מאמר שיטה

גיבוש ליפידים אוטומטי bilayer ממברנה באמצעות סרט polydimethylsiloxane רזה

DOI:

10.3791/54258

⸱

10 ביולי 2016

 ,  ,  ,  , 
1Department of Biological Engineering, Inha University, 2Department of Mechanical Engineering, Inha University, 3Biohybrid Systems Research Center (BSRC), Inha University, 4Convergent Research Center for Metabolism and Immunoregulation (CRCMI), Inha University

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו מדגימים מערכת היווצרות bilayer שומנים שאפשר לשמור, יבילה. קרום bilayer השומנים יכול להיווצר בתוך שעה 1 עם למעלה מ -80% אחוזי הצלחה כאשר מבשר קרום קפוא מובא טמפרטורת הסביבה. מערכת זו תפחית תהליכי מייגע ומומחיות הקשורים תעלות יונים.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bilayer שומנים מלאכותי, או קרום שומנים שחור (BLM), הוא כלי רב עצמה ללימוד תעלות יוני אינטראקציות חלבון, כמו גם עבור יישומי biosensor. עם זאת, טכניקות היווצרות BLM קונבנציונליות יש כמה חסרונות ולעתים קרובות הם דורשים מומחיות ספציפית ותהליכים מייגעים. בפרט, BLMs הקונבנציונלי סובל משיעורי הצלחת היווצרות נמוכים וזמן היווצרות קרום עקבי. הנה, אנחנו מדגימים מערכת היווצרות BLM שאפשר לשמור יביל עם זמן דליל יוצא שיהיה בשליטת וקצב היווצרות BLM משופרת על ידי החלפת סרטים כמקובל בשימוש (polytetrafluoroethylene, polyoxymethylene, קלקר) כדי polydimethylsiloxane (PDMS). בניסוי זה, פולימר נקבובי מובנה כגון סרט דק PDMS משמש. בנוסף, בניגוד ממסים כמקובל בשימוש עם צמיגות נמוכה, השימוש הסקוואלין מותר זמן דליל-אאוט נשלט באמצעות קליטת ממס איטית ידי PDMS, הארכת חי קרום. במודעהdition, באמצעות תערובת של סקוואלין hexadecane, נקודת הקיפאון של הפתרון השומנים הוגדל (~ 16 ° C), בנוסף, מבשרי קרום הופקו שניתן לאחסן ללא הגבלת זמן והובל בקלות. מבשרי קרום אלה צמצמו זמן היווצרות BLM של <1 hr והשיגו קצב היווצרות BLM של ~ 80%. יתר על כן, ניסויי ערוץ יון באות A gramicidin הדגימו את ההיתכנות של מערכת הממברנה.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

קרום bilayer שומנים מלאכותי, או קרום שומנים שחור (BLM), הוא כלי חשוב עבור הבהרת מנגנונים של קרום תא תעלות יונים, כמו גם להבנת אינטראקציות בין תעלות יונים ויונים / מולקולות. 1-7 למרות ששיטת תיקון- clamp לעתים קרובות נחשב את תקן הזהב עבור מחקרים קרום התא, זה מייגע ודורש מפעילים מיומנים מאוד למדידות ערוץ יון. 8 בעוד ממברנות bilayer השומנים מחדש באופן מלאכותי התפתחו כמו כלים חלופיים ללימודי ערוץ יון, 9,10 הם קשורים גם עם מייגע תהליכי התמחות ספציפית. יתר על כן, ממברנות רגישים להפרעות מכאניות. לפיכך, טכנולוגיות bilayer שומנים הציגו עד כה יישומים מעשיים מוגבלות. 11

על מנת לשפר את חוסנו ואת תוחלת החיים של ממברנות bilayer השומנים, קוסטלו et al. 12, ו אידה Yanagida 13 פתח bilayer שומנים שעמדו חופשי בתמיכת הידרוג'ל. למרות אריכות ימים משופרים לעומת זאת (<24 שעות), איתנות bilayer לא השתפרו. ג'און et al. 14 פתח קרומי כמוס הידרוג'ל (HEM) עם קשר bilayer הידרוג'ל-שומנים אינטימיים, וכתוצאה מכך אריכות ימים משופרים (עד כמה ימים). כדי להגביר עוד יותר את משך החיים של שולי, Malmstadt ו ג'און et al. נוצר קרום כמוס-הידרוג'ל עם שומנים בדם הידרוג'ל מחייב באמצעות in-situ נטיה קוולנטיים (cgHEM). 15 בשני מערכות, חיים הממברנה גדל באופן משמעותי (> 10 ימים) . עם זאת, מערכות היווצרות קרום לא היו מספיק חזקות, ולא יכולות להיות מאוחסנות או מועברות שבו נדרשו לשחרר מומחיות לשימוש של bilayers השומנים.

פיתוח פלטפורמת bilayer שומנים סבב בעיקר סביב איתנות הגדלת תוחלת חיים של BLMs. למרות תוחלת החיים של BLMs כבר substantially משופר לאחרונה, הבקשות שלהן עדיין מוגבלות בשל חוסר יביל ו storability. כדי להתגבר על בעיות אלה, ג'און et al. יצר מערכת קרום שאפשר לשמור והציג מבשר הממברנה (MP). 16 כדי לבנות MP, הכינו תערובת של decane n- ו hexadecane המכיל 3% DPhPC (1,2-diphytanoyl- SN -glycero-3-phosphatidylcholine) לשלוט נקודת הקיפאון של הפתרון השומנים כך שהוא יקפיא ב ~ 14 ° C (מתחת לטמפרטורת החדר, מעל טמפרטורת המקרר אופייני). בניסוי זה, חבר הפרלמנט התפרש על צמצם קטן על סרט polytetrafluoroethylene (PTFE) ובהמשך קפוא במקרר ב 4 ° C.. כאשר MP הובא לטמפרטורת חדר, חבר הפרלמנט מופשר לבין bilayer שומנים הוקם באופן אוטומטי, ביטול המומחיות הקשורות בדרך כלל היווצרות קרום. עם זאת, שיעור ההצלחה של BLM עשוי MP היה נמוך כמו ~ 27%, ואת קרום formation הזמן היה עקבי (30 דק 'ל -24 שעות), הגבלת היישומים המעשיים שלה.

במחקר זה, polydimethylsiloxane (PDMS) סרט דק משמש במקום סרטים קונבנציונאלי הידרופובי דק (PTFE, polyoxymethylene, קלקר) עד (א) בקרת זמן ייצור (ב) להגדיל את שיעור ההצלחה של היווצרות BLM כפי שדווח בעבר על ידי ריו et al. 17 בזאת, היווצרות קרום התאפשרה על ידי מיצוי בממסים בשל האופי הנקבובי של PDMS, ואת הזמן הנדרש להיווצרות קרום נשלט בהצלחה במחקר זה. במערכת זו, כפתרון השומנים נטמע הסרט הדק PDMS, זמן היווצרות קרום עקבי הושג. יתר על כן, חי קרום הוארכו עקב ספיגה איטית של ממסים לתוך PDMS סרט דק, עקב תוספת הסקוואלין לפתרון השומנים. ערכנו מדידות אופטיות וחשמליות לאמת כי קרומים נוצרו באמצעות טכניקה זו מתאימים iעל מחקרי ערוצים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. פתרון כנה

  1. הכנת פתרון חיץ:
    1. כדי לגבש פתרון חיץ, לפזר 1 M KCl (פוטסיום כלוריד), 10 מ"מ טריס- HCl (טריס-hydrochloride), ו 1 mM EDTA (חומצה Ethylenediaminetetraacetic) במים מזוקקים כדי להתאים את pH 8.0.
    2. סנן את הפתרון באמצעות מסנן 0.20 מיקרומטר. כדי לעקר, חיטוי הפתרון ב 121 מעלות צלזיוס במשך 15 דקות.
  2. הכנת פתרון שומנים עבור ציור מראש:
    1. כדי לגבש את הפתרון השומנים עבור ציור מראש, לפזר 3% DPhPC (1,2-diphytanoyl- SN -glycero-3-phosphatidylcholine) שומנים בדם (w: נ) בתערובת של 2: 8 n -decane ו hexadecane (נ: v). מערבבים לילה באמצעות הכתף.
  3. הכנת פתרון שומנים להיווצרות קרום:
    1. כדי לגבש את הפתרון השומנים להיווצרות קרום, לפזר 0.1% DPhPC (1, 2-diphytanoyl- SN -glycero-3-phosphatidylcholine) שומנים בדם (w: נ) בתערובת של 2: 8 מ"רualene ו hexadecane (v: v). מערבבים לילה באמצעות הכתף.

2. כינונה של סרט דק PDMS

  1. מערבבים PDMS וסוכן ריפוי בתוך 9: 1 (w / w) יחס בכוס ערבוב כדי ליצור את prepolymer PDMS. הוסף 5 גרם של prepolymer PDMS כדי בצלחת פטרי כדי ליצור את PDMS סרט דק (עובי 200 - 250 מיקרומטר). מורחים PDMS מראש פולימר באמצעות coater ספין ב 800 סל"ד במשך 10 שניות כדי ליצור סרט דק.
  2. מניחים את צלחת פטרי לתוך ואקום ייבוש בלחץ של 100 mTorr עבור שעה 2 כדי להסיר בועות אוויר. כדי לפלמר סרט דק מראש פולימר, ואופים בתנור במשך 5 שעות על 70 מעלות צלזיוס.
  3. כדי לעשות סרט מרובע PDMS דק, לחתוך את סרט דק PDMS polymerized לתוך 2 x 2 ס"מ 2 ריבועים. השתמש אגרוף מייקרו 500 מיקרומטר לעשות צמצם במרכז של PDMS סרט דק. פתחים טרום צבע עם 3% DPhPC שומני פתרון מעורב 2: 8 n- decane ו hexadecane.

3. ייצור קאמרי Assembly

  1. כדי לפברק תא BLM, עיצוב שני רחובות סימטרי של החדר באמצעות תוכנת ציור 3D עם מידות החיצוני של 4 ס"מ x 1.5 ס"מ x 1 ס"מ ומימדים הפנימי היטב של 1.5 ס"מ x 1.3 ס"מ x 0.8 ס"מ 17.
  2. לעצב את החדר באמצעות בלוק PTFE עם מכונת CNC ופעל לפי הוראות היצרן.

4. אסיפה קאמרית

  1. כדי להרכיב את התא, למקם את הסרט הדק מראש צבוע-PDMS בין שני גושי PTFE כך הצמצם על סרט PDMS הדק מיושר עם החור בתא.
  2. חותם את הקצוות החיצוניים של החדר באמצעות זכוכית לכסות עם גריז (הקלת תצפית אופטית). לשתק את התא נאסף באמצעות ברגים ואומים.
    הערה: ודא הקאמרי הוא חתום היטב כך שאין דליפת נוזלים.

גיבוש 5. של המבשר ממברנה עם דחוף הרכבה עצמית גיבוש (השגיאות המרביות המותרות)

  1. בעזרת פיפטה, להפקיד 0.5μl של שומני 0.1% DPhPC המעורבים 2: 8 n -decane: hexadecane על הצמצם של סרט PDMS הדק התאסף עם הקאמרי.
  2. לפני השימוש, לאחסן בתא במקפיא או במקרר מתחת ל -10 מעלות צלזיוס.

6. גיבוש ממברנה ואימות

  1. כדי ליצור BLM עם השגיאות המרביות המותרות, למשוך את תא מהמקרר להשעות 2 מ"ל של תמיסת חיץ בכל צד של החדר. הגדר את התא בצד <10 דק 'עד מבשר הקרום הקפוא מפשיר.
  2. מניחים את החדר על micromanipulator לשלוט העלאת דווקא ביחס למקור אור המיקרוסקופ. להאיר צד אחד של החדר כמקור אור באמצעות פנס סיבים אופטי הלוגן כדי להאיר את הצמצם של PDMS הסרט דק להסתכלות אופטית של תהליך היווצרות BLM.
  3. בצד השני, למקם מיקרוסקופ דיגיטלי אנכי ביחס למקור האור להתבונן היווצרות BLM (להגדיל ב -200x).
  4. כדי לאשר היווצרות BLM, להשקיף על מרכז של הצמצם שבו הצבע הופך בהיר יותר annulus.

7. הקלטת חשמל

  1. למדידת חשמל, להכין אלקטרודות Ag / Cl באמצעות חוט כסף בעובי מיקרומטר 208 וחומר הלבנת חומצת סודיום> 1 דקות. הנח את האלקטרודות Ag / Cl לתוך מכל צד של החדר העמוק מספיק כדי להיות טבל פתרון החיץ.
  2. חברו את האלקטרודות למגבר microelectrode. באמצעות תוכנה אלקטרופיזיולוגיה, להחיל צורת גל משולש ± 10 mV דרך הממברנה לרכוש גל מרובע. גדר החלת מתח על ידי לחיצה על החצים הצביעו על V_clamp (mV).
  3. רשמו את התכונות החשמליות של קרום על ידי לחיצה על כפתור ההקלטה (סמל נקודה אדומה). המשך עם הקלטה עד גל מרובע אחיד הוא ציין. צא ההקלטה על ידי לחיצה על סמל הריבוע השחור.

8. ערוץ יון התאגדות

לֹאE: A Gramicidin (GA) התאגדות מתרחשת באופן ספונטני עם התהוותן של BLM, כמו GA מתווסף ישירות פתרון השומנים.

  1. כדי להתבונן בפעילות ערוץ GA, להחיל 100 mV דרך הממברנה בקצב דגימה של 5 kHz למדוד מחזיק הפוטנציאל של הממברנה. גדר החלת מתח על ידי לחיצה על החצים הצביעו על V_clamp (mV).
  2. רשום את המאפיינים החשמליים של התאגדות GA-ידי לחיצה על כפתור ההקלטה (סמל נקודה אדום). המשך ההקלטה עד קפיצות נוכחיות הוא ציינה. צא ההקלטה על ידי לחיצה על סמל הריבוע השחור.
  3. לאחר רכישת נתונים חשמל, לסנן את הנתונים עם מסנן נמוך לעבור Bessel ב 100 הרץ באמצעות תוכנת אלקטרופיזיולוגיה.
  4. שים קפיצות נוכחיות בנתוני פוטנציאל החזקת המסוננים (כל קפיצה הנוכחית, ~ 0.15 nS, מייצג dimerization של ערוץ יון ג'י אי) לאמת התאגדות GA.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אופטימיזציה של הרכב תמיסות השגיאות המרביות המותרות
בהרכבים שונים של שומנים וממיסים נבדקו בהצלחה כדי לשקם ממברנות bilayer השומנים מן השגיאות המרביות המותרות. מערכת MP בתערובת של decane n- ו hexadecane המכיל 3% DPhPC 14 הציגה שיעור הצלחה נמוך של היווצרות קרום (~ 27%). בנוסף, כמו סרט PDMS החילוץ ברציפות פתרון שומנים, היה צורך לייעל רכב ממס לשמור על קרום bilayer שומנים ללא פגע. לכן, הסקוואלין, אשר יש צמיגות של ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

טכניקת היווצרות ה-BLM שלנו מספקת כלי רב עוצמה למחקרי קרום התא ותעלות יונים, בניגוד לטכניקות קונבנציונליות בעלות פוטנציאל מוגבל לשימוש תעשייתי. פיתחנו מבשר ממברנה באמצעות סרט דק PDMS, ותכננו מבשר ממברנה קפוא עם הרכבה עצמית מזורזת.

בניגוד לשיטות היווצרות ממברנה קונבנציונליות עם סרטים הידרופוביים, שבהן היווצרות הממברנה מתרחשת רק באמצעות אינטראקציות פני השטח בין הסרט לתמיסת השומנים,20 דילול הממברנה בסרטי PDMS מתרחש באמצעות אינטראקציות פני השטח ומיצוי ממס על ידי סרט PDMS. ספיגת ממס לנקבו...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למחברים אין מה לחשוף.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עבודה זו נתמכה על ידי תוכנית מרכז המחקר החלוצי (NRF-2012-0009575) ומענקי קרן המחקר הלאומית (NRF-2012R1A1B4002413, NRF-2014R1A1A2059341) מקרן המחקר הלאומית של קוריאה. עבודה זו נתמכה גם באופן חלקי על ידי מענק המחקר של אוניברסיטת Inha.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
אשלגן כלוריסיגמא-אולדריץ'P9333לתמיסת חיץ
Tris-hydrochlorideSigma-Aldrich1185-53-1לתמיסת חיץ
Ethylenediaminetetraacetic חומצהSigma-Aldrich60-00-4לתמיסת חיץ
n-decaneSigma-Aldrich44074-Uלתמיסת
שומניםHexadecaneSigma-Aldrich544-76-3לתמיסת שומנים
SqualeneSigma-AldrichS3626לתמיסת שומנים
Gramicidin ASigma-Aldrich11029-61-1חלבון ממברנה
1,2-diphytanoyl-sn-glycero-3-phosphocholineAvanti Polar Lipids, Inc.850356להיווצרות ממברה
Sylgard 184a ו-184b ערכת אלסטרומרדאו קורנינג אסיהלייצור סרט דק PDMS
0.2 μ m filterSatorius stedim16534----------Kלסינון תמיסת חיץ
מסובבFinePCRAGלהמסת שומנים באופן הומוגני
AutoclaveBiofreeBF-60ACלעיקור תמיסת חיץ
Spin coaterShinu MstSP-60Pלפיזור PDMS prepolymer
Vaccum dessiccatorWelch2042-22להסרת בועת אוויר ב-PDMS prepolymer
500 μ מ  אגרוףHarris Uni-Core0.5ליצירת צמצם במכונת CNC הסרט הדק PDMS
SME מסחרSME 2518לייצור תא היווצרות ממברנה
תא הלוגן סיבים אופטייםMoticMLC-150Cכדי להאיר את הצמצם של סרט דק PDMS לתצפית אופטית
מיקרוסקופ דיגיטליכחולדיגיטלי QX-5להתבוננות אופטית בקרום דו-שכבתי שומנים היווצרות
אלקטרודהA-Mלהתבוננות חשמלית בהיווצרות ממברנה
מגבר מיקרואלקטרודה (מגבר Axopatch)Axon Instrumentsמגבר Axopatch 200Bלמדידת קיבול הממברנה (מתואר כמגבר מיקרואלקטרודה בכתב היד)
מערכות

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Hanke, W., Schulue, W. Planar lipid bilayers: methods and applications. , Academic Press. (2012).
  2. Mirzabekov, T. A., Silberstein, A. Y., Kagan, B. L. Use of planar lipid bilayer membranes for rapid screening of membrane active compounds. Methods Enzymol. 294, 661-674 (1999).
  3. Bayley, H., Cremer, P. S. Stochastic sensors inspired by biology. Nature. 413 (6852), 226-230 (2001).
  4. Fang, Y., Lahiri, J., Picard, L. G protein-coupled receptor microarrays for drug discovery. Drug. Discov. Today. 8 (16), 755-761 (2003).
  5. Majd, S., et al. Applications of biological pores in nanomedicine, sensing, and nanoelectronics. Curr. Opin. Biotechnol. 21 (4), 439-476 (2010).
  6. Kim, Y. R., et al. Synthetic Biomimetic Membranes and Their Sensor Applications. Sensors (Basel). 12 (7), 9530-9550 (2012).
  7. Ryu, H., et al. Investigation of Ion Channel Activities of Gramicidin A in the Presence of Ionic Liquids Using Model Cell Membranes. Sci Rep. 5, (2015).
  8. Wood, C., Williams, C., Waldron, G. J. Patch clamping by numbers. Drug. Discov. Today. 9 (10), 434-441 (2004).
  9. Mueller, P., Rudin, D. O., Tien, H. T., Wescott, W. C. Reconstitution of cell membrane structure in vitro and its transformation into an excitable system. Nature. 194, 979-980 (1962).
  10. Montal, M., Mueller, P. Formation of bimolecular membranes from lipid monolayers and a study of their electrical properties. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 69, 3561-3566 (1972).
  11. Baaken, G., Sondermann, M., Schlemmer, C., Ruhe, J., Behrends, J. C. Planar microelectrode-cavity array for high-resolution and parallel electrical recording of membrane ionic currents. Lab Chip. 8 (6), 938-944 (2008).
  12. Costello, R., Peterson, I., Heptinstall, J., Byrne, N., Miller, L. A robust gel-bilayer channel biosensor. Adv. Mater. Opt. Electron. 8 (2), 47-52 (1998).
  13. Ide, T., Yanagida, T. An artificial lipid bilayer formed on an agarose-coated glass for simultaneous electrical and optical measurement of single ion channels. Biochem. Biophys. Res. Commun. 265 (2), 595-599 (1999).
  14. Jeon, T. J., Malmstadt, N., Schmidt, J. J. Hydrogel-encapsulated lipid membranes. J Am Chem Soc. 128 (1), 42-43 (2006).
  15. Malmstadt, N., Jeon, T. J., Schmidt, J. J. Long-Lived Planar Lipid Bilayer Membranes Anchored to an In Situ Polymerized Hydrogel. Adv. Mater. 20 (1), 84-89 (2008).
  16. Jeon, T. J., Poulos, J. L., Schmidt, J. J. Long-term storable and shippable lipid bilayer membrane platform. Lab. Chip. 8 (10), 1742-1744 (2008).
  17. Ryu, H., et al. Automated Lipid Membrane Formation Using a Polydimethylsiloxane Film for Ion Channel Measurements. Anal. Chem. 86 (18), 8910-8915 (2014).
  18. Yaws, C. Chemical Properties Handbooks: Physical, Thermodynamic, Environmental, Transport, Safety, and Health Related Properties for Organic and Inorganic Chemicals. , MC GRAW HILL HANDBOOKS. (1999).
  19. Windholz, M., Budavari, S., Stroumtsos, L. Y., Fertig, M. N. The Merck index. An encyclopedia of chemicals and drugs. , Merck & Co. (1976).
  20. Miller, C. Ion Channel Reconstitution. , Springer Science & Business Media. (1986).
  21. Miller, C. Open-state substructure of single chloride channels from Torpedo electroplax. Philos. Trans. R. Soc. Lond. B. Biol. Sci. 299 (1097), 401-411 (1982).
  22. Benz, R., Frohlich, O., Lauger, P., Montal, M. Electrical capacity of black lipid films and of lipid bilayers made from monolayers. Biochim. Biophys. Acta. 394 (3), 323-334 (1975).
  23. Priel, A., Gil, Z., Moy, V. T., Magleby, K. L., Silberberg, S. D. Ionic requirements for membrane-glass adhesion and giga seal formation in patch-clamp recording. Biophys. J. 92 (11), 3893-3900 (2007).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

APDMS

מאמרים קשורים