אספנו, צבענו וצילמנו תאים מהלחמית של שולי העפעף הפנימיים של נבדקים אנושיים. על ידי אפיון מורפולוגיה של תאים ופעילות מטבולית, שיטה זו עשויה לקדם את הבנתנו את העין היבשה ואת התפקיד שהחיכוך בין משטחי העין עשוי למלא בתפיסת אי נוחות בעיניים.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
במאמר זה
סיכום
תקציר
קיימים מעט דיווחים על האנטומיה התאית של אזור מגב העפעף (LW) של העפעף הפנימי ורק דיווח אחד עושה שימוש בשיטות ציטולוגיות. האופטימיזציה של שיטת איסוף, צביעה והדמיה של תאים מאזור LW באמצעות ציטולוגיה של רושם (IC) מתוארת במחקר זה. תאים נאספים מהמשטח הפנימי של העפעף העליון של נבדקים אנושיים באמצעות ממברנות פוליטטרפלואורואתילן הידרופיליות (PTFE), ונצבעו בצבעים ציטולוגיים כדי לחשוף את נוכחותם של תאי גביע, מוצין, גרעיני תאים ודרגות שונות של קדם-קרטיניזציה ופארה-קרטיניזציה. צבעים אימונוציטוכימיים מראים פעילות אסטראז תאים וקרומי תאים שנפגעו על ידי שימוש במיקרוסקופ לייזר סורק קונפוקלי. עד 100 תמונות דיגיטליות מיקרוסקופיות נלכדות עבור כל דגימה ותפורות לתמונה ברזולוציה גבוהה בקנה מידה גדול של כל טווח ה-IC. אנו מדגימים רגישות גבוהה יותר של IC ממה שדווח בעבר, המתאימה לזיהוי מורפולוגיות תאיות ופעילות מטבולית באזור LW. למיטב ידיעתנו, זו הפעם הראשונה שמבחר זה של צבעים פלואורסצנטיים שימש להדמיית ממברנות LW IC. פרוטוקול זה יהיה יעיל במחקרים עתידיים כדי לחשוף פרטים לא מתועדים של אזור ה-LW, כגון הערכת מאפיינים תאיים של מרכיבי עדשות מגע או חולים עם אפיתל עין יבשה או מגב עפעפיים.
מבוא
העפעף העליון האנושי מבצע כ -10,000 מהבהבת מדי יום 1, עם רק 1 - באזור לחמית 2 מ"מ צר מנוגדי העולם העיני. בשל התנועה המנגבת שלה במהלך למצמץ, חלק זה של שולי העפעף זכה לכינוי באזור "מגב מכסה" 2. ההנחה היא כי החיכוך הוא גדל באזור זה במהלך מהבהב הרגיל, בשל המכסה מנגב רחבי הגלובוס. זה עשוי לשחק תפקיד משמעותי בנוחות עינית. עדשות מגע חובשים באי נוחות עינית ניסיון מסוים וזאת אחת הסיבות העיקריות הפסקת עדשה ללבוש 3. כאשר עדשות מגע מושמות על העין, מקדם החיכוך בין חומר העדשה ואת משטח העין הוכח לשנות 4. יש ראיות המצביעות על כך סימפטומים יובש יכולים להיות קשורים חיכוך שונה זו 2,5,6.
קשר זה יכול לבוא לידי ביטוי גם תופעות הנצפה קלינית, wi מכסה בעיקרלכל epitheliopathy (LWE), המכונה גם מכתים שולי העפעף העליון (ULMS) 6. LWE הוא סימן מוקדם של גירוי של העין מנבא פוטנציאל המחלה עין יבשה. הוא ציין ומדד ידי מכתים החיוניים של אזורים שולי העפעף העליון והתחתון. בעוד לדירוג זה מערכה 2 והתוקף הקליני שלה (כלומר, מתאם עם סימפטומים סובייקטיבי) עדיין ניטש ויכוח, אי נוחות עינית נותרת חידה עבור קלינאים ומדענים כאחד, והכי חשוב, מטרד עבור חולים.
עד כה, מעט מאוד ידוע על וריאציות קליניות-רלוונטיות (תת) האנטומיה הסלולר והפיסיולוגיה של אזור מגב המכסה 7 ורק אחד דיווחים עושים שימוש בשיטות ציטולוגיה 8. ציטולוגית Impression (IC) הועסקה במשך 40 שנים כדי לאסוף תאים מפני השטח האפיתל של bulbar או לחמית tarsal ידי יישום של קרום 9,10. לאחר ההסרה, התאים החסידים לעבור גמכתים ytological והדמיה מיקרוסקופית. בשל ההבדלים אנטומיים הסלולר באזור המגב המכסה, טכניקה זו דורשת אופטימיזציה.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
הצהרת אתיקה: לפני איסוף תאים בבני אדם, הודיעה הסכמה ואישור אתיקה יש לקבל.
1. כן Stain
הערה: כן כתם ביום של ניסוי.
- הוסף 5 μl Ethidium (או 4 מיקרומטר) ו -5 μl Calcein AM (או 4 מיקרומטר) ל -2.5 מ"ל בופר פוספט (PBS) ב 15 מ"ל צינור צנטריפוגות; לְעַרְבֵּב. עוטפים בנייר אלומיניום כדי להגן מפני אור ולאחסן ב RT עד לשימוש.
2. תאים אסופים
- הסר מוסיף תרבית תאים מהאריזה שלהם תווית עבור כל עפעף להיות שנדגמו. מארק הכיוון של אוסף תאים בצד של בעל פלסטיק קרום באמצעות סמן קבע. התנהגות ושספה בדיקה מנורה בהגדלה מתונה (כ 20X) כדי לאשר בריאות הולמת של האזור לעבור IC.
- לוותר טיפה אחת של חומר הרדמה (hydrochloride 0.5% proparacaine) שק הלחמית התחתון של eaעין ch ולהורות משתתף לשמור בעיניים עצומות במשך דקה אחת.
- אוורט עליון מכסה עין וחזקה במקום על ידי המלקות; להימנע מכל מגע עם אזור מגב מכסה.
אופציונאלי: הסיוע של חוקר משני ייתכן שיידרש לבצע שלב זה. - החל קרום בניצב על החלק המרכזי של אזור מגב המכסה עם לחץ מינימאלי.
- החזק קרום במקום במשך 3 - 5 שניות. שים את הממברנה להיות שקוף באזור המגע. בשלב זה, בעדינות להסיר את הקרום ולהתיר את המכסה של המשתתף כדי "להעיף" בחזרה למקומו.
- מיד להחיל טיפה אחת של PBS המדגם, כדי למנוע ממנו להתייבש. ממברנה תהפוך שקופה ולא צריך להפוך אטום בכל עת, כמו זו מצביעה על ייבוש. יש החוקר משני להמשיך מיד עם עיבוד של דגימות (סעיף 3).
- לנהל בדיקת עיניים סופית כדי להבטיח שלמות של הלחמית. לוותר סיכה עינית ולהורות משתתפיםכדי למנוע שפשוף העיניים שלהם עד מאלחשים פגים (כ. 15 דק ').
עיבוד מדגם 3.
- באמצעות מיקרו מספריים, לחתוך את הקרום בחצי (מחצית לכל אחד הניתוחים במורד הזרם), בניצב דרך באמצע אוסף תאים. חותכים לאורך השוליים החיצוניים של חצי קרום אחד להפריד אותו מבעל פלסטיק; למנוע אינטראקציה עם תאים שנאספו על הממברנה, ובכלל זה להבטיח כי הקרום אינו מתקפל על עצמו.
- אבטח את הממברנה באמצעות פינצטה לפני ניתוק מן בעל לחלוטין. קרום מקום לתוך צינור צנטריפוגות שכותרתו 2 מ"ל המכיל 500 μl של 95% (V / V) אתנול ולהשאיר לתקן למשך תקופה מינימלית של 20 דקות לכל היותר 2 שעות לפני עיבוד (סעיף 4.2).
- מיד נפרד במחצית השנייה של הממברנה (כמתואר בסעיף 3.2) ומיד להמשיך עם סעיף 4.1.
4. לדוגמא מכתימה
- Immunocytochemiקאל מכתים
- בזהירות במקום קרום תרבות צלחת תחתית זכוכית 35 מ"מ עם צד אוסף פונה כלפי מטה; קרום להבטיח שטוח.
- פיפטה 20 μl של רכב כתם immunocytochemical התאסף בסעיף 1 על הממברנה. אם תלתלים מדגמים, משתמשים טיפי פיפטה חד פעמיים כדי לשטח את הקרום בקפידה על ידי לדחוף למטה הקצוות שלה. יש להימנע ממגע עם אזורי אוסף תאים.
- בעדינות לכסות את הממברנה עם תלוש כיסוי זכוכית. הימנע תנועה של מדגם מיותרת. מכסים בצלחת עם מכסה לאטום עם סרט מעבדה מסביב לקצוות. אין לחסום את השקיפות של צלחת (עליון ותחתון) ו נראה של מדגם. לייבל בטוש במעבדה.
- מייד להמשיך עם הדמיה (סעיף 5.1), ואז לחזור סעיף 4.2 להמשיך עם מכתים ציטולוגיה של החצי השני של הממברנה.
- ציטולוגית מכתים
- בהדרגה מימה קרום ידי הוספת לאט 500 μl של מים מזוקקים אל הצינור used עבור קיבעון בסעיף 3.4. תוכן לשאוב כמה פעמים לתוך קצה פיפטה לערבב, ולאחר מכן להסיר תוכן.
- הוסף 500 μl של מים מזוקקים. ולתת לעמוד במשך כמה שניות, ולאחר מכן להסיר. הוסף 500 μl של כתם Alcian כחול ולהשאיר למשך 3 דקות. הסר כתם ולבצע 3 ברציפות 500 μl מים מזוקקים מי שטיפת או עד שהנוזלים בשטיפות ברור.
- הוסף 500 μl של כתם Hematoxylin # 1 ולהשאיר למשך 3 דקות. הסר כתם ולבצע שלושה רצופים 500 μl שטיפות מים מזוקקים או עד שהנוזלים בשטיפות ברור. מייבשים (הפוך סעיף 4.2.1) על ידי aspirating הנוזל השקוף.
- הוסף 500 μl של Papanicolaou OG-6 הכתם ולהשאיר למשך 3 דקות. הסר כתם ולבצע אחד 500 μl 95% (v / v) שטיפה אתנול.
- הוסף 500 μl של Papanicolaou EA-65 הכתם ולהשאיר למשך 3 דקות. הסר כתם ולבצע 3 ברציפות 500 μl 95% (V / V) אתנול שטיפות.
- לגמרי מייבשים באמצעות שלושה רצופים 500 μl 100% שטיפות אתנול. שימוש tweezers, להסיר מדגם מפתרון; להימנע מאזורי אוסף תא נוגעים ללב.
- מקום קרום בשקופית זכוכית; אוסף להבטיח התא כי הקו הוא גם במקביל או בניצב להחליק שולי עבור יישור קל במהלך ההדמיה.
- החל ירידה של אתנול 100% ומכסים להחליק זכוכית. מיד להמשיך עם הדמיה (סעיף 5.2).
הדמיה מדגם 5.
- כתמי הדמית פלורסנט Immunocytochemical
- שימוש במיקרוסקופ סריקת לייזר confocal (CLSM) 11 או הקרינה מיקרוסקופ 12, מצויד במצלמת צבע דיגיטלית, מחובר למחשב מפעיל תוכנת רכישת התמונה. בשל הדגימות להיות כלול בתוך תרבות מנות, מיקרוסקופ הפוכה עשויה להיות נחוצה.
- הגדרת מיקרוסקופ 11,12 פי ספקטרום בליעה ופליטה של 1 homodimer ethidium (528/617 מקסימום Ex / Em ננומטר בנוכחות דנ"א) calcein AM (494/517 E ננומטרx / Em מקסימום).
- בחר את ההגדלה הנמוכה ביותר של מיקרוסקופ (למשל, המטרה פי 2.5) ולהפעיל את מערכת ההדמיה הדיגיטלית; להתבונן המדגם המוצג על צג המחשב.
- בדוק מדגם עבור תכונות הסלולר של עניין.
- בחר הגדלה במיקרוסקופ רצוי לרכוש תמונות באמצעות תוכנת הדמיה.
- שמור קבצים או בפורמט מיקרוסקופ קובץ מקורה או פורמט קובץ דחוס (לדוגמא: * .raw, * .tiff).
- כתמי הדמית ציטולוגיה
- שימוש במיקרוסקופ שדה בהיר מעבדה סטנדרטי ללא מסננים, מצויד במצלמת צבע דיגיטלית, מחובר למחשב מפעיל תוכנת רכישת תמונה.
- מקום וחלק זכוכית מנעול (משלב 4.2.8) על במת מיקרוסקופ. רעננותם המדגם עם 100% אתנול לפי הצורך, לאורך כל ההליך הדמיה כולו.
- בחר את ההגדלה הנמוכה ביותר של מיקרוסקופ (למשל, המטרה פי 2.5) ולהפעיל המערכת הדמיה דיגיטלית דואר; להתבונן המדגם המוצג על צג המחשב.
- ודא אוסף תא מיושר עם או X או Y ציר שליטה הבמה מיקרוסקופ. התאם במידת הצורך, על ידי הסרת להחליק את המכסה וסיבוב המדגם באמצעות קצה פיפטה או פינצטה.
- באמצעות תוכנת הדמיה, לכידת תמונה (ים) מכלל המדגם עם ההגדלה במיקרוסקופ הנמוך ביותר.
- Switch to ההגדלה במיקרוסקופ מתונה (למשל, 10 - 20X אובייקטיבי) ולהתאים מקור אור מיקרוסקופ ופרמטרי הדמית תוכנה (חשיפה, ניגודיות, איזון לבן, וכו '), ולהשבית המדידה האוטומטית התוכנה שלהם. שמור הגדרות אלה לשימוש עתידי.
- לקבוע נקודות התחלה וסיום של סריקה (למשל, בפינה השמאלית עליונה ופינות ימניות תחתונות של אוסף תאים).
- באמצעות תוכנת הדמיה, לכידת תמונה (ים) של האזור אוסף התא כולו בתוך נקודות התחלה וסיום. הבטח 20% מצד אל צד מלמעלה כלפי מטה לפי חפיפה between כל התמונות הסמוכות.
- שמור קבצים באמצעות פורמט קובץ מיקרוסקופ יליד או פורמט קובץ דחוס (לדוגמה: * .raw, * .tiff).
- צור תמונת פנורמית סופית באמצעות תוכנת חיבור אוטומטית של בחירה (למשל, Adobe Photoshop אלמנטים). השתמש בתמונות התייחסות נלקחו ב שלב 5.2.5) כדי לאשר את הדיוק של התפרים האוטומטיים בתמונה הסופית.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
קרום תרבית תאים, השתרע על בעל הפלסטיק הוא כלי נוח לאיסוף כף יד של תאי אפיתל מן לחמית מגב מכסה. שיטה זו מבטלת את הצורך מכשירים מעוקרים נוספים המשמשים בדרך כלל להכין ולטפל ממברנות IC. איור 1 מתאר את IC של האזור מגב המכסה באמצעות להכניס תרבית תאים. אנו אופטימיזציה שני פרוטוקולים מכתימים שונים המשלימים זה את זה כדי לאפיין תאי אפיתל מאזור מגב המכסה באופן רומן. צבעי immunocytochemical פלורסנט לחשוף פעילות אסטראז, אינדיקטור של כדאיות התא,...
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
ציטולוגיה רושמת בדרך כלל מבוצעת על הלחמית bulbar, באמצעות ממברנות אסתר תאיות מעורב. דוגמאות נחתכים לגודל מסדינים חומר בתפזורת, מעוקר, שיושמה להסיר מפני השטח של הלחמית באמצעות מלקחיים. כל שימוש אחר בחומר קרום אותו, מכשיר IC-נשלט בוכנה נועד לאחרונה כדי להתאים את הגיאומטריה השטח של לחמית bulbar, ולשמור לחץ עקבי בין יישומים 13. גישות אלה אינן יעילות עבור המכסה הצר, מפותל באופן בולט מגב באזור (ראה איור 1). בנוסף, ממברנות אסתר התאיות מעורב אינן מספקות את השקי...
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
למחברים אין מימון רלוונטי או סכסוכים לחשוף.
תודות
ברצוננו להודות לעמיתתנו ד"ר ג'לאיה וריקוטי שסיפקה תובנה ומומחיות בנושא מגב המכסה, שסייעו רבות למחקר זה.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| Alcian Blue, 1% ב-3% חומצה אצטית | Sigma | B8438-250ML | |
| המטוקסילין, זימים 1 | Sigma | GHS116-500ML | |
| כתם Papanicolaou, OG-6 | Sigma | HT40116-500 מ"ל | |
| כתם Papanicolaou, EA | Sigma | מעובד HT40232-1L | |
| חיה/מת חיות/ערכת ציטוטוקסיות | Technologies | L-3224 | מכיל אתידיום הומודימר-1 וצבעי Calcein AM |
| אלקאין (0.5% פרופרקאין הידרוכלוריד) | אלקון | ||
| תוספת לתרבית תאים מילית, 12 מ"מ, PTFE הידרופילי, 0.4 ומיקרו; מ | EMD Millipore | PICM01250 | |
| צלחות תחתון זכוכית 35 מ"מ | MatTek Corporation | P35G-0-20-C |
מקורות
- Barbato, G., et al. Diurnal variation in spontaneous eye-blink rate. Psychiatry Res. 93, 145-151 (2000).
- Korb, D. R., et al. Lid-Wiper Epitheliopathy and Dry-Eye Symptoms in Contact Lens Wearers. Eye & Contact Lens. 28, 211-216 (2002).
- Dumbleton, K., Woods, C. A., Jones, L. W., Fonn, D. The impact of contemporary contact lenses on contact lens discontinuation. Eye & Contact Lens. 39, 93-99 (2013).
- Roba, M., Duncan, E., Hill, G., Spencer, N., Tosatti, S. Friction measurements on contact lenses in their operating environment. Tribol Lett. 44, 387-397 (2011).
- Sickenberger, W., Pult, H., Sickenberger, B. LIPCOF and contact lens wearers: a new tool to forecast subjective dryness and degree of comfort of contact lens wearers. Contactologia. 22, 74-79 (2000).
- Pult, H., Purslow, C., Berry, M., Murphy, P. J. Clinical tests for successful contact lens wear: relationship and predictive potential. Optom Vis Sci. 85, E924-E929 (2008).
- Doughty, M. J. Morphological features of cells along Marx's line of the marginal conjunctiva of the human eyelid. Clin Exp Optom. 96, 76-84 (2013).
- Jalbert, I., et al. Assessing the human lid margin epithelium using impression cytology. Acta Ophthalm. 90, e547-e552 (2012).
- Nelson, J. D. Impression cytology. Cornea. 7, 71-81 (1988).
- Egbert, P. R., Lauber, S., Maurice, D. M. A simple conjunctival biopsy. Am J Ophthalmol. 84, 798-801 (1977).
- Wilson, T. Confocal microscopy. , Academic Press. London. 1-64 (1990).
- Denk, W., Strickler, J. H., Webb, W. W. Two-photon laser scanning fluorescence microscopy. Science. 248, 73-76 (1990).
- Tomlins, P., Roy, P., Curnow, J., Rauz, S. Assessment of the EyePRIM Device for Conjunctival Impression for Flow Cytometry. Invest Ophthalm Vis Sci. 54, 5430-5430 (2013).
- Knop, E., Korb, D. R., Blackie, C. A., Knop, N. The lid margin is an underestimated structure for preservation of ocular surface health and development of dry eye disease. Res Proj Dry Eye Syn. 45, 108-122 (2010).
- Knop, E., et al. The lid wiper and muco-cutaneous junction anatomy of the human eyelid margins: an in vivo confocal and histological study. J Anat. 218, 449-461 (2011).
- Christensen, J. A., Skaarland, E. Nuclear and cell area measurements in the cytological evaluation of pleural effusions: a study of subjective assessments and morphometric measurements. Diag Cytopathol. 3, 50-54 (1987).
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
