אנו מדגימים מערכת היווצרות bilayer שומנים שאפשר לשמור, יבילה. קרום bilayer השומנים יכול להיווצר בתוך שעה 1 עם למעלה מ -80% אחוזי הצלחה כאשר מבשר קרום קפוא מובא טמפרטורת הסביבה. מערכת זו תפחית תהליכי מייגע ומומחיות הקשורים תעלות יונים.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
גיבוש ליפידים אוטומטי bilayer ממברנה באמצעות סרט polydimethylsiloxane רזה
במאמר זה
סיכום
תקציר
Bilayer שומנים מלאכותי, או קרום שומנים שחור (BLM), הוא כלי רב עצמה ללימוד תעלות יוני אינטראקציות חלבון, כמו גם עבור יישומי biosensor. עם זאת, טכניקות היווצרות BLM קונבנציונליות יש כמה חסרונות ולעתים קרובות הם דורשים מומחיות ספציפית ותהליכים מייגעים. בפרט, BLMs הקונבנציונלי סובל משיעורי הצלחת היווצרות נמוכים וזמן היווצרות קרום עקבי. הנה, אנחנו מדגימים מערכת היווצרות BLM שאפשר לשמור יביל עם זמן דליל יוצא שיהיה בשליטת וקצב היווצרות BLM משופרת על ידי החלפת סרטים כמקובל בשימוש (polytetrafluoroethylene, polyoxymethylene, קלקר) כדי polydimethylsiloxane (PDMS). בניסוי זה, פולימר נקבובי מובנה כגון סרט דק PDMS משמש. בנוסף, בניגוד ממסים כמקובל בשימוש עם צמיגות נמוכה, השימוש הסקוואלין מותר זמן דליל-אאוט נשלט באמצעות קליטת ממס איטית ידי PDMS, הארכת חי קרום. במודעהdition, באמצעות תערובת של סקוואלין hexadecane, נקודת הקיפאון של הפתרון השומנים הוגדל (~ 16 ° C), בנוסף, מבשרי קרום הופקו שניתן לאחסן ללא הגבלת זמן והובל בקלות. מבשרי קרום אלה צמצמו זמן היווצרות BLM של <1 hr והשיגו קצב היווצרות BLM של ~ 80%. יתר על כן, ניסויי ערוץ יון באות A gramicidin הדגימו את ההיתכנות של מערכת הממברנה.
מבוא
קרום bilayer שומנים מלאכותי, או קרום שומנים שחור (BLM), הוא כלי חשוב עבור הבהרת מנגנונים של קרום תא תעלות יונים, כמו גם להבנת אינטראקציות בין תעלות יונים ויונים / מולקולות. 1-7 למרות ששיטת תיקון- clamp לעתים קרובות נחשב את תקן הזהב עבור מחקרים קרום התא, זה מייגע ודורש מפעילים מיומנים מאוד למדידות ערוץ יון. 8 בעוד ממברנות bilayer השומנים מחדש באופן מלאכותי התפתחו כמו כלים חלופיים ללימודי ערוץ יון, 9,10 הם קשורים גם עם מייגע תהליכי התמחות ספציפית. יתר על כן, ממברנות רגישים להפרעות מכאניות. לפיכך, טכנולוגיות bilayer שומנים הציגו עד כה יישומים מעשיים מוגבלות. 11
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
1. פתרון כנה
- הכנת פתרון חיץ:
- כדי לגבש פתרון חיץ, לפזר 1 M KCl (פוטסיום כלוריד), 10 מ"מ טריס- HCl (טריס-hydrochloride), ו 1 mM EDTA (חומצה Ethylenediaminetetraacetic) במים מזוקקים כדי להתאים את pH 8.0.
- סנן את הפתרון באמצעות מסנן 0.20 מיקרומטר. כדי לעקר, חיטוי הפתרון ב 121 מעלות צלזיוס במשך 15 דקות.
- הכנת פתרון שומנים עבור ציור מראש:
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
אופטימיזציה של הרכב תמיסות השגיאות המרביות המותרות
בהרכבים שונים של שומנים וממיסים נבדקו בהצלחה כדי לשקם ממברנות bilayer השומנים מן השגיאות המרביות המותרות. מערכת MP בתערובת של decane n- ו hexadecane המכיל 3% DPhPC 14 הציגה שיעור הצלחה נמוך של היווצרות קרום (~ 27%). בנוסף, כמו סרט PDMS החילוץ ברציפות פתרון שומנים, היה צורך לייעל רכב ממס לשמור על קרום bilayer שומנים ללא פגע. לכן, הסקוואלין, אשר יש צמיגות ש.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
טכניקת היווצרות ה-BLM שלנו מספקת כלי רב עוצמה למחקרי קרום התא ותעלות יונים, בניגוד לטכניקות קונבנציונליות בעלות פוטנציאל מוגבל לשימוש תעשייתי. פיתחנו מבשר ממברנה באמצעות סרט דק PDMS, ותכננו מבשר ממברנה קפוא עם הרכבה עצמית מזורזת.
בניגוד לשיטות היווצרות ממברנה קונבנציונליות עם סרטים הידרופוביים, שבהן היווצרות הממברנה מתרחשת רק באמצעות אינטראקציות פני השטח בין הסרט לתמיסת השומנים,20 דילול הממברנה בסרטי PDMS מתרחש באמצעות אינטראקציות פני השטח ומיצוי ממס על ידי סרט PDMS. ספיגת ממס לנקבו.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
למחברים אין מה לחשוף.
תודות
עבודה זו נתמכה על ידי תוכנית מרכז המחקר החלוצי (NRF-2012-0009575) ומענקי קרן המחקר הלאומית (NRF-2012R1A1B4002413, NRF-2014R1A1A2059341) מקרן המחקר הלאומית של קוריאה. עבודה זו נתמכה גם באופן חלקי על ידי מענק המחקר של אוניברסיטת Inha.
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| אשלגן כלורי | סיגמא-אולדריץ' | P9333 | לתמיסת חיץ |
| Tris-hydrochloride | Sigma-Aldrich | 1185-53-1 | לתמיסת חיץ |
| Ethylenediaminetetraacetic חומצה | Sigma-Aldrich | 60-00-4 | לתמיסת חיץ |
| n-decane | Sigma-Aldrich | 44074-U | לתמיסת |
| שומניםHexadecane | Sigma-Aldrich | 544-76-3 | לתמיסת שומנים |
| Squalene | Sigma-Aldrich | S3626 | לתמיסת שומנים |
| Gramicidin A | Sigma-Aldrich | 11029-61-1 | חלבון ממברנה |
| 1,2-diphytanoyl-sn-glycero-3-phosphocholine | Avanti Polar Lipids, Inc. | 850356 | להיווצרות ממברה |
| Sylgard 184a ו-184b ערכת אלסטרומר | דאו קורנינג אסיה | לייצור סרט דק PDMS | |
| 0.2 μ m filter | Satorius stedim | 16534----------K | לסינון תמיסת חיץ |
| מסובב | FinePCR | AG | להמסת שומנים באופן הומוגני |
| Autoclave | Biofree | BF-60AC | לעיקור תמיסת חיץ |
| Spin coater | Shinu Mst | SP-60P | לפיזור PDMS prepolymer |
| Vaccum dessiccator | Welch | 2042-22 | להסרת בועת אוויר ב-PDMS prepolymer |
| 500 μ מ אגרוף | Harris Uni-Core | 0.5 | ליצירת צמצם במכונת CNC הסרט הדק PDMS |
| SME מסחר | SME 2518 | לייצור תא היווצרות ממברנה | |
| תא הלוגן סיבים אופטיים | Motic | MLC-150C | כדי להאיר את הצמצם של סרט דק PDMS לתצפית אופטית |
| מיקרוסקופ דיגיטלי | כחול | דיגיטלי QX-5 | להתבוננות אופטית בקרום דו-שכבתי שומנים היווצרות |
| אלקטרודה | A-M | להתבוננות חשמלית בהיווצרות ממברנה | |
| מגבר מיקרואלקטרודה (מגבר Axopatch) | Axon Instruments | מגבר Axopatch 200B | למדידת קיבול הממברנה (מתואר כמגבר מיקרואלקטרודה בכתב היד) |
מקורות
- Hanke, W., Schulue, W. Planar lipid bilayers: methods and applications. , Academic Press. (2012).
- Mirzabekov, T. A., Silberstein, A. Y., Kagan, B. L. Use of planar lipid bilayer membranes for rapid screening of membrane active compounds. Methods Enzymol. 294, 661-674 (1999). ....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
