הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

סינתזה קלילה של Micelles תולעת דמוית ידי גלוי אור מתווכת פילמור נפיצה שימוש Photoredox Catalyst

9.3K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/54269

⸱

8 ביוני 2016

 ,  , 
1Centre for Advanced Macromolecular Design (CAMD), The University of New South Wales, 2Australian Centre for NanoMedicine (ACN), The University of New South Wales, 3School of Chemical Engineering, The University of New South Wales

במאמר זה

סיכום

מאמר זה מתאר תהליך לייצור ננו-חלקיקים פולימריים בהרכבה עצמית באמצעות פילמור פיזור בתיווך אור נראה. שימוש באור נראה באנרגיה נמוכה לשליטה בפילמור מאפשר היווצרות ניתנת לשחזור של מיצלות דמויות תולעת בהרכבה עצמית בתכולת מוצקים גבוהה.

תקציר

מוצג כאן פרוטוקול לסינתזה קלה של מיצלות דמויות תולעת על ידי פילמור פיזור בתיווך אור נראה. גישה זו מתחילה בסינתזה של פוליפולימר הידרופילי (אוליגו (אתילן גליקול) מתיל אתר מתאקרילט) (POEGMA) באמצעות פילמור הפיך של העברת שרשרת (RAFT). תחת קרינת אור נראה קלה (λ = 460 ננומטר, 0.7 mW/cm2), ניתן להאריך את השרשרת בנוכחות זרז פוטו-רדוקס מבוסס רותניום, Ru(bpy)3Cl2 עם מונומר שני ליצירת קופולימר בלוק מוגדר היטב בתהליך המכונה רפסודת העברת אלקטרונים פוטו-מושרה (PET-RAFT). כאשר משתמשים ב-PET-RAFT כדי להאריך POEGMA עם בנזיל מתאקרילט (BzMA) באתנול (EtOH), ננו-חלקיקים פולימריים בעלי מורפולוגיות שונות נוצרים באתרם על פי מנגנון הרכבה עצמית המושרה על ידי פילמור (PISA). הרכבה עצמית לננו-חלקיקים המציגים שרשראות POEGMA בעטרה ובשרשראות פולי (בנזיל מתאקרילט) (PBzMA) בליבה מתרחשת באתרה עקב חוסר המסיסות ההולך וגובר של בלוק PBzMA באתנול. מעניין לציין כי ניתן לנטר בקלות את היווצרותן של מיצלות דמויות תולעת טהורות מאוד על ידי התבוננות בהופעת ג'ל צמיג מאוד באתרו עקב הסתבכות ננו-חלקיקים המתרחשת במהלך הפילמור. תהליך זה מאפשר בכך סינתזה ניתנת לשחזור יותר של מיצלות דמויות תולעת פשוט על ידי ניטור צמיגות התמיסה במהלך הפילמור. בנוסף, ניתן ליישם את גירוי האור לסירוגין באופן ON/OFF המדגים שליטה זמנית על מורפולוגיה של ננו-חלקיקים.

מבוא

הסינתזה של ננו-חלקיקי מורפולוגיה nonspherical (ואחרים) הושגה באופן מסורתי באמצעות הליך הרכבה עצמית רב שלבים החל הסינתזה וטיהור diblock amphiphilic המוגדר היטב (או multiblock) קופולימרים. אחת טכניקות הרכבה עצמית הנפוצות ביותר היה לפופולרי אייזנברג בשנת 1990 והיא כרוכה פירוקה של קופולימר בלוק amphiphilic בתוך ממס משותף לשני בלוקי הפולימר ואחריו התוספת האיטית של סלקטיבית ממס עבור אחת מהאבן 1-3 . כמו ממס סלקטיבית (בדרך כלל מים) הוא הוסיף, קופולימר לחסום עובר הרכבה עצמית כדי ליצור חלקיקים פולימריים. המורפולוגיה הסופית (או התערובות של מורפולוגיות) של החלקיקים נקבעות על ידי מספר רב של גורמים כגון האורכים היחסיים של כל בלוק פולימר, שיעור בנוסף מים ואת אופי הממס הנפוץ. עם זאת, גישה זו בדרך כלל מאפשרת רק לייצור nanoparticles ב תוכן מוצק נמוך יחסית (פחות מ -1% WT) וכך מגביל מדרגיות 4 מעשית. בנוסף, ההיווצרות לשחזור של פאזות "ביניים" כגון מיצלות תולעת דמוית יכולה להיות קשה בשל הטווח הצר של פרמטרים הדרושים כדי לייצב מורפולוגיה 5 nonspherical זה.

The-הרכבה עצמית המושרה פילמור (PISA) הגישה חלקית מענה לחסרונות של הגישה אייזנברג ידי ניצול תהליך פילמור עצמו לנהוג הרכבה עצמית באתרו המאפשר סינתזה nanoparticle ב הרבה תוכן מוצקים יותר (בדרך כלל 10-30% WT) 6 -8. בגישת PISA טיפוסית, תהליך פילמור חיים משמש שרשרת להאריך macroinitiator מסיס ממס (או מאקרו-CTA) עם מונומר כי הוא בתחילה מסיס מדיום התגובה אך מהווה פולימר מסיס. הגישה PISA נעשה שימוש כדי לסנתז מיצלות דמוית תולעת ידי בדיקת שיטתי מספר לשעבר פרמטרי perimental ושימוש דיאגרמות שלב מפורטים כמו "מפת דרכים" סינטתית 5,9.

למרות הסינתזה שלהם המאתגרת, יש עניין רב חלקיקים תולעית בשל המאפיינים המעניינים שלהם ביחס לעמיתיהם הכדוריים שלהם. לדוגמא, אנו הוכחנו כי טעון תרופה קצרה וארוכת מיצלות דמוית תולעת המסונתזת באמצעות גישת PISA יש גבוהה משמעותי רעיל במבחנה לעומת מיצלות כדורית או שלפוחית ​​10. אחרים הראו קשר בין יחס הממדים nanoparticle וזמן זרימת הדם in vivo מודלים 11. אחרים הראו כי הסינתזה של חלקיקים דמויי תולעת באמצעות מתודולוגיה PISA מתאימה מניבה ג'ל מקרוסקופית בשל ההסתבכות ננומטריים של סיבי ננו-חלקיקים. ג'ל אלו הוכיחו פוטנציאל כמו ג'לים sterilizable בשל התנהגות סול ג'ל thermoreversible שלהם 12.

ontent "> פרוטוקול זה מתאר שיטה המאפשרת ניטור באתרו של היווצרות של מיצלות דמוית תולעת פשוט על ידי התבוננות צמיגות פתרון במהלך פילמור. מחקרים קודמים של ג'לים micellar דמוית תולעת דומה הראו כי מעל לטמפרטורה קריטית, אלה חלקיקים עוברים מעבר תולעת-כדור הפיך וכך יוצרים תפוצות חופשיות זורמות בטמפרטורות גבוהות. נכון להיום, מערכות אלה השתמשו תרכובת אזו רגישה תרמי ליזום פילמור נשלט 13,14 וכך gelation לא יכול לצפות בקלות במערכות אלו במהלך פילמור התרמית. ממחקרים אלה, זה היה שיערותיו כי סינתזת חלקיקים נגזרים PISA בטמפרטורות נמוכות עשויה לאפשר תצפית של התנהגות gelation זו באתרו.

לאחרונה דיווחנו על השימוש בטכניקת photopolymerization הטמפרטורה קלילה חדר לתווך בתהליך PISA להניב חלקיקים שלמורפולוגיות שונות 15. כאן, פרוטוקול דמיין מוצג לסינתזה לשחזור של מיצלות דמוית תולעת על ידי התבוננות בהתנהגות הצמיגה הפתרון במהלך פילמור. התמורה פילמור פיזור בקלות באמצעות זמינים מסחרית דיודות פולטות אור (LEDs) (λ = 460 ננומטר, 0.7 mW / cm 2).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

סינתזה 1. אפיון POEGMA מאקרו-CTA

  1. להוסיף אוליגו (אתילן גליקול) methacrylate אתר מתיל (OEGMA) (12 גר ', 4 × 10 -2 mol), 4-cyano-4- (phenylcarbonothioylthio) חומצה pentanoic (CPADB) (0.224 גרם, 8 × 10 -4 mol), 2,2'-azobis (2-methylpropionitrile) (AIBN) (16.4 מ"ג, 0.1 מילימול) ו -50 מ"ל אצטוניטריל (MeCN) על 100 מ"ל עגול הבקבוק התחתון.
  2. חותם את הבקבוק עם חוט מחצה ופלדה גומי בגודל מתאים לקרר את הבקבוק מ בטמפרטורת החדר כדי <4 מעלות צלזיוס באמבט קרח-מים.
  3. Deoxygenate הבקבוק למשך 30 דקות על ידי מבעבע חנקן ישירות לתוך תערובת התגובה דרך (מ"מ 0.8 מ"מ x 120) 21 מחט G עם מחט שני 21 G (0.8 מ"מ x 38 מ"מ) מתנהג כמו פורקן.
  4. מניח את הבקבוק באמבט שמן על 70 מעלות צלזיוס במשך 5.5 שעות לפני מרווה את פילמור על ידי טבילה באמבט קרח-מים ועל חשיפת התכנים לאוויר.
  5. הסר את MeCN ידי תסיסה תחת acזרם ontinuous של אוויר דחוס מחדש לפזר את התערובת הגולמית ~ 40 מיליליטר tetrahydrofuran (THF).
  6. מוסיפים את תכולת הבקבוק dropwise ל -400 מ"ל של תערובת בחש במהירות של רוחות נפט (נ"ב 40-60 מעלות צלזיוס) ואתר diethyl (70:30, V / V) את האש וממשיכים לטגן עד supernatant הוא כבר לא מעוננים.
    הערה: קירור באמבט קרח ניתן להשתמש כדי להאיץ את התהליך המשקע.
  7. למזוג supernatant מחדש לפזר את שאריות פולימר ~ 40 מ"ל THF.
  8. חזור על התהליך ממטרים (שלבים 1.5-1.7) לפחות פעמיים נוספות על מנת להבטיח הסרה מלאה של מונומר OEGMA שיורית. הסר את הממס עודף מ-CTA מאקרו POEGMA מטוהרים ראשית ידי תסיסה תחת זרם רציף של אוויר דחוס וייבוש בתנור ואקום (20 ° C, 10 mbar) עבור 4 שעות.
  9. קבע את המשקל המולקולרי הממוצע המספר של CTA-מאקרו POEGMA ידי תהודה מגנטית גרעינית (NMR) (M n, NMR) בשיטה שדווחה בעבר 15. באמצעות חלחול ג'ל כרומטוגרפיה 15 (GPC) (dimethylacetamide כשלב נייד בסטנדרטים המתאימים לכיול) לחשב את dispersity הפולימר (ד).
    הערה: שימוש סינתזה לעיל (שלבים 1.1-1.8) אמור להניב-CTA מאקרו POEGMA באות M n, תמ"ג = 9,000, ו- D <1.15. אם המשקל המולקולרי (ו dispersity) של CTA-מאקרו POEGMA המסונתז נבדל הסינתזה שהוצגה כאן (בין 7,000 - 1,000 g / mol), ההיווצרות של מיצלות דמוית תולעת (כפי שמסומן על-ידי gelation באתרו) עדיין יכול להתרחש באמצעות המתודולוגיה PISA לאחר שהוצגה (סעיף 2) אם כי זמן תגובה שונה מעט.

2. הכנת POEGMA- ב -PBzMA חלקיקי שימוש PISA

  1. הכן פתרון מניות 1 מ"ג / מ"ל של Ru (bpy) 3 Cl 2. 6H 2 O באתנול (EtOH). אחסן את פתרון המניות במקרר כדי למזער אידוי ממס.
  2. חבר פיפטה פסטר עם פיסה קטנה של צמר גפן בעזרת פיפטה שני כדי לעזור לארוז אותו בחוזקה. יוצקים תחמוצת אלומיניום בסיסית לתוך פיפטה עם תקע צמר גפן לתת טור של כ 5 ס"מ. הסר את מעכב הידרוקינון אתר monomethyl ב BzMA מסחרי על ידי העברת ~ 3 מ"ל של BzMA דרך העמודה ואיסוף eluent BzMA deinhibited.
  3. להוסיף POEGMA macroCTA (~ 9,000 g / mol; 76.9 מ"ג, 8.5 × 10 -6 mol)., Deinhibited BzMA (0.301 גרם, 1.71 × 10 -3 mol), רו (bpy) 3 Cl 2 6H 2 O (128 מיקרוגרם, 1.71 × 10 -7 mol, 128 μl של פתרון המניות 1 מ"ג / מ"ל האתנולית), 0.383 מ"ל MeCN ו 1.402 מ"ל EtOH (ממס הכולל 1.913 מ"ל, 80% WT, 20 v / v% MeCN) כדי בקבוקון זכוכית 4 מ"ל .
  4. בצע את הליך הרחקת החמצן כפי שמתואר צעדים 1.2-1.3.
  5. מניח את הבקבוקון בתוך כוס זכוכית 2,000 מיליליטר (איור 2) מרופד פסי LED כחולים (מקסימום λ = 460ננומטר, 0.7 mW / cm 2) ו מקרינים בטמפרטורת חדר עם ערבוב מגנטי. צג את הבקבוקון התגובה שגרתי לאחר 20 שעות ולהסיר אותו מהכור כאשר הפתרון צמיגות גבוהה יוצר ג'ל שעמד חופשי כאשר הבקבוקון הוא הפוך (איור 3).
    הערה: משך הזמן הכולל להניב ג'ל שעמד חופשי צריך להיות בערך 24 שעות של הקרנה תכלת באמצעות התנאים שהוצגו כאן. הבדלים קטנים כורה הקרנת האור (ממדים פיסיים, עוצם, וכו ') עשויים לדרוש תנאים שינו מעט (זמן תגובה במיוחד) כדי להשיג את ההיווצרות באתרו של מיצלות דמוית תולעת.
  6. לאחר הסרת מהכור, להרוות את פילמור על ידי חשיפת ג'ל ננו-חלקיקים לאוויר למשך מספר דקות ואחסון הבקבוקון סגור זקוף בחושך.

3. במיקרוסקופ אלקטרונים הילוכים (TEM) הדמיה של מורפולוגיה Nanoparticle

  1. מניח כ 40 מ"ג של nanopa הגולמיג'ל rticle (מסעיף 2) בבקבוקון זכוכית 4 מ"ל.
  2. ברציפות להתסיס את הג'ל ננו-חלקיקים בעזרת מערבל מערבולת ולהוסיף 4 מ"ל של EtOH dropwise על פני תקופה של 5 דקות לפחות. הג'ל צריך להיות פתרון חופשי זורם במהלך תוספת ממס.
    הערה: אם הג'ל הוא מדולל EtOH מהר מדי או לא נסער כראוי, כמה ממטרים של החלקיקים עלולים להתרחש. ראה שלב 3.3.
  3. הסר את כל אגרגטים מקרוסקופית מן החלקיקים בדילול ידי סינון דרך צמר זכוכית.
  4. בצע הדמיה TEM (עם מכתים אצטט uranyl) של המדגם מדולל פי נוהל שדווח בעבר. 15

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

במחקר זה, פרוטוקול פילמור שני שלבים משמש לסינתזה של מיצלות דמוית תולעת באמצעות גישת PISA (איור 1). בשלב הראשון, פילמור של OEGMA מתבצע מניב-CTA מאקרו POEGMA אשר יכול לשמש כמייצב צעד פילמור שלאחר מכן. תמורת פילמור PET-הרפסודה בתנאי פיזור בשל insolubility של PBzMA באתנול אשר מוביל בסופו של דבר להיווצרות ננו-חלקיקים. במהלך פילמור, את תערובת התגובה השקופה בתחילה ניתן לצפות להיות מעונן בהתאם פילמור פיזור ולבסוף מעברת למצב דמוי ג'ל צמ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

פרוטוקול דמיין זה מדגים את היכולת לפקח על ההיווצרות של מיצלות דמוית תולעת פשוט על ידי התבוננות הופעת ההתנהגות דמוית ג'ל. השירות של גישה זו טמון ביכולת לפקח היווצרות תולעת במהלך פילמור בהשוואה לשיטות אחרות. הליך זה יכול להתבצע באמצעות פילמור שני שלבים של שני מונומרים זמינים מסחרית (OEGMA ו BzMA) להניב -PBzMA ב POEGMA- עצמית התאספו קופולימרים diblock amphiphilic.

יצוין כאן כי כורה בגיאומטריות כור שונות...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

למחברים אין מה לחשוף.

תודות

CB אסיר תודה על מלגת העתיד שלו ממועצת המחקר האוסטרלית (ARC-FT12010096) ו-UNSW אוסטרליה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
4-Cyano-4-
(phenylcarbonothioylthio)חומצה פנטנואית (CPADB)		סיגמא-אולדריץ'722995-5G
אוליגו(אתילן גליקול) מתיל אתר מתאקרילט (OEGMA)סיגמא-אולדריץ'447935-500 מ"לממוצע Mn 300, מכיל 100  ppm MEHQ כמעכב, 300  ppm BHT כמעכב
2,2′-אזוביס (2-methylpropionitrile) (AIBN)Sigma-Aldrich
Ru(bpy)3Cl2.6H2OSigma-Aldrich544981-1G
בנזיל מתקרילט (BzMA)Sigma-Aldrich409448-1Lמכיל מונומתיל אתר הידרוקינון כמעכב
תחמוצת אלומיניום ( בסיסי)Chem-Supply Pty Ltd אוסטרליהAL08371000
95% אתנול (EtOH)Sucrogen Bio Ethanol80889
Acetonitrile (MeCN)Chem-Supply Pty Ltd אוסטרליהRP1005-G2.5L
Tetrahydrofuran (THF)Chem-Supply Pty Ltd אוסטרליהTA011-2.5L
משקאות חריפים נפט (40-60  ° C)Chem-Supply Pty Ltd אוסטרליהPA044-2.5L
DiethylEther Chem-Supply Pty Ltd אוסטרליהEA0362.5L
Dimethylacetamide (DMAc)VWR International AustraliaALFA22916. M1לניתוח GPC
פיפטות פסטר (230  מ"מ)Labtek355.050.503
כוסות זכוכיתLabtek025.01.902 (2L)/ 2110654 (1L)2  L מיועדת לחיבור פסי LED ליצירת הכור העגול
רצועת LED מסחריתEcoLabn/aλ = 460 ננומטר, 4.8 W/m
4 מ"ל בקבוקוני זכוכיתLabtekAPC502214B
0.9 מ"ל קוורץ CuvetteStarna Scientific Ltd21/Q/2
מחט (0.8 מ"מ x 38  מ"מ)בקטון דיקסון302017לתגובות דה-חמצן
מחט (0.8 מ"מ x 120  מ"מ)B בראון אוסטרליה4665643לתגובות דה-חמצן
מחיצת פקק שרוול (מחיצת גומי)Sigma-Aldrichz564680/z564702
ערבוב פלטות חימוםVWR International Australia/In Vitro Technologies97018-488/RADRR91200
מערבל מערבולתVWR International אוסטרליה412-0098
תנור ואקוםבמבחנה טכנולוגיותMEMVO200

מקורות

  1. Yu, Y., Eisenberg, A. Control of Morphology through Polymer−Solvent Interactions in Crew-Cut Aggregates of Amphiphilic Block Copolymers. J. Am. Chem. Soc. 119 (35), 8383-8384 (1997).
  2. Zhang, L., Eisenberg, A. Thermodynamic vs Kinetic Aspects in the Formation and Morphological Transitions of Crew-Cut Aggregates Produced by Self-Assembly of Polystyrene-b-poly(acrylic acid) Block Copolymers in Dilute Solution. Macromolecules. 32 (7), 2239-2249 (1999).
  3. Zhang, L., Eisenberg, A. Multiple Morphologies of 'Crew-Cut' Aggregates of Polystyrene-b-poly(acrylic acid) Block Copolymers. Science. 268 (5218), 1728-1731 (1995).
  4. Yu, K., Zhang, L., Eisenberg, A. Novel Morphologies of "Crew-Cut" Aggregates of Amphiphilic Diblock Copolymers in Dilute Solution. Langmuir. 12 (25), 5980-5984 (1996).
  5. Blanazs, A., Ryan, A. J., Armes, S. P. Predictive Phase Diagrams for RAFT Aqueous Dispersion Polymerization: Effect of Block Copolymer Composition, Molecular Weight, and Copolymer Concentration. Macromolecules. 45 (12), 5099-5107 (2012).
  6. Ladmiral, V., Semsarilar, M., Canton, I., Armes, S. P. Polymerization-induced self-assembly of galactose-functionalized biocompatible diblock copolymers for intracellular delivery. J. Am. Chem. Soc. 135 (36), 13574-13581 (2013).
  7. Sugihara, S., Blanazs, A., Armes, S. P., Ryan, A. J., Lewis, A. L. Aqueous Dispersion Polymerization: A New Paradigm for in Situ Block Copolymer Self-Assembly in Concentrated Solution. J. Am. Chem. Soc. 133 (39), 15707-15713 (2011).
  8. Wan, W. M., Hong, C. Y., Pan, C. Y. One-pot synthesis of nanomaterials via RAFT polymerization induced self-assembly and morphology transition. Chem. Comm. (39), 5883-5885 (2009).
  9. Semsarilar, M., Jones, E. R., Blanazs, A., Armes, S. P. Efficient Synthesis of Sterically-Stabilized Nano-Objects via RAFT Dispersion Polymerization of Benzyl Methacrylate in Alcoholic Media. Adv. Mater. 24 (25), 3378-3382 (2012).
  10. Karagoz, B., et al. Polymerization-Induced Self-Assembly (PISA) - control over the morphology of nanoparticles for drug delivery applications. Polym. Chem. 5 (2), 350-355 (2014).
  11. Geng, Y., et al. Shape effects of filaments versus spherical particles in flow and drug delivery. Nat Nano. 2 (4), 249-255 (2007).
  12. Blanazs, A., et al. Sterilizable gels from thermoresponsive block copolymer worms. J. Am. Chem. Soc. 134 (23), 9741-9748 (2012).
  13. Pei, Y., Thurairajah, L., Sugita, O. R., Lowe, A. B. RAFT Dispersion Polymerization in Nonpolar Media: Polymerization of 3-Phenylpropyl Methacrylate in n-Tetradecane with Poly(stearyl methacrylate) Homopolymers as Macro Chain Transfer Agents. Macromolecules. 48 (1), 236-244 (2015).
  14. Fielding, L. A., Lane, J. A., Derry, M. J., Mykhaylyk, O. O., Armes, S. P. Thermo-responsive Diblock Copolymer Worm Gels in Non-polar Solvents. J. Am. Chem. Soc. 136 (15), 5790-5798 (2014).
  15. Yeow, J., Xu, J., Boyer, C. Polymerization-Induced Self-Assembly Using Visible Light Mediated Photoinduced Electron Transfer-Reversible Addition-Fragmentation Chain Transfer Polymerization. ACS Macro Lett. 4 (9), 984-990 (2015).
  16. Xu, J., Jung, K., Corrigan, N. A., Boyer, C. Aqueous photoinduced living/controlled polymerization: tailoring for bioconjugation. Chem. Sci. 5 (9), 3568-3575 (2014).
  17. Pei, Y., et al. RAFT dispersion polymerization of 3-phenylpropyl methacrylate with poly[2-(dimethylamino)ethyl methacrylate] macro-CTAs in ethanol and associated thermoreversible polymorphism. Soft Matter. 10 (31), 5787-5796 (2014).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

PET RAFTRAFT
סינתזה קלילה של Micelles תולעת דמוית ידי גלוי אור מתווכת פילמור נפיצה שימוש Photoredox Catalyst
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.