הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

מדידת פעילות פרץ גרנולוציט ו מונוציטים Phagocytosis חמצוני בדם אנושי

13.4K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/54264

⸱

12 בספטמבר 2016

 ,  ,  ,  , 
1Human Performance Laboratory, North Carolina Research Campus, Appalachian State University, 2Department of Biology, Appalachian State University, 3David H. Murdock Research Institute

במאמר זה

סיכום

מטרת כתב היד הזה היא להציג שיטה למדידת פגוציטוזיס מונוציטים וגרנולוציטים ופעילות פרץ חמצוני בדגימות דם אנושיות.

תקציר

ניתן להשתמש בבדיקת הגרנולוציטים והמונוציטים פגוציטוזיס ופעילות פרץ חמצוני (OB) כדי לחקור את מערכת החיסון המולדת. כתב יד זה מספק את המתודולוגיה הדרושה כדי להוסיף בדיקה זו לארסנל אימונולוגיה של פעילות גופנית. השלב הראשון בבדיקה זו הוא הכנת שני אליקוטים ("H" ו-"F") של דם מלא (הפרין). לאחר מכן, דיהידרואתידיום מתווסף ל-H aliquot, ושני האליקוטים מודגרים באמבט מים חמים ואחריו אמבט מים קרים. לאחר מכן, Staphylococcus aureus (S. aureus) מתווסף ל-H aliquot ו-S. aureus שכותרתו פלואורסצאין איזותיוציאנט מתווסף ל-F aliquot (חיידקים: פגוציטים = 8:1), ושני האליקוטים מודגרים באמבט מים חמים ואחריו אמבט מים קרים. לאחר מכן, טריפן כחול מתווסף לכל אליקוט כדי להרוות את הקרינה החוץ-תאית, והתאים נשטפים במי מלח עם פוספט. לאחר מכן, תאי הדם האדומים עוברים ליזה, ותאי הדם הלבנים מקובעים. לבסוף, ציטומטר זרימה ותוכנת ניתוח מתאימה משמשים למדידת פגוציטוזיס גרנולוציטים ומונוציטים ופעילות OB. בדיקה זו נמצאת בשימוש כבר למעלה מ-20 שנה. לאחר מאמץ כבד וממושך, ספורטאים חווים עלייה משמעותית אך חולפת בפגוציטוזיס וירידה ממושכת בפעילות OB. העלייה בפגוציטוזיס לאחר פעילות גופנית קשורה לדלקת. בניגוד לאנשים במשקל תקין, פגוציטוזיס גרנולוציטים ומונוציטים מוגברת באופן כרוני אצל משתתפים הסובלים מעודף משקל והשמנת יתר, ונמצאת בקורלציה צנועה עם חלבון מגיב C. לסיכום, בדיקה זו המבוססת על ציטומטריית זרימה מודדת את פעילות הפגוציטוזיס וה-OB של פגוציטים ויכולה לשמש כמדד נוסף לדלקת הנגרמת על ידי פעילות גופנית והשמנת יתר.

מבוא

Phagocytosis גרנולוציט ו מונוציטים / פרץ חמצוני (OB) assay פעילות היא טכניקה פשוטה, ישר קדימה אשר משמש לעתים קרובות כדי לאסוף מידע על תפקוד מערכת החיסון המולדת לאחר פעילות גופנית ממושכת ואינטנסיבית. 1-4 כאשר לומדים את התגובה של המערכת החיסונית גירוי, גרנולוציטים ומונוציטים הם בעלי העניין מיוחד משום שהם ממלאים תפקיד מרכזי בהגנת מארח הם תאי החיסון הראשונים לצבור באתר של זיהום. 5 נויטרופילים, סוג של גרנולוציט, הם התאים הראשונים כדי translocate לתוך שריר ניזוק רקמות לאחר פעילות גופנית אינטנסיבית. 6 Phagocytosis ופעילות OB הם האמצעים הנפוצים ביותר של פונקצית גרנולוציט ו מונוציטים, 7 והם העדיפו כאינדיקטורים תפקוד תא חיסון מולד בגלל תפקידם המרכזי בשניית תהליך ההדבקה ואת תהליך התיקון.

Assay המתואר ב utili כתב היד הזהzes זרימה בסיסית cytometer לספק קביעה כמותית של גרנולוציט ו phagocytosis מונוציטים ופעילות OB בדם כולו. השימוש של דם מלא בטכניקה זו יש יתרון משום שהוא מאפשר assay להתנהל ללא הליך טיהור גוזל זמן. assay זה יכול בקלות להיות שונה כדי להתאים מגוון של עיצובי מחקר ויכולות מעבדה. לדוגמה, ליאו et al. מנוצל בטכניקה דומה כדי להראות פעילות OB נויטרופילים הוא גדל phagocytosis נויטרופילים הוא ירד בעקבות פגיעה מוחית טראומטית. 8 בדוגמה נוספת, McFarlin et al. תיאר שינוי אלגנטי של טכניקה זו המשתמשת allophycocyanin (APC ), מצומדות CD66b וסימון CD45 APC מצומדות טנדם בעל ביצועים גבוהים עם cytometry זרימה מבוסס תמונה לסווג גרנולוציטים מבחינת פעילויות phagocytosis ו OB שלהם. 7,9

קבוצת המחקר שלנו השתמשה עיבודים שונים של טה זוchnique כאינדיקטור תפקוד מערכת החיסון המולדת באוכלוסיות משקל יתר, ואתלטי במשך כמעט 20 שנה. 10,11 הטקסט להלן יספק את הקורא עם הוראות צעד-אחר-צעד לביצוע assay זה ולהאיר אזורים שהקורא עשוי להתאים כדי לענות על הצרכים של המחקר שלהם.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

הערה: כל הנהלים איסוף דם נערכו בהתאם להנחיות שנקבעו על ידי אוניברסיטת מדינת האפלצ'ים (ASU) הדירקטוריון סקירה מוסדיים (IRB).

1. הכנת Assay

  1. לאסוף, להכין, ולארגן את החומרים שצוינו עבור ההליך (עיין טבלה של חומרים ספציפיים / ציוד).
    1. לייבל 12 x 75 מ"מ צינורות.
      1. לייבל שני צינורות לכל משתתף: שפופרת אחת עבור assay phagocytosis (תווית הצינור הזה עם דיו שחור ו "F" עבור isothiocyanate והעמסת [FITC]) צינור אחד עבור assay פעילות OB (תווית הצינור הזה עם דיו אדום ו " H "עבור dihydroethidium [HE]).
        הערה: שימוש צינורות סטרילית 12 x 75 מ"מ מומלץ להמעיט הפעלה סלולרית הבלתי מכוונת, העלייה מתמדת רעשי רקע.
      2. לייבל שלושה צינורות עבור הפקדים assay: שפופרת אחת עבור assay phagocytosis (שליטה FITC: תווית הצינור הזה עם Blacדיו k ו "F"), צינור אחד עבור assay פעילות OB (HE מלא: תווית הצינור הזה עם דיו אדום ו "H"), צינור אחד עבור הבקרה השלילית (דם בלבד: תווית הצינור הזה בדיו ירוק ו "דם רק").
    2. הכן פתרונות מניות לפחות יום אחד לפני היום של assay.
      1. הכן את תמיסת מלח סטרילית שנאגר-פוספט (PBS). לדלל 100 מ"ל של 10x PBS עם 900 מ"ל של 18.2 MΩ H 2 O. סנן לעקר עם מסנן 0.2 מיקרומטר. חנות ב 4 ° C עד השימוש.
      2. הכן את PBS-גלוקוז סטרילי. ממיסים 1.0 גרם של גלוקוז 100 מ"ל של PBS. סנן לעקר עם מסנן 0.2 מיקרומטר. חנות ב 4 ° C עד השימוש.
      3. הכן את החיץ 0.1 M ציטראט סטרילי. ממיסים 1.2 גרם של חומצת לימון ו -1.1 גרם של נתרן ציטרט ב 100 מ"ל של 18.2 MΩ H 2 O. התאם את ה- pH ל -4.0. סנן לעקר עם מסנן 0.2 מיקרומטר. חנות ב 4 ° C עד השימוש.
      4. כן פתרון מניות HE. Resuspend 1.0 מ"ג HE ב 1.0 מ"ל של sulfoxide דימתיל (DMSO). מערבבים בעדינות, aliquot, ולאחסן ב -20 ° C עד השימוש.
      5. הכן את aureus Staphylococcus FITC שכותרתו (S. aureus) פתרון המניות (2 x 10 9 חלקיקים / מ"ל). Resuspend 10 מ"ג של FITC שכותרתו ס aureus ב 1.5 מיליליטר (או כמות מתאימה) של PBS. מחלקים לשלושה 500 μl aliquots ו sonicate פי המלצת היצרן. Aliquot ולאחסן ב -20 ° C עד השימוש.
      6. הכן את ס ללא תווית פתרון המניות aureus (2 x 10 9 חלקיקים / מ"ל). Resuspend 100 מ"ג של תווית ס aureus ב 15 מ"ל (או הכמות המתאימה) של PBS. מחלקים ל שלושים 500 μl aliquots ו sonicate פי המלצת היצרן. Aliquot ולאחסן ב -20 ° C עד השימוש.
    3. הכינו פתרונות עבודה טריים ביום של assay.
      1. הכן את הפתרון עובד הוא. העבר 10 μl שלפתרון המניות מופשר HE עד 990 μl של גלוקוז PBS. להגן מפני אור ולשמור על הקרח עד לשימוש.
      2. הכן את FITC שכותרתו ס הפתרון עובד aureus (133,333 חלקיקים / μl). העברת 70 μl של FITC שכותרתו ס מופשר פתרון המניות aureus כדי 980 μl של PBS. להגן מפני אור ולשמור על הקרח עד לשימוש.
      3. הכן את ס ללא תווית הפתרון עובד aureus (133,333 חלקיקים / μl). העברת 70 μl של ס ללא תווית מופשר פתרון המניות aureus כדי 980 μl של PBS. להגן מפני אור ולשמור על הקרח עד לשימוש.
      4. הכן את הפתרון להרוות. הוסף 750 μl של פתרון כחול 0.4% trypan כדי 11.25 מ"ל של חיץ 0.1 M ציטראט סטרילי. שמור באמבט מי קרח עד לשימוש.
    4. שיהיה לך phlebotomist מוסמך להקיז דם על פי הנחיות של ארגון הבריאות העולמי עבור זוב דם.
      1. להקיז דם לתוך צינור איסוף דם אחד 4 מ"ל המכיל EDTA 2 K. באיסוף דם vert צינורית לפי הוראות היצרן. שמור צינור איסוף הדם בטמפרטורת החדר על כיסא נדנדה הספסל העליון עד השימוש. השתמש דם זה עבור ספירת דם מלאה (CBC) עם תאי דם לבנים (WBC) ניתוח ההפרש המתואר בשלב 1.2.1.
      2. להקיז דם לתוך צינור איסוף דם אחד 4 מ"ל המכילה הפרין ליתיום. היפוך צינור איסוף דם על פי הוראות היצרן. שמור צינור איסוף דם ב RT על כיסא נדנדה הספסל העליון עד השימוש. השתמש הדם הזה לפעילות מונוציטים ו phagocytosis גרנולוציט ו OB assay המתואר בשלב 2.
  2. לקבוע את כמות החיידקים (כלומר, S. aureus), כי יהיה צורך להשלים את assay עבור כל דגימה.
    1. השתמש מנתח המטולוגיה לבצע ספירת דם עם ניתוח הפרש WBC על הדם כמתואר הוראות היצרן. רשום לעצמך את ספירת WBC (בתאי / מ"ל),% נויטרופילים, ו%ערכים מונוציטים.
    2. השתמש המשוואות הבאות כדי לקבוע את ספירת נויטרופילים מונוציטים עבור כל דגימה.
      נויטרופילים ספירת (בתאים / מ"ל) =% נויטרופילים × WBC (בתאי / מ"ל)
      ספירת מונוציטים (ב תאים / מ"ל) =% מונוציטים × WBC (בתאי / מ"ל)
    3. השתמש המשוואות הבאות כדי לדעת את כמות תָא בַּלעָן עבור כל דגימה ומספר פגוציטים נוכחים 100 μl של מדגם.
      ספירת תָא בַּלעָן (ב תאים / מ"ל) = ספירת נויטרופילים (ב תאים / מ"ל) + ספירת מונוציטים (בתאים / מ"ל)
      מספר פגוציטים ב 100 μl = (ספירה תָא בַּלעָן (בתאים / מ"ל)) / 10
    4. השתמש המשוואה הבאה כדי לקבוע את מספר החיידקים (כלומר, aureus S.) הדרושים עבור כל דגימה וכמות FITC שכותרתו ס aureus או S. ללא תווית הפתרון עובד aureus (133,333 חלקיקים / מ"ל) כי יש להוסיף על צינור אחד.
      הערה: חיידקי היעד: יחס תָא בַּלעָן הוא 8: 1.
      מספר חיידקי צורך =מספר פגוציטים ב 100 μl × 8
      נפח של הפתרון עובד FITC או ללא תווית הצורך (ב μl) = (מספר החיידקים הצורך) / (133,333 חלקיקים / μl)

2. בצע Assay

  1. כן דם מלא עבור assay.
    1. עבור כל צינור משתתף ובקרה, להשתמש קצה פיפטה המורחבת באורך להעביר 100 μl של דם מלא מצינור איסוף דם הפרין ליתיום לתחתית של 12 שכותרתו כראוי x צינור 75 מ"מ. חלף כמוס.
      הערה: היזהר להימנע מקבלת דם בצדדים של 12 x 75 מ"מ צינורות.
    2. השתמש micropipette להוסיף 10 μl של אותו עובד פתרון הצינורות שכותרתו עם דיו אדום ו "H", כוללים הצינור מלא HE. חלף כובעים בקצרה מערבולת.
    3. דגירה כל הצינורות באמבט מים 37 מעלות צלזיוס במשך 15 דקות. לאחר מכן, מייד להעביר את כל הצינורות באמבט קרח-מים במשך 12 דקות.
      הערה: השתמש מתלה מתכת פתוחהובעדינות לנער את מתל כל 5 דקות על מנת להבטיח כי הצינורות הם באופן מהיר ונכון חממו או מצונן.
  2. הוספת חיידקים (כלומר, S. aureus) אל דוגמיות ושליטה.
    1. השתמש micropipette להוסיף את הכמות המתאימה (המחושב בשלב 1.2.4) של ס ללא תווית פתרון aureus פועל הצינורות שכותרתו עם דיו אדום ו "H", כוללים הצינור מלא HE. חלף כובעים בקצרה מערבולת.
    2. השתמש micropipette להוסיף את הכמות המתאימה (המחושב בשלב 1.2.4) של FITC שכותרתו ס פתרון עובד aureus אל הצינורות שכותרתו בדיו שחור "אפס", כוללים הצינור מלא FITC. חלף כובעים בקצרה מערבולת.
    3. וורטקס הצינור "דם רק" שליטה, אך לא להוסיף סוג אחד של חיידקים (כלומר, aureus S.) אליו.
    4. דגירה כל הצינורות באמבט מים 37 מעלות צלזיוס במשך 20 דקות. השתמש מתלה מתכת פתוחה בעדינות לנער את מתל כל 5 דקותעל מנת להבטיח כי הם באופן מהיר ונכון חממו את הצינורות. לאחר תקופת הדגירה, מייד להעביר את כל הצינורות באמבט קרח מים 1 דקות.
  3. שוטפים את התאים.
    1. השתמש פיפטה מהדר להוסיף 100 μl של פתרון להרוות קר כקרח לכל הצינורות. חלף כובעים, מערבולת בקצרה, ולאחר מכן דגירה כל הצינורות על קרח למשך 1 דקה.
    2. השתמש פיפטה מהדר להוסיף 1 מ"ל של PBS קר כקרח לכל הצינורות. וורטקס בקצרה, ולאחר מכן להוסיף 2 מ"ל נוספים של PBS קר כקרח לכל הצינורות ולהחליף כובעים. צנטריפוגה כל צינורות במשך 5 דקות ב 4 ° C ו 270 XG, ולאחר מכן לשאוב supernatant.
    3. חזור על שלב 2.3.2 פעם אחת (סה"כ 2 שוטפים).
  4. הכינו דגימות עבור cytometry הזרימה.
    1. השתמש פיפטה מהדר להוסיף 50 μl של בסרום שור עובר קר כקרח לכל הצינורות. בקצרה מערבולת כל הצינורות.
    2. להעביר את כל צינורות קרוסלה מתאימה והשתמש תחנת עבודה כנה lyse התא אוטומטית עם cel דם האדוםl (RBC) lysing ו WBC תיקון ריאגנטים lyse את RBCs ולתקן את WBCs כמתואר הוראות היצרן.
    3. לאחר ריצת עבודת הכנת התא lyse האוטומטית השלימה, לעטוף צינורות בנייר אלומיניום ולאחסן במקרר 4 ° C עד ניתוח התזרים cytometry יכול להתבצע.

3. רכישת cytometry זרימה

  1. הגדרת מערכת cytometry הזרימה.
    1. לחמם את זרימת cytometry מערכת כמצוין במדריך למשתמש המסופק על ידי היצרן. לאחר מכן, לבדוק את הרמות מגיבים ופסולת טנק. במידת הצורך, למלא את הטנקים מגיב ו / או לרוקן את המיכל פסולת.
    2. השתמש בתכונת "לוח נקי" כדי להפעיל את מערכת מחזור נקי. לאחר מכן, להפעיל את אימות יישור fluidics fluorospheres, ולהבטיח כי המקדם חצי השיא של השתנות (HPCV) עבור כל גלאי נמצא בטווח המוגדר מראש מתוארי בקרת האיכות (QC) פרוטוקולים שמספקים בייצורr.
  2. צור רכישת assay הספציפי ופרוטוקולי הגדרת מכשיר.
    1. צור פרוטוקולי רכישה ספציפי assay עבור מבחני phagocytosis ו OB פעילות.
      הערה: הפרוטוקולים הרכישה המתואר כאן יכול להיות מותאם לשימוש על כל cytometer זרימה עם לייזר כחול (488 ננומטר), מסנן (530/30) עבור FITC, ומסנן (575/26) כי הוא.
      1. פתח את זרימת cytometry תוכנת רכישת מערכת וליצור "פרוטוקול חדש".
      2. בחר את "פרמטר FL1" עבור assay phagocytosis (FITC) ואת "פרמטר FL2" עבור assay פעילות OB (HE).
      3. צור את המגרשים (כלומר, פיזור קדימה [FSC] לעומת פיזור צד [SSC] עלילת נקודה, היסטוגרמה FL1, היסטוגרמה FL2) דרושה לרכישה.
      4. צור אזורים מצולעים עבור WBC (תאי דם לבנים), אוכלוסיות גרנולוציט ו מונוציטים על המגרש FSC לעומת SSC וליצור אזורים ליניארי על היסטוגרמות FL1 ו FL2. a & # הגדר34; עצור רוזן "של 50,000 אירועי שער WBC.
      5. שמור את הפרוטוקולים עם שמות assay ספציפי.
    2. צור פרוטוקולי הגדרת מכשיר assay ספציפי עבור מבחני פעילות phagocytosis ו OB.
      1. גרור ושחרר את "הפרוטוקולים לרכישה מסוימת-assay" (שהוגדר בשלב 3.2.1) מן "אקספלורר משאבים" אל "מנהל הרכישה" על זרימת cytometry תוכנה רכישת המערכת.
        הערה: המידע הוסיף בדרך זו תמיד יופיע בסוף של worklist.
      2. הזן את המידע המדגם לתוך worklist, ולשמור את worklist.
      3. הסר את צינורות מדגם מלא ממקרר 4 ° C ולאפשר להם לאזן לטמפרטורת חדר במשך 15 דקות. ואז, בקצרה מערבולת כל צינור מלא מדגם.
      4. השתמש "פרוטוקולי הרכישה ספציפי assay" שהוגדרו בשלב 3.2.1 לרוץ מדגם הבקרה השלילי (כלומר, דם בלבד) ואת הבקרה החיוביתדגימות (כלומר, לו שליטה, בקרה FITC) דרך מערכת cytometry הזרימה. סקור את היסטוגרמות ולהתאים את הצינור המכפיל (PMT) מתח של FITC ו Phycoerythrin ערוצים (PE) לפי צורך.
      5. וורטקס דגימות בקרה ולהעבירם זרימת cytometry קרוסלה המערכת לפי הסדר על worklist. ואז, במקום קרוסלה בתא הדגימה ולחץ על כפתור Cytometer סרגל הכלים "התחל" כדי להשיג נתונים על דגימות שליטה. שמור את "xxx הגדרת Pro" פרוטוקול ההגדרה.
  3. רוכש דגימות מחקר על מערכת cytometry הזרימה.
    1. הסר את הצינורות מדגם המחקר מהמקרר 4 ° C. ולאפשר לאזן לטמפרטורת החדר למשך 15 דקות.
    2. בעוד הדגימות equilibrating, גרור את פרוטוקולי רכישה המוגדרים מראש ספציפי מחקר למרחב worklist לעשות worklist פרויקט.
    3. ודא "פרוטוקול ההגדרה" צמוד &# 34;. פרוטוקולי הגדרה ספציפית assay "שהוגדרו בשלב 3.2.2 לאחר מכן, הזן את הפרטים המזהים (למשל, שם מחקר, לצייר מספר, מספר ביקור, מזהה נושא) עבור כל צינור לתוך רשימת העבודה.
    4. לאחר תקופת איזון 15 דקות, דגימות מחקר מערבולת ולהעבירם הזרימה cytometry קרוסלת מערכת לפי ההסדר על worklist. ואז, במקום קרוסלה בתא הדגימה ולחץ על כפתור Cytometer סרגל הכלים "התחל" כדי להשיג נתונים על דגימות המחקר.
    5. סקור את איכות הנתונים על ידי בוחן את יעילות תמוגה RBC ועל החלוקה תת תא WBC, פרופורציות, ספירה מוחלטת, עוצמות קרינה בלוח הדו"ח של כל דגימה.
      הערה: איכות הנתונים נחשבת מקובל אם כל הקריטריונים הללו הם בתוך הגבולות המוגדרים מראש שלהם. אם כל הקריטריונים אינם מתקיימים, המדגם צריך להיות reprocessed.
    6. נקי לסגור את מערכת cytometry הזרימה. אחסן את cytometry הזרימהנתונים על שני כוננים במחשב אחרים כדי למנוע אובדן נתונים בשוגג.

ניתוח 4. נתונים

  1. לבצע את הניתוח phagocytosis.
    1. איחוד כל phagocytosis (כלומר, F שכותרתו) נתונים במצב מדגם ובקרה רשימה קובצי נתונים (LMD) לתוך תיקייה אחת. לאחר מכן, פתח את זרימת cytometry תוכנה לניתוח וגרור את הקבצים לתוך מרחב המדגם.
    2. הגדירו את WBC, גרנולוציט, מונוציטים, ו לימפוציטים שערים.
      1. לחץ פעמיים על שם הקובץ כדי לפתוח כל אחד "דגימות בקרה FITC". השתמש בתפריטים הנפתחים כדי להגדיר את ציר ה- x כדי "FSC" ו "ליניארי" ואת ציר y כדי "SSC" ו "ליניארי".
      2. השתמש "בורר שער פוליגון" להכין שער של אוכלוסיית WBC הכולל.
        הערה: הקפד לכלול את כל התאים בקצוות של התרשים. לייבל השער הזה "WBC".
      3. לחץ פעמיים על "שער WBC חדש" ולהשתמש drop-הנפתחים כדי להגדיר את ציר ה- x כדי "FSC" ו "ליניארי" ואת ציר y כדי "SSC" ו "ליניארי".
      4. השתמש "בורר שער פוליגון" כדי להגדיר את "שער גרנולוציט" והשער מונוציטים ", ולאחר מכן השתמש" בורר השער אליפטי "כדי להגדיר את" השער הלימפוציטים ". לייבל כל שער בהתאם. גרור את" נתוני שער (%) "בצד כך התאים נתפסים בקלות.
    3. בחר את "Phagocytosis חיובי השער" ואת "שער שלילי Phagocytosis" עבור האוכלוסיות גרנולוציט ו מונוציטים.
      1. לחץ פעמים על "המדגם מלא FITC" המשמש שלב 4.1.2.1. לאחר מכן, לחץ על "שער גרנולוציט" והשתמש בתפריטים הנפתחים כדי להגדיר את ציר ה- x כדי "FL1" ו- "היומן" ואת ציר y כדי "SSC" ו "ליניארי".
      2. השתמש "בורר השער מרובע" לקבוע "שער שלילי Phagocytosis" לבין "Phagocytosis פוסיטive שער ".
        הערה: מאז דגימות בקרת FITC לא קבלו בקטריאלי (כלומר, S. aureus) גירויים, כל התאים צריכים תיאורטית להיות phagocytosis שלילי. להפעיל שיקול דעת בעת הקמת הגבולות עבור אוכלוסיות אלו.
      3. חזור על שלב 4.1.3.1 ו 4.1.3.2 שלב לאוכלוסייה מונוציטים.
    4. להוסיף סטטיסטיקה עבור "% של WBC", "עוצמת קרינה", ו "תאים חיוביים phagocytosis%" עבור האוכלוסיות גרנולוציט ו מונוציטים.
      1. הקש על "המדגם מלא FITC" המשמש שלב 4.1.2.1. סמן את "שער גרנולוציט", ולאחר מכן לחץ על "סביבת עבודה" ו "להוסיף סטטיסטיקה". הדגש "גיאומטרי" ו "FL1 יומן" ולחץ על "הוסף". אז בחרתי את "תדר של ההורה" נתון ולחץ על "הוסף".
        הערה: זה ייתן את עוצמת הקרינה (ממוצע גיאומטרי) מאוכלוסיית גרנולוציט כולואחוז WBC (ההורה) כי הם גרנולוציטים.
      2. הקש על "המדגם מלא FITC" המשמש שלב 4.1.2.1. סמן את "שער חיובי Phagocytosis" של האוכלוסייה גרנולוציט, ולאחר מכן לחץ על "סביבת עבודה" ו "להוסיף סטטיסטיקה". הדגש "גיאומטרי" ו "FL1 יומן" ולחץ על "הוסף". לאחר מכן בחר את "תדר של הורה" נתון ולחץ על "הוסף".
        הערה: זה ייתן את עוצמת הקרינה (ממוצע גיאומטרי) של גרנולוציטים phagocytosis החיוביים ואחוז של גרנולוציטים (ההורה) כי הם phagocytosis חיובי.
      3. חזור על שלב 4.1.4.1 ו 4.1.4.2 שלב לאוכלוסייה מונוציטים.
      4. הקש על "המדגם מלא FITC" המשמש שלב 4.1.2.1. סמן את "השער לימפוציטים", ולאחר מכן לחץ על "סביבת עבודה" ו "להוסיף סטטיסטיקה". סמן את הנתון "תדר של הורה" ולחץ על "הוסף".
        הערה: זהייתן אחוז WBC (ההורה) כי הם לימפוציטים.
      5. סמן את כל השערים והסטטיסטיקות שנוצרו מדגם שליטת FITC המשמש שלב 4.1.2.1. גרור אותם לתוך "כל הדגימות" בחלונית "הקבוצה" בחלק העליון של המסך.
        הערה: זה יהיה להחיל הגדרות אלו על כל דגימות המחקר.
      6. שמור שם העבודה כקובץ .wsp באותה תיקייה שמכילה את התיקייה LMD.
    5. התאם שערי מדגם בודדים.
      1. הקש על "המדגם הראשון" בערכת הנתונים ולאשר ששער WBC כראוי מתאים חלוקת התא על המסך. אם זה לא, לחץ וגרור את הקצוות של השער להתאים את שער מדגם זה. הקישו על "חץ ימינה" (כלומר, "˃") כדי להתקדם המדגם הבא. חזור על פעולה זו עד שכל הדגימות נבדקו.
      2. הקש על "שער WBC" למדגם הראשון במערכת הנתונים ולאשר כי "גראןulocyte השער "," מונוציטים השער ", ו" הלימפוציטים השער "עבור כל דגימה כראוי להתאים את חלוקת התא על המסך. התאם לפי הצורך. לחץ על" חץ ימינה "(כלומר," ˃ ") כדי להתקדם המדגם הבא .
      3. חזור על שלב 4.1.5.2 עד שכל הדגימות נבדקו. לאחר מכן, לחץ על "שמור".
    6. להציג את הנתונים בתוכנית גיליון אלקטרוני.
      1. לחץ על הסמל "עורך הטבלה" בחלק העליון של המסך. לחץ על "ערוך", "מילות מפתח", ו 'DATE $ "כדי לכלול את התאריך הדגים על הגיליון האחרון. לאחר מכן, לחץ על "ערוך", "מילות מפתח", ו "@ SAMPLEID1" לכלול זיהוי הדגימה על הגיליון האחרון. חזור על הפעולה עבור "@ SAMPLEID2", "@ SAMPLEID3", ו "@ SAMPLEID4".
      2. התאם את המסך "לוח עורך" והמסך "מדגם", כך שניתן יהיה לצפות גם על מסך המחשב. Sele גודלct כל "מדגם" שבגיליון המדגם. לאחר מכן, גרור כל נתון המעניין את "עורך הטבלה".
        1. גרור את "תדר. של החברה האם" נתון מופיע תחת "שער גרנולוציט" אל "עורך טבלה". סוג "WBC% כמו גרנולוציטים" תחת עמודת "שם" של "עורך הטבלה".
        2. גרור את הנתון "הממוצע הגיאומטרי" מופיע תחת "שער גרנולוציט" אל "עורך הטבלה". הקלד "גיאומטרית קרינה, גרנולוציטים" תחת עמודת "שם" של "עורך הטבלה".
        3. גרור את "התדר. של חברה האם" הנתון מופיע תחת "שער גרנולוציט / Phagocytosis החיובי" ל "עורך הטבלה". סוג "% Phagocytosis חיוביים גרנולוציטים" תחת עמודת "שם" של "עורך הטבלה".
        4. גרור את נתון "ממוצע גיאומטרי" מופיע תחת "שער גרנולוציט / Phagocytosis חיובי" כדי the "עורך טבלה". הקלד "קרינה ממוצעת גיאומטרית, Phagocytosis חיובי גרנולוציטים" תחת עמודת "שם" של "עורך הטבלה".
        5. גרור את "התדר. של חברה האם" הנתון מופיע תחת "שער מונוציטים" אל "עורך הטבלה". סוג "WBC% כפי מונוציטים" תחת עמודת "שם" של "עורך הטבלה".
        6. גרור את הנתון "הממוצע הגיאומטרי" מופיע תחת "שער מונוציטים" אל "עורך הטבלה". הקלד "גיאומטרית קרינה, מונוציטים" תחת עמודת "שם" של "עורך הטבלה".
        7. גרור את "התדר. של חברה האם" הנתון מופיע תחת "שער מונוציטים / Phagocytosis החיובי" ל "עורך הטבלה". הקלד "% Phagocytosis חיובי מונוציטים" תחת עמודת "שם" של "עורך הטבלה".
        8. גרור את נתון "ממוצע גיאומטרי" מופיע תחת "מונוציטים / Phagocytosis חיובי שער "אל" עורך הטבלה ". הקלד" קרינה ממוצעת גיאומטרית, Phagocytosis חיובי מונוציטים "תחת" "הטור של" שם עורך הטבלה ".
        9. גרור את "תדר. של החברה האם" נתון מופיע תחת "השער הלימפוציטים" אל "עורך טבלה". סוג "WBC% כמו לימפוציטים" תחת עמודת "שם" של "עורך הטבלה".
      3. גרור ושחרר את הפרמטרים הגלויים "עורך הטבלה" עד שהם מסודרים לפי הסדר הרצוי.
      4. לחץ על "שמור". לאחר מכן, לחץ על "פתח שולחן" כדי להציג את הנתונים בפורמט גיליון אלקטרוני. לחץ על "שמור בשם" כדי לשמור שם עבודה .xlsx קובץ.
  2. חזור על שלב 4.1 עבור assay פעילות OB (כלומר, H שכותרתו) דגימות ולשלוט קבצי נתונים LMD.
    הערה: הקפד להחליף את כל אזכור של phagocytosis עם אזכור של פעילות OB.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

יש תרגיל ממושך ואינטנסיבי השפעה עמוקה על תפקוד מערכת חיסון מולד, כולל תפקוד תא רוצח טבעי, בתגובה בתיווך ציטוקינים מקרופאג זיהום ויראלי, ו גרנולוציט ו phagocytosis מונוציטים ופעילות OB. מחקרים רבים מצביעים על כך מגביר phagocytosis גרנולוציט ו מונוציטים משמעותי שלאחר אימון, המשקף את הדלקת הנגרמת על ידי ניזק לשרירי דרישות מטבוליות. לעומת זאת, גרנולוציט ופעילות מונוציטים OB פוחתת שלאחר אימון ועלול להיות אינדיקטור אחד חיסוני של רגישות מוגברת לזיהום. לדו...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

כתב יד זה מספק פרוטוקול צעד אחר צעד עבור קביעת שני אינדיקטורים של גרנולוציט ותפקוד מונוציטים. זיהינו כמה צעדים חיוניים להצלחת assay זה. צעד אחד כזה הוא הדגירה-באמבט קרח המתרחשת באופן מיידי לפני תוספת של חיידקים. קירור יסודי של כל הדגימות יהיה למזער את השפעת הטמפרטורה על פעילות phagocytosis ו OB. עוד צעד קריטי הוא התוספת של חיידקי מדגם זה. A 8: 1 חיידקים: יחס תָא בַּלעָן מייצר תוצאות אופטימליות; אולם חוקרים אחרים עשויים למצוא כי היחס הזה יצטרך להיות שונה כדי להפיק תוצאות מתאימות. ש...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

למחברים אין מה לחשוף.

תודות

המחברים מבקשים להודות זאק שו, קייסי ג'ון, ולין Cialdella-קם על סיועם במהלך אופטימיזציה של הליך זה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
צינורות 12 x 75 מ"מ, עם מכסהVWR20170-579תזדקק ל-2 צינורות לכל דגימה ("H" ו-"F") בתוספת 3 צינורות לכל אצווה (לבקרות בדיקה; "F", "H" ו-"דם בלבד").
PBS (פי 10), pH 7.4Life Technologies70011-044
בקבוק עליון 0.2 ומיקרו; מסנן אצטט תאית M (קיבולת 500 מ"ל)פישר סיינטיפיק09-741-07 
גלוקוז, אבקהLife Technologies15023-021
חומצת לימון (נטולת מים, נבדקה בתרבית תאים, נבדקה בתרבית תאי צמחים)סיגמא-אולדריץ'C2404-100G
נתרן ציטראט טריביסיק דיהידראטסיגמא-אולדריץ'S4641-25G
דיהידרואתידיום (הידרואתידין) (HE)Life TechnologiesD11347
דימתיל סולפוקסיד (DMSO)טכנולוגיות חייםD12345
סטפילוקוקוס זהוב ( זן עץ ללא חלבון A) BioParticles, fluorescein conjugate (FITC)Life TechnologiesS2851
Staphylococcus aureus ( זן עץ ללא חלבון A) BioParticles, ללא תוויתLife TechnologiesS-2859
Trypan Blue Solution, 0.4%Life Technologies15250-061
שואב אבק 4.0 מ"ל המכיל 7.2 מ"ג K2EDTA, VWR מיובש בריסוסBD367861תזדקק לצינור איסוף דם 1 K2EDTA לכל דגימה.
שואב אבק 4.0 מ"ל המכיל 68 יחידות USP ליתיום הפרין, VWR מצופה בריסוסBD367884תזדקק לצינור איסוף דם ליתיום הפרין אחד לכל דגימה.
קולטר Ac· T 5diff CPבקמן קולטר6605705כלומר, מנתח המטולוגיה
COULTER Ac· T 5diff שטיפהבקמן קולטר8547167
קולטר Ac· T 5diff פיקסבקמן קולטר8547171
קולטר Ac· T 5diff WBC ליזבקמן קולטר8547170
קולטר Ac· T 5diff Hgb LyseBeckman Coulter8547168
COULTER Ac· כיול T 5diff Calבקמן קולטר7547175
קולטר Ac· T 5diff קונטרול פלוסבקמן קולטר7547198
AcT 5diff מדללבקמן קולטר8547169
200 ומיקרו; l קצות פיפטה באורך מורחבVWR37001-526
מחבת קרח מבודדתVWR89198-980לאמבטיית מי קרח.
מתלה צינור מתכת פתוחVWR60916-702
Fetal BovineSerum Life Technologies26140-111
TQ-Prep תחנת עבודהבקמן קולטר6605429כלומר, תחנת עבודה אוטומטית להכנת ליז תאים
מערכת ריאגנטים ImmunoPrepבקמן קולטר7546999כלומר, מערכת ריאגנטים לתיקון RBC lyse/WBC
Cytomics FC500 MCL מערכת ציטומטריית זרימה עם תוכנת CXPבקמן קולטר626553
נוזל נדן IsoFlowבקמן קולטר8547008
קולטר קלנץבקמן קולטר8546929
פלואורוספירות בדיקת זרימה בקמן קולטר6605359i.e., יישור ואימות נוזלים פלואורוספירות
FlowJo SoftwareFlowJoכלומר, תוכנת ניתוח ציטומטריית זרימה
Excel SoftwareMicrosoftExceli.e., תוכנת גיליון אלקטרוני
נטולות מים אלקטרוני

מקורות

  1. Nieman, D. C., et al. Influence of pistachios on performance and exercise-induced inflammation, oxidative stress, immune dysfunction, and metabolite shifts in cyclists: a randomized, crossover trial. PLoS One. 9, e113725(2014).
  2. Knab, A. M., et al. Effects of a freeze-dried juice blend powder on exercise-induced inflammation, oxidative stress, and immune function in cyclists. Appl Physiol Nutr Metab. 39, 381-385 (2014).
  3. Konrad, M., et al. The acute effect of ingesting a quercetin-based supplement on exercise-induced inflammation and immune changes in runners. Int J Sport Nutr Exerc Metab. 21, 338-346 (2011).
  4. Nieman, D. C., et al. Immune and inflammation responses to a 3-day period of intensified running versus cycling. Brain Behav Immun. 39, 180-185 (2014).
  5. Nieman, D. C., et al. Carbohydrate supplementation affects blood granulocyte and monocyte trafficking but not function after 2.5 h of running. Am J Clin Nutr. 66, 153-159 (1997).
  6. Tidball, J. G. Inflammatory cell response to acute muscle injury. Med Sci Sports Exerc. 27, 1022-1032 (1995).
  7. McFarlin, B. K., Williams, R. R., Venable, A. S., Dwyer, K. C., Haviland, D. L. Image-based cytometry reveals three distinct subsets of activated granulocytes based on phagocytosis and oxidative burst. Cytometry A. 83, 745-751 (2013).
  8. Liao, Y., Liu, P., Guo, F., Zhang, Z. Y., Zhang, Z. Oxidative burst of circulating neutrophils following traumatic brain injury in human. PLoS One. 8, e68963(2013).
  9. McFarlin, B. K., Venable, A. S., Prado, E. A., Henning, A. L., Williams, R. R. Image-based flow cytometry technique to evaluate changes in granulocyte function in vitro. J Vis Exp. , (2014).
  10. Nieman, D. C., et al. Immune response to obesity and moderate weight loss. Int J Obes Relat Metab Disord. 20, 353-360 (1996).
  11. Nieman, D. C., et al. Immune function in female elite rowers and non-athletes. Br J Sports Med. 34, 181-187 (2000).
  12. Ichii, H., et al. Iron sucrose impairs phagocytic function and promotes apoptosis in polymorphonuclear leukocytes. Am J Nephrol. 36, 50-57 (2012).
  13. Gomes, A., Fernandes, E., Lima, J. L. Fluorescence probes used for detection of reactive oxygen species. J Biochem Biophys Methods. 65, 45-80 (2005).
  14. Gruger, T., et al. Negative impact of linezolid on human neutrophil functions in vitro. Chemotherapy. 58, 206-211 (2012).
  15. Dementhon, K., El-Kirat-Chatel, S., Noel, T. Development of an in vitro model for the multi-parametric quantification of the cellular interactions between Candida yeasts and phagocytes. PLoS One. 7, e32621(2012).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

Staphylococcus aureusFITCTrypan Blue
מדידת פעילות פרץ גרנולוציט ו מונוציטים Phagocytosis חמצוני בדם אנושי
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.