרימה של תאים mononuclear כמתואר אזכור 7,8. השג כ 100 x 10 6 תאים elutriated (כ -80 - 90 מונוציטים%) במאגר elutriation שצוינו על ידי היצרן. ספירת תאים באמצעות hemocytometer.
  2. מונוציטים צנטריפוגה בתוך צינור פוליפרופילן 15 מ"ל ב 300 XG במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.
  3. הסר את supernatant בעדינות resuspend התאים FBS ואחריו sulfoxide דימתיל כדי להשיג ריכוז סופי של sulfoxide דימתיל 90% FBS / 10% ו -50 x 10 6 תאים / מ"ל.
  4. הוסף כל מ"ל של התא תלוי על העריסהo cryovial הפרט.
  5. מניחים את cryovials במיכל הקפאה תא ולהעביר מקפיא -80 מעלות צלזיוס למשך 24 שעות לפני העברת טנק אחסון cryovial חנקן נוזלי עבור אחסון לטווח ארוך.

בידול 2. של מונוציטים לתוך המקרופאגים

  1. פשרת cryovial של תאים על ידי העברה במהירות באמבט מי 37 ° C ומייד הסרה כאשר השעית התא הפשירה כ -70%.
  2. מיד עם ההפשרה מלאה בטמפרטורת החדר, להעביר את 1 מ"ל תוכנו cryovial לתוך 50 מ"ל של 37 ° C חימם רוזוול פארק הזיכרון במכון (RPMI) 1640 בינוני עם 2 מ"מ L- גלוטמין, 50 ng / ml M-CSF, 25 ng / ml interleukin-10 (IL-10), ו -10% FBS (בינוני מלא).
  3. העברת 25 מ"ל של השעיה מונוציטים לתוך כל אחת משתי 75 ס"מ 2 צלוחיות תרבית תאים פלסטיק.
  4. דגירת תרבויות בתוך חממת תרבית תאי 37 ° C עם אוויר 5% CO 2/95% למשך 48 שעות.
  5. שוטפים את מ"קltures 3 פעמים עם 10 מיליליטר RPMI 1640 בינוניים (מחומם מראש ל 37 מעלות צלזיוס), הסרת בינוני התרבות בעדינות כדי למנוע פירוק כל תאים מחוברים באופן רופף.
  6. בעקבות שטיפה, להוסיף בינוני שלם טרי, שינוי בינוני כל 2 ימים עד מונוציטים להבדיל מתרבים מספיק להיות ומחוברות. זה דורש כשבוע של התרבות.

המקרופאגים קציר 3. ליזום ניסויים

  1. לשטוף מקרופאגים הבדיל ב הבקבוק 3 פעמים עם 10 מ"ל מראש חימם 37 ° שנאגרו מלוחים פוספט של C Dulbecco ללא Ca 2 + ו Mg 2+ לפני הוספת 10 מ"ל מראש חימם 37 ° C 0.25% טריפסין-ethylenediaminetetraacetic חומצה פתרון (EDTA).
  2. מקום בקבוק באינקובטור תרבית תאים עבור 10 - 15 דקות שאז כ 90% של מקרופאגים צריכים מעוגלים ומנותקות. לבדוק זאת על ידי בדיקה מיקרוסקופית של הבקבוק.
  3. הוסף 10 מ"ל של מדיום RMPI 1640 המכיל 10% FBS כדי strypsinization העליון.
  4. מעבירים את ההשעיה תא מקרופאג מהבקבוק לתוך צינור פוליפרופילן 50 מ"ל, צנטריפוגה XG 300 במשך 5 דקות, וזורקים supernatant.
  5. Resuspend בעדינות את מקרופאגים לתוך 1 מ"ל של מדיום מלאה.
  6. מערבבים 10 μl של השעיה תא מקרופאג עם 10 μl פתרון Trypan כחול לקבוע מספר הסלולרי מקרופאג הכדאיות (בדרך כלל> 95%) באמצעות hemocytometer.
  7. בהתבסס על ספירת התאים (בדרך כלל בערך 15 - 18 x 10 5 מקרופאגים), להוסיף בינוני מלא נוסף כדי להשיג את צפיפות תאי זריעה הרצויה. הערה: 1 x 10 5 מקרופאגים 1.5 מ"ל בינוני לכל גם צלחת 12 גם יפיק התרבות ליד ומחוברות.
  8. בעקבות זריעה, דגירת מקרופאגים לילה חממת תרבית תאי 37 ° C עם 5% CO 2/95% אוויר לאפשר התקשרות תא. לאחר מכן, מתחיל ניסויים רצויים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

הכדאיות של מונוציטים טריים או cryopreserved היה יותר מ -95% כפי שנקבע עם Trypan כחול מכתים 9. איור 1 ואיור 2 להשוות בבית התחתון בהגדלות גדולות, בהתאמה, את ההתקדמות של בידול מונוציטים טריים cryopreserved (כלומר, קפוא) לתוך מקרופאגים. ראוי לציין, כי טרי לעומת מונוציטים cryopreserved להראות subpopulation של הבחנה מונוציטים כי אינם מתפשטים אבל להישאר מעוגל. vacuoles-לוסנט שלב להתרחש...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

יצירת סוגים מקרופאג מוגדר יכול להבהיר כמה תוצאות סותרות שהגיעו לידי החוקרים כאשר לומדים ביולוגיה מקרופאג. שימוש תנאי תרבות שונים וגורם בידול כדי ליצור מקרופאגים אדם מן המעלה ראשון יכולים להוביל סוגי מקרופאג שונים מאוד, עובדה כי לא יכול להיות מוערכת על ידי החוקר. לדוגמא, מקרופאגים לפעמים נוצרים מתוך מונוציטים אדם ללא שימוש בסרום, נסיוב אדם לבד, נסיוב האדם השלים עם M-CSF, FBS לבד, או FBS המכיל M-CSF או GM-CSF. כפי שדווח בעבר וכפי שאנו גם ציינו, מונוציטים מתורבתים במשך שבוע ללא סרום ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

למחברים אין מה לחשוף.

תודות

המחלקה לרפואת עירוי, המרכז הקליני, המכונים הלאומיים לבריאות, סיפקה מונוציטים משופרים. עבודה זו נתמכה על ידי תוכנית המחקר התוך-כיתתי, המכון הלאומי ללב, ריאות ודם, המכונים הלאומיים לבריאות.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
צלחת תרבית 12 בארות CellbindCorning3336
CELLSTAR, בקבוק T-75, תרבית רקמות מטופלתGreiner Bio-One צפון אמריקה658157
מדיום תרבית RPMI 1640Cellgro Mediatech15-040-CMמחומם ל-37 מעלות; C
L-גלוטמיןCellgro Mediatech25-005-CI
סרום בקר עובריGibco16000-036
M-CSFPeproTech300-25
GM-CSFPeproTech300-03
IL-10 PeproTech200-10
DMSOSigmaD2650
Cryovial תרמו סיינטיפיק 
DPBS ללא Ca2+ ו-Mg2+ קורנינג סלגרו21-031-CV
0.25% טריפסין-EDTA Gibco25200-056
50 מ"ל צינור חרוטי מפוליפרופילןFalcon352070
Trypan BlueLonza17-942E
Hemocytometer אור בהיר משופר נויבאוארPaul Marienfeld GmbH & Co. KG610031http://www.marienfeld-superior.com/index.php/counting-chambers/articles/counting-chambers.html
הקפאת תאים CoolCell LX מיכלBioCisionBCS-405מיכלי הקפאה אחרים צריכים גם הם  להיות מתאימים לשלב זה
מערכת אחסון חנקן נוזלי, CryoPlus 1Thermo Scientific 7400כל מיכל חנקן נוזלי צריך להיות מתאים
375418

מקורות

  1. Dey, A., Allen, J., Hankey-Giblin, P. A. Ontogeny and polarization of macrophages in inflammation: blood monocytes versus tissue macrophages. Front. Immunol. 5, 683(2014).
  2. Waldo, S. W., et al. Heterogeneity of human macrophages in culture and in atherosclerotic plaques. Am. J. Pathol. 172, 1112-1126 (2008).
  3. Akagawa, K. S. Functional heterogeneity of colony-stimulating factor-induced human monocyte-derived macrophages. Int. J. Hematol. 76, 27-34 (2002).
  4. Akagawa, K. S., et al. Functional heterogeneity of colony-stimulating factor-induced human monocyte-derived macrophages. Respirology. 11 Suppl, S32-S36 (2006).
  5. Fleetwood, A. J., Lawrence, T., Hamilton, J. A., Cook, A. D. Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (CSF) and macrophage CSF-dependent macrophage phenotypes display differences in cytokine profiles and transcription factor activities: implications for CSF blockade in inflammation. J. Immunol. 178, 5245-5252 (2007).
  6. Lacey, D. C., et al. Defining GM-CSF- and macrophage-CSF-dependent macrophage responses by in vitro models. J. Immunol. 188, 5752-5765 (2012).
  7. Strasser, E. F., Eckstein, R. Optimization of leukocyte collection and monocyte isolation for dendritic cell culture. Transfus. Med. Rev. 24, 130-139 (2010).
  8. Kim, S., et al. Monocyte enrichment from leukapheresis products by using the Elutra cell separator. Transfusion (Paris). 47, 2290-2296 (2007).
  9. Strober, W. Trypan blue exclusion test of cell viability. Curr. Protoc. Immunol. Appendix 3 (Appendix 3B), (2001).
  10. Anzinger, J. J., et al. Native low-density lipoprotein uptake by macrophage colony-stimulating factor-differentiated human macrophages is mediated by macropinocytosis and micropinocytosis. Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 30, 2022-2031 (2010).
  11. Zhao, B., et al. Constitutive receptor-independent low density lipoprotein uptake and cholesterol accumulation by macrophages differentiated from human monocytes with macrophage-colony-stimulating factor (M-CSF). J. Biol. Chem. 281, 15757-15762 (2006).
  12. Freeman, S. R., et al. ABCG1-mediated generation of extracellular cholesterol microdomains. J. Lipid Res. 55, 115-127 (2014).
  13. Kruth, H. S. Receptor-independent fluid-phase pinocytosis mechanisms for induction of foam cell formation with native low-density lipoprotein particles. Curr. Opin. Lipidol. 22, 386-393 (2011).
  14. Jin, X., et al. ABCA1 contributes to macrophage deposition of extracellular cholesterol. J. Lipid Res. 56, 1720-1726 (2015).
  15. Ong, D. S., et al. Extracellular cholesterol-rich microdomains generated by human macrophages and their potential function in reverse cholesterol transport. J. Lipid Res. 51, 2303-2313 (2010).
  16. Hashimoto, S., Yamada, M., Motoyoshi, K., Akagawa, K. S. Enhancement of macrophage colony-stimulating factor-induced growth and differentiation of human monocytes by interleukin-10. Blood. 89, 315-321 (1997).
  17. Hashimoto, S. I., Komuro, I., Yamada, M., Akagawa, K. S. IL-10 inhibits granulocyte-macrophage colony-stimulating factor-dependent human monocyte survival at the early stage of the culture and inhibits the generation of macrophages. J. Immunol. 167, 3619-3625 (2001).
  18. Lund, P. K., Joo, G. B., Westvik, A. B., Ovstebo, R., Kierulf, P. Isolation of monocytes from whole blood by density gradient centrifugation and counter-current elutriation followed by cryopreservation: six years' experience. Scand. J. Clin. Lab. Invest. 60, 357-365 (2000).
  19. Weiner, R. S., Normann, S. J. Functional integrity of cryopreserved human monocytes. J. Natl. Cancer Inst. 66, 255-260 (1981).
  20. Hansen, J. B., et al. Retention of phagocytic functions in cryopreserved human monocytes. J. Leukoc. Biol. 57, 235-241 (1995).
  21. Seager Danciger, J., et al. Method for large scale isolation, culture and cryopreservation of human monocytes suitable for chemotaxis, cellular adhesion assays, macrophage and dendritic cell differentiation. J. Immunol. Methods. 288, 123-134 (2004).
  22. Jin, X., Xu, Q., Champion, K., Kruth, H. S. Endotoxin contamination of apolipoprotein A-I: effect on macrophage proliferation--a cautionary tale. Atherosclerosis. 240, 121-124 (2015).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

M CSFRPMI 1640
תרבות של Macrophage מושבה מגרה פקטור בדיל אדם המקרופאגים מונוציטים הנגזר
צור קשר
המלצה לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

2026 © זכויות יוצרים MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.