מאמר שיטה

ייצור בקנה מידה גדולה של cardiomyocytes מתאי גזע פלוריפוטנטיים אדם באמצעות פרוטוקול בידול מולקולה קטן המבוססת לשחזור ביותר

10K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/54276

⸱

25 ביולי 2016

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Stem Cells and Developmental Biology, Cell Science Research Center, Royan Institute for Stem Cell Biology and Technology, ACECR, 2Developmental and Stem Cell Biology Division, Victor Chang Cardiac Research Institute, 3St. Vincent´s Clinical School, Faculty of Medicine, University of New South Wales, 4School of Biotechnology and Biomolecular Sciences, University of New South Wales, 5Department of Developmental Biology, University of Science and Culture, 6Heart Centre for Children, The Children´s Hospital at Westmead, 7Sydney Medical School, University of Sydney, 8Department of Developmental Biology, University of Science and Culture, Tehran, Iran

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

כאן, אנו מציגים פרוטוקול התמיינות קרדיומיוציטים חזק, מהיר וניתן להרחבה עבור תאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים (hPSCs). קרדיומיוציטים המופקים בשיטה בקנה מידה גדול זה יכולים לספק מספר תאים מספיק לשימוש יעיל בהם במודלים של מחלות לב וכלי דם בבני אדם, סינון תרופות בתפוקה גבוהה ויישומים קליניים פוטנציאליים.

תקציר

למקסם את התועלת של תאי גזע פלוריפוטנטיים אדם (hPSCs) למחקר, דוגמנות מחלה, תרופות ויישומים קליניים דורש שיטות חזקות עבור הייצור בקנה המידה הגדולה של סוגי תא פונקציונליים, כוללים שריר לב. כאן אנו מראים כי המניפולציה הזמנית של Wnt, TGF-β, ו ששישה מסלולי איתות מובילה בידול cardiomyocyte היעיל ביותר של קווי תא בודד passaged hPSC בשנייה השעיה סטטי ומערכות bioreactor ההשעיה עוררה. העסקת אסטרטגיה זו הביאה ~ 100 spheroids להכות%, בעקביות המכיל> 80% טרופונין לבבי תאי T-חיובי לאחר 15 ימים של תרבות, תוקף בקווים hPSC מרובים. כמו כן, אנו מדווחים על וריאציה של פרוטוקול זה לשימוש עם שורות תאים אינם מותאמים כיום passaging תא בודד, להצלחת אשר אומת ב- 42 קווי hPSC. Cardiomyocytes שנוצר תוך שימוש בפרוטוקולים אלה מבטאים סמני שושלת ספציפית electrophys צפוי להראותפונקציות iological. הפרוטוקול שלנו מציג פלטפורמה פשוטה, יעילה חזקה עבור הייצור בקנה המידה הגדולה של cardiomyocytes אדם.

מבוא

תאי גזע אנושיים pluripotent (hPSCs), כולל בתאי גזע עובריים אנושיים (hESCs) ותאי גזע מושרים (hiPSCs), יש את היכולת של התחדשות עצמית ואת היכולת להתמיין לתאי של שלוש שכבות נבט עובריים 1,2. בשל תכונותיו אלה, hPSCs לספק מקור חשוב ובלתי מוגבל לייצור ההדור וניתן להרחבה של סוגי תא רלוונטי מחל למידול מחל אנושי 3-5, עבור מבחני הקרנת סמי תפוקה גבוהה ורעילים 6,7 ואפשרות ליישומים קליניים 8 . דור של cardiomyocytes מ hPSCs מספק את ההזדמנות כדי לחקור את המנגנונים במיוחד של מחלות לב וכלי דם אדם מורכבות הטיפולים האפשריים שלהם, בעבר מעבר להיקף של היכולות שלנו בשל החוסר במודלים של בעלי חיים רלוונטיים ו / או הזמינות של רקמות עיקריות מושפעות.

כל היישומים הנ"ל של hPSCs necessitate לייצור מסיבי של cardiomyocytes מועשר מאוד פונקציונלי. לפיכך, על זמינותו של הפתרון יעיל, לשחזור ומדרגית בפרוטוקול בידול לב במבחנה מתאימה מספר שורות hPSC היא קריטית. פרוטוקולי בידול cardiomyocyte הרווחים כיום מועסקי אסטרטגיות שונות כגון 9 היווצרות גוף embryoid, טכניקות שיתוף תרבות 10, אינדוקציה עם קוקטיילים של ציטוקינים 11 ושיטות תמרת חלבון 12. למרות התקדמות בטכניקות אלה, שרובם עדיין סובלים יעילות עניות, דורשים גורמי גדילה יקרים, או להציע האוניברסליות מוגבלות כאשר מנסים להשתמש קווי hPSC מרובים. עד כה, האתגרים הללו קיימים מגבלות על הייצור של cardiomyocytes hPSC הנגזרות ללימודי טיפול בתאים במודלים של בעלי חיים, כמו גם בתעשיית התרופות לגילוי סמים 13. לכן, הפיתוח של טכניקות חזקות ובמחיר סבירים עבור גדולייצור -scale של cardiomyocytes hPSC נגזרות התפקודי במערכות תרבות מדרגים היה במידה רבה להקל היישומים המסחריים קליניים שלהם.

בכתב היד הזה, אנו מדווחים על הפיתוח של חסכונית מערכת בידול לב משולבת עם יעילות גבוהה, שחזור תחולת hESCs ו hiPSCs המופקת ממגוון מקורות ושיטות תרבות, כוללים שיטה לייצור בקנה המידה הגדולה של מאוד אוכלוסיות מועשרות של cardiomyocytes נגזרת hPSC באמצעות bioreactor. בנוסף, יש לנו אופטימיזציה בפרוטוקול זה לקווי hPSC אינו מותאמים מזין תרבית תאים חינם ו / או יחידה, כגון hiPSCs שהוקם או קבוצות גדולות של קווי hPSC רלוונטיים ניתוח של מנגנון מחלה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

1. הכנת תרבות מדיה, ציפוי של צלחות תרבית תאים ותחזוקה של מובחן hPSCs

  1. הכנת מדיה
    הערה: לעקר מדיה באמצעות מכשיר 0.22 מיקרומטר סינון ולאחסן ב 4 ° C מוגן מפני אור עד 4 שבועות. שמות מגיבים, ספקים מק"טים מפורטים חומרי טבלה.
    1. עבור פיברובלסטים עכבר עובריים (MEF) בינוני, לשלב 445 מיליליטר DMEM, 50 מיליליטר עוברי שור סרום (FBS) ו -5 תקשורת תרבית תאי מיליליטר (למשל, Glutamax).
    2. לקבלת בינוני hESC, לשלב 390 מ"ל נוק-DMEM (KO-DMEM), 100 מ"ל תחליף נוק סרום (KO-SR), 5 מ"ל תרבית תאים התקשורת, 5 מ"ל MEM פתרון חומצות אמינו חיוניות מינימום 0.5 מ"ל 55 מ"מ β-mercaptoethanol.
      זהירות: β-mercaptoethanol הוא רעיל. הימנע משאיפה, בליעה ומגע עור.
    3. לקבלת RPMI-B27 (RB) בינוני, לשלב 475 מ"ל RPMI 1640, 10 מ"ל מינוס B27אינסולין, 5 מ"ל תא התקשורת והתרבות, 5 מ"ל MEM פתרון חומצות אמינו חיוניות מינימום, 5 מ"ל פניצילין / סטרפטומיצין ו 0.5 מ"ל 55 מ"מ β-mercaptoethanol.
    4. עבור פתרון דיסוציאציה (DS), לשלב 10 מ"ל 0.05 טריפסין%, 4 מ"ל KO-SR, 1 מ"ל IV סוג collagenase (1 מ"ג / מ"ל), 5 מ"ל KO-DMEM ו -20 μl CaCl 2 (1 מ ').
    5. לקבלת בינוני אוויר תאים מזין, להוסיף 15 מ"ל בינוני hESC (ללא bFGF) כדי בקבוקון T75 עם קון fl תאים מזין uent (MEF או אדם העורלה פיברובלסטים) אשר היו מומת בעבר על ידי טיפול עם mitomycin או C או על ידי הקרנה. הקציר מותנה בינוני לאחר 24 שעות ולהחליף עם מדיום hESC טרי. תאים יכולים לשמש עד 2 שבועות.
  2. ציפוי של צלחות תרבית תאים
    1. ECM ג'ל ציפוי:
      1. לאחר הרכישה, להפשיר את תמצית ג'ל ECM על 4 מעלות צלזיוס עד שהוא נמצא במצב נוזלי עקבי באופן שווה, על פי הוראות היצרן. לדלל ביחסשל 1: 2 ב KO-DMEM הבינוני, aliquot ולאחסן הקרים ב -20 ° C.
        הערה: במהלך הכנת ג'ל ECM, לשמור את כל החומרים הדרושים לשימוש בקור הליך aliquotting וציפוי. ריכוז ג'ל ECM משתנה עם מספר האצווה. ודא ריכוז יצוין על aliquots. יכול להישמר aliquots ב -20 מעלות צלזיוס למשך עד 6 חודשים.
      2. להפשיר aliquot ג'ל ECM על 4 מעלות צלזיוס. כאשר מופשר, להוסיף בינוני KO-DMEM קר ריכוז סופי של 0.34 מ"ג / מ"ל. פיפטה היטב ומוסיפה 0.75 מ"ל לכל אחד טוב של צלחת 6 באר. דגירה עבור שעה 1 ב 37 מעלות צלזיוס.
    2. תא מזין Mitotically מומת עכבר העוברי פיברובלסטים (MEF) ציפוי
      הערה:. הכנת תאי מזין MEF תוארה בעבר 14
      1. מעיל צלחת תרבית תאים 6 גם עם פקטור Attachment (AF) או 0.1% ג'לטין (ראה שלב 1.2.3) ב RT במשך 5 דקות (0.75 מ"ל לכל אחד טוב של צלחת 6-היטב).הסר ולהשאיר צלחת בארון בטיחות ביולוגית (BSC) לייבוש.
      2. להפשיר MEF ידי העברת בקבוקון קפוא באמבט מים 37 מעלות צלזיוס למשך כ 2 - 3 דקות.
      3. הוסף 7 מ"ל בינוני MEF לצינור 15 מ"ל. כאשר את הבקבוקון של תאים מופשר, לאט להעביר את התוכן אל הצינור 15 מ"ל. צנטריפוגה XG ב 300 למשך 4 דקות. לשאוב supernatant ו resuspend התאים במדיום MEF.
      4. ספירת תאי צלחת 1 × 10 6 תאים לכל 6 צלחת היטב (~ 1.7 x 10 5 תאים / טוב). מעבירים חממה 37 ° C / 5% CO 2 ולאפשר לתאים לצרף O / N לפני השימוש.
    3. ציפוי ג'לטין:
      1. ממיסים 1 גרם של אבקת ג'לטין במים ultrapure לבצע% 0.1 (w / v) פתרון. דגירה במשך 15 דקות ב 37 מעלות צלזיוס ואז חיטוי הפתרון ב 121 מעלות צלזיוס במשך 15 דקות. כאשר התקררו, להוסיף את המספר הדרוש של בארות (0.75 מ"ל לכל אחד טוב של צלחת 6-היטב) דגירה במשך 15 דקות ב 37 מעלות צלזיוס.
        הערה: כל פתרון 0.1% ג'לטין הנותרים יכולים להישמר על 4 מעלות צלזיוס עד 1 חודש.
    4. Laminin ציפוי:
      1. להפשיר laminin (1 מ"ג / מ"ל) ב 4 ° C עד מופשר. עד 5 μl של פתרון laminin, להוסיף 1 מ"ל של קר PBS. פיפטה היטב ואז להוסיף את המספר הדרוש של בארות (0.75 מ"ל לכל אחד טוב של צלחת 6-היטב) דגירה במשך שעה 1 ב 37 מעלות צלזיוס.
    5. הסיליקון ציפוי של המשטח הפנימי ספינר Flask:
      1. ביסודיות לשטוף בקבוק 100 מיליליטר טווה (עם 1 מטוטלת זכוכית) עם מים מזוקקים, בעזרת מברשת ניקוי כדי להסיר כל אבק ו / או שאריות תרבות. מלא עם 70% אתנול ו אחרי 30 דקות לשטוף עם מים מזוקקים. הוסף 5 M NaOH ולהשאיר O / N.
      2. הסר פתרון NaOH ולשטוף את הבקבוק מתחת למים זורמים למשך 5 דקות. מלאו את הבקבוק עם 1 M HCl ולהשאיר למשך 15 דקות. לשטוף את הבקבוק עם מים זורמים למשך 5 דקות, ולאחר מכן פעמיים עם מים מזוקקים פעמיים לחלוטיןלהסיר כל שמץ של HCl. השאירו את הבקבוק להתייבש לחלוטין של BSC.
      3. הוסף 1.5 מ"ל של תמיסת siliconizing אל הבקבוק וסובב אופקית כדי לכסות את כל המשטחים. חזור על אותו התהליך עבור מטוטלת הזכוכית.
      4. מחממים את הבקבוק מצופה בתנור יבש ב 100 מעלות צלזיוס במשך שעה 1. או ולאפשר לו להתייבש O / N ב RT. אם מחוממים בתנור, ומניחים להצטנן ל RT במשך 30 - 60 דקות.
      5. יש לשטוף את הבקבוק 3 פעמים עם מים ללא יונים במשך 15 דקות כל אחד, ואז לעקר ידי מעוקר ב 121 צלזיוס למשך 20 דקות.
  3. תחזוקה של מובחן hPSCs
    הערה:     כל אחד מהפרוטוקולים תארו, אלא אם כן נאמר במפורש, תאים גדלים בתרבית בבארות של צלחות תרבות 6 היטב כרך יינתן מתאים עבור הפורמט הזה.
    1. hPSCs מתורבתות כמו מובחן Spheroids בתוך מערכת מתלי סטטי
      הערה: תאים המשמשים את הפעולות הבאות צריכים כבר להיות מותאמיםתא בודד תרבות. 15
      1. התחל ניסוי עם hPSCs בתרבית על ג'ל ECM בצלחת תרבות 6 היטב על כ 70 - 80% confluency. הסר את כל מושבות בדיל באמצעות סטראו ב BSC. הוסף 10 מיקרומטר ROCK מעכב Y-27632 ו לדגור על 37 מעלות צלזיוס במשך שעה 1.
        הערה: הסרת מושבות הבדיל, להשתמש קצה פיפטה כדי לנתק בעדינות להסיר את כל חלקי הבדיל באופן ידני תחת סטראו. היזהר שלא להסיר מושבות מובחנות.
      2. הסרת תאים מן החממה לשאוב בינוני. שוטפים את התאים עם 1 מ"ל PBS, להסיר ולהוסיף 0.5 אנזים תא דיסוציאציה מ"ל. דגירת התאים למשך 4 - 5 דקות ב 37 מעלות צלזיוס.
      3. הוסף 1 מ"ל בינוני hESC ולאסוף את התאים באמצעות מגרד התא. לנתק את התאים לתוך תאים בודדים בעזרת פיפטה p1,000. ספירת התאים קיימא באמצעות Trypan כחול ו hemocytometer.
      4. תאי Resuspend 2 × 10 5 ג קיימאאמות / מ"ל ​​במדיום מזין תאים ממוזגים בתוספת 100 ng / ml bFGF ו -10 מיקרומטר ROCK מעכב Y-27632. העבר תאים צלחות מצורף אולטרה-נמוכה בעזרת פיפטה 5 מ"ל (3 מ"ל לכל טוב של צלחת 6-היטב).
      5. אחרי 2 ימים, להסיר תאים בזהירות מן החממה חצי לשאוב של המדיום (כ 1.5 מ"ל). החלף בינוני מותנה טריים בתוספת 100 ng / ml bFGF.
      6. שנה וחצי של המדיום כל יום עם מדיום מותנה בתוספת 100 ng / ml bFGF עד יום 5. עכשיו, או תאי תרבות נוספים, מעבר לתרבות המובחנת המשיכה (שלב 1.3.1.2 - 5), או להשתמש לבידול לב (סעיף 2 ). אם תרבות המשך, תאים מעבר כל 4 - 8 ימים.
    2. hPSCs בתרבית על תאים מזינים ו passaged שימוש Collagenase סוג IV
      1. לפני passaging hPSCs, להסיר כל מושבות בדיל באמצעות סטראו ב BSC. לשאוב את המדיום ולשטוף תאים עם 1 מ"לPBS לכל טוב. Remove ואז להוסיף 0.75 מ"ל IV סוג collagenase (1 מ"ג / מ"ל) ו לדגור על 37 מעלות צלזיוס במשך 5 - 15 דק ', כנדרש כדי לקבל את הקצוות של מושבות החל להתקלף.
      2. collagenase לשאוב ולהוסיף 1 מ"ל של מדיום hESC לכל טוב. ניתוק מושבות לאשכולות קטנים באמצעות מגרד התא, ולאחר מכן להעביר את התאים בעזרת פיפטה p1,000 לתוך צינור 15 מ"ל. היזהר שלא לשבור את האשכולות לחתיכות קטנות.
      3. שטפו את המדיום היטב עם 1 מ"ל hESC לאסוף את כל התאים הנותרים ולהוסיף שפופרת 15 מ"ל. צנטריפוגה ב 100 XG למשך 2 דקות. לשאוב את התאים supernatant ו resuspend במדיום hESC בתוספת 100 ng / ml bFGF.
      4. הסר צלחת MEF מצופה מן החממה לשאוב את המדיום MEF. העברת התאים ביחס בין 1: 3 ו 1:10, על פי צורך. שנה בינונית יומי עם מדיום hESC טרי בתוספת 100 bFGF ng / ml. תאים מעבר כל 4 - 8 ימים.

2. Differentiation של hPSCs כמו Spheroids בתוך מערכת מתלי סטטי

  1. התחל ניסוי באמצעות יום 5 spheroids מובחן כפי שהוכנו בסעיף 1.3.1.
    הערה: בשלב זה, את הגודל הממוצע של spheroids צריך להיות 175 ± 25 מיקרומטר. מינימום של 50 spheroids אמור לשמש בעת הפעלת ניסוי בידול.
  2. העברת spheroids לתוך צינור 15 מ"ל בעזרת פיפטה 5 מ"ל. שטפו את המדיום היטב עם 1 מ"ל RB לאסוף כל spheroids הנותרים ולהוסיף שפופרת 15 מ"ל אותו. השאר את התאים למשך 5 דקות עד spheroids יש משקעים כדי ליצור גלולה רופפת (DO NOT צנטריפוגות). לשאוב supernatant, נזהר לא לקחת שום spheroids.
  3. הוסף 3 בינוני מ"ל RB בתוספת 12 מיקרומטר CHIR99021. מעביר את התאים בחזרה לתוך אחד טוב של צלחת מצורפת 6-גם נמוכה במיוחד. לאחר 24 שעות, חזור על שלב 2.2.
    הערה: בינוני RB הוא רגיש לאור. כשעובדים עם המדיום RB, לשמור את האור BSC כבוי.
  4. אdd 3 מ"ל בינוני RB אל התא גלולה. מעביר את התאים בחזרה לתוך אחד טוב של צלחת מצורפת 6-גם נמוכה במיוחד. לאחר 24 שעות, חזור על שלב 2.2.
  5. הוסף 3 בינוני מ"ל RB בתוספת IWP2, purmorphamine ו SB431542 (5 מיקרומטר אחד). מעביר את התאים בחזרה לתוך אחד טוב של צלחת מצורפת 6-גם נמוכה במיוחד. אחרי 2 ימים לחזור על שלב 2.2.
  6. Resuspend התאים 3 מ"ל של מדיום RB והעברה צלחת מצופה ג'לטין כדי לאפשר לתאים לצרף.
    הערה: בשלב זה, תאים יכולים גם להישמר השעיה. כדי להמשיך עם תרבות השעיה סטטי, ולהעביר את התאים בחזרה צלחת מצורפת אולטרה-נמוכה.
  7. שינוי המדיום עם 3 מ"ל בינוני RB אחרי 2 ימים. התרבויות תתחלנה להכות למחרת. שינוי המדיום כל 3 - 4 ימים עם מדיום RB.

בידול 3. hPSCs כמו Spheroids בתוך Bioreactor השעיה נסער

  1. התחל ניסוי עם תרבות spheroids מובחןד השעיה סטטי עבור 3 קטעים לפחות (ראה סעיף 1.3.1). הוסף 10 מיקרומטר ROCK מעכב Y-27632 ו לדגור על 37 מעלות צלזיוס במשך שעה 1.
  2. הסרת תאים מן החממה ולהעביר את כל spheroids לתוך צינור 15 מ"ל בעזרת פיפטה 5 מ"ל. שטפו את המדיום היטב עם 1 מ"ל hESC לאסוף כל spheroids הנותרים ולהוסיף שפופרת 15 מ"ל אותו. השאר את התאים למשך 5 דקות עד spheroids יש משקעים כדי ליצור גלולה רופפת (DO NOT צנטריפוגות). לשאוב supernatant, נזהר לא לקחת שום spheroids.
  3. שוטפים את התאים על ידי הוספת 1 מ"ל PBS. השאר למשך 5 דקות עד spheroids יש משקעים כדי ליצור גלולה רופפת (DO NOT צנטריפוגות). הסר supernatant ולהוסיף 0.5 מ"ל 0.05% טריפסין בתוספת 0.53 mM EDTA. דגירת התאים למשך 4 - 5 דקות ב 37 מעלות צלזיוס.
  4. הסרת תאים מן החממה ולהוסיף 1 מ"ל בינוני hESC. בעזרת פיפטה p1,000, לנתק את התאים לתוך תאים בודדים, לספור את התאים באמצעות Trypan כחול ו hemocytometer. Resuspend 2 × 10 5 viable תאים / מ"ל ​​במדיום מותנה בתוספת 100 ng / ml bFGF ו -10 מיקרומטר ROCK מעכב Y-27632.
  5. העברת 100 מ"ל של תרחיף תאים לתוך הבקבוק bioreactor siliconized עם 1 המטוטלת (ראה סעיף 1.2.5). התחל עם תסיסה 35 סל"ד ואחרי 24 שעות עלייה ל -40 סל"ד.
  6. לאחר 48 שעות, להפסיק תסיסה במשך 5 - 10 דקות עד שכל spheroids התיישב אל החלק התחתון של הבקבוק. החלף חצי בינוני עם בינוני מותנה בתוספת 100 ng / ml bFGF. חזור על אותו התהליך כל 24 שעות עד היום 5.
    הערה: בשלב זה, spheroids מובחן בהיקף ממוצע של 175 ± 25 מיקרומטר צריך להיווצר.
  7. עצור תסיסה במשך 5 - 10 דקות עד שכל spheroids התיישב אל החלק התחתון של הבקבוק. להעביר את כל spheroids לצינור 50 מ"ל ב סכום מינימלי של המדיום (פחות מ -50 מ"ל). לבטל את כל מדיום שנותרו בבקבוק bioreactor, spheroids להבטיח שום בזהירות נשארים הספינה.
  8. Leavדואר עבור 5 - 10 דקות עד שכל spheroids התיישבו בחלק התחתון של הצינור 50 מ"ל מכן הסר בזהירות את supernatant מבלי לשבש את התא גלולה רופף. לשטוף עם 25 מ"ל PBS עם סידן ומגנזיום או בינוני RB, ולאחר מכן לעזוב שוב עבור 5 - 10 דקות עד שכל spheroids התיישבו בחלק התחתון של הצינור 50 מ"ל שוב צורה כדורית משוחרר.
  9. מוציאים בזהירות את supernatant ולהוסיף 40 מ"ל בינוני RB בתוספת 12 מיקרומטר CHIR99021, 10 מיקרומטר מעכב רוק ו -0.1% אלכוהול פולי ויניל (PVA). Resuspend הספרואידים ולהעביר את כל התאים בחזרה אל הבקבוק bioreactor. הוסף בינוני להפוך את הנפח הכולל 100 מ"ל. הפעל מחדש תסיסה ב 40 סל"ד במשך 24 שעות.
    הערה: בינוני RB הוא רגיש לאור. כשעובדים עם המדיום RB לשמור על BSC לאור כיבה מצב.
  10. חזור על שלבים 3.7 - 3.8.
  11. מוציאים בזהירות את supernatant ולהוסיף 40 מ"ל RB בתוספת בינוני עם 0.1% PVA. Resuspend הספרואידים ולהעביר את כל התאים בחזרה tהוא bioreactor בקבוק. הוסף בינוני להפוך את הנפח הכולל 100 מ"ל. הפעל מחדש תסיסה ב 40 סל"ד במשך 24 שעות.
  12. חזור על שלבים 3.7 - 3.8.
  13. מוציאים בזהירות את supernatant ולהוסיף 40 מ"ל בינוני RB בתוספת IWP2, purmorphamine ו SB431542 (5 מיקרומטר אחד). Resuspend הספרואידים ולהעביר את כל התאים בחזרה אל הבקבוק bioreactor. הוסף בינוני להפוך את הנפח הכולל 100 מ"ל. הפעל מחדש תסיסה ב 40 סל"ד במשך 2 ימים.
  14. חזור על שלבים 3.7-3.8.
  15. מוציאים בזהירות את supernatant ולהוסיף 40 מ"ל בינוני RB בלבד. Resuspend הספרואידים ולהעביר את כל התאים בחזרה אל הבקבוק bioreactor. הוסף בינוני להפוך את הנפח הכולל 100 מ"ל. הפעל מחדש תסיסה ב 40 סל"ד. spheroids מכות יש לשים לב 48 - 72 שעות לאחר מכן.
  16. שנה וחצי של המדיום כל 3 - 4 ימים עם מדיום RB רק על ידי עצירת התסיסה במשך 5 - 10 דקות עד שכל spheroids התיישב אל החלק התחתון של כלי השיט. מוציאים בזהירות 50 מ"ל של מדיום מבלי להפריע spheroids ו carefully להחליף עם 50 מ"ל של מדיום RB טריים.

4. דיפרנציאציה של hPSCs בתרביות לא מותאם Passaging תא יחיד

הערה: גישה זו שימושית במיוחד עבור הבידול המהיר של מספר גבוה של קווי hPSC מבלי להסתגל טכניקות culturing תא בודד, תהליך רב עתירת עבודה והזמן מאוד. טכניקה זו ישימה שורות תאים אשר רגישים מאוד תא דיסוציאציה האנזימטית, כגון קווי hPSC אקזיט.

  1. התחל ניסוי עם hPSCs בתרבית על MEF (כמו בסעיף 1.3.2) שהם כ 70 - 80% ומחוברות. הסר את כל מושבות בדיל באמצעות סטראו ב BSC.
  2. סר בינוני ומוסיף 0.5 מיליליטר פתרון דיסוציאציה (DS). דגירת 0.5 - 1 דקות עד תאי MEF מעוגלים מעלה את הקצוות של מושבות hPSCs יתבהרו. להסיר במהירות DS ולהוסיף 0.75 מ"ל IV סוג collagenase (1 מ"ג / מ"ל).
  3. לִדגוֹרהתאים למשך 5 - 15 דקות ב 37 מעלות צלזיוס. בדוק את התאים תחת מיקרוסקופ במהלך תקופת הדגירה, וכאשר מושבות שלמות מתחילים להמריא ולנתק, להסיר collagenase ולהוסיף 1.5 מ"ל בינוני hESC.
    הערה: אם לאחר 15 דקות רוב המושבות עדיין מחוברות, לשים את התאים בחזרה חממה. בדוק את התאים תחת מיקרוסקופ כל 5 דקות. היזהר שלא לעזוב את תאי collagenase במשך יותר מ -30 דקות. אם יש הרבה מושבות צף פתרון collagenase, אינו שולל את collagenase; רק להוסיף 1 מ"ל בינוני hESC.
  4. בעזרת פיפטה p1,000, פיפטה בעדינות מושבות לנתק מושבות כולו. אל תשברו מושבות לחתיכות קטנות. העברת התאים לתוך צינור 15 מ"ל בעזרת פיפטה 5 מ"ל. לשטוף היטב עם המדיום 1 מ"ל hESC לאסוף את כל התאים הנותרים להוסיף הצינור אותו. השאר למשך 5 דקות עד שכל המושבות משקעות (DO NOT צנטריפוגות).
  5. מוציאים בזהירות את supernatant ולהוסיף 2 מ"ל Medi hESCאממ בתוספת 100 ng / ml bFGF. העברת התאים לתוך צלחת מצורף אולטרה-נמוכה באמצעות 5 פיפטה מ"ל (1 מ"ל לבאר כל צלחת 24-היטב 3 מ"ל לבאר כל צלחת 6-היטב). לדגור על 37 ° C / 5% CO 2 עבור 6 שעות (לכל היותר 12 שעות) לפחות.
  6. במהלך תקופה זו, להכין את המספר הדרוש של בארות מצופות laminin / צלחות עבור שלב 4.7. יחסי העברת תא מומלץ הם 1 היטב ומחובר של צלחת 6-היטב 2 בארות צלחת 24 גם (או סכום שווה ערך לכל שטח פנים).
  7. לאחר 6 שעות, להעביר את אגרגטים המושבה בזהירות לתוך צינור 15 מ"ל באמצעות פיפטה 5 מ"ל. לשטוף את הצלחת עם בינוני RB לאסוף כל אגרגטים הנותרים ולהוסיף שפופרת 15 מ"ל זהה (0.5 מ"ל לכל טוב עבור היטב 24 ו 1 מ"ל לכל טוב עבור צלחות 6-היטב). המתן 5 דקות עד המשקע אגרגטים, אז בזהירות לשאוב supernatant. היזהר לא להפריע הגלולה הרופפת.
  8. הוסף 2 מ"ל בינוני RB בתוספת 12 מיקרומטר CHIR99021 ובזהירות להעבירעם פיפטה 5 מ"ל לבארות מוכנה מראש מצופה laminin שלך (כמו בסעיף 1.2.4) כדי לאפשר לתאים לצרף.
  9. לאחר 24 שעות, להסיר בזהירות את המדיום בכל היטב ומוסיפים 1 מ"ל בינוני RB בלבד.
    הערה: החלק מן אגרגטים יהיה מצורף בלבד מאוד חלש לצלחת התרבות; ולכן חשוב לא להסיר כל אגרגטים גדולים שאולי ישתחררו במהלך הליך השינוי הבינוני. חשוב, עם זאת, כדי להסיר כמה שיותר את הפסולת בתא קטן ככל האפשר.
  10. לאחר 24 שעות, להסיר בזהירות את בינונית ומוסיפים בינוני RB בתוספת IWP2, purmorphamine ו SB431542 (5 מיקרומטר אחד).
  11. שינוי המדיום לאחר 2 ימים עם מדיום RB בלבד. תאים יתחילו להכות למחרת.
  12. שינוי המדיום כל 3 - 4 ימים עם מדיום RB בלבד.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

כדי לבסס שיטה פשוטה עבור הבידול בקנה המידה הגדולה של cardiomyocytes מ hPSCs, יצרנו פרוטוקול שבו תאים טופלו בתחילה עם מפעיל Wnt / β-קטנין (CHIR99021) 16 ולאחר מכן עם מעכבים של Wnt / β- catenin ו-β גורם הגדילה הפיכת (TGF-β) מסלולים (IWP2 16 ו SB431542 17, בהתאמה) ולבסוף מפעיל של סוניק הקיפוד (ששש) מסלול (purmorphamine) 17 (איור 1 א). באסטרטגית הבידול שלנו, כ -50% של spheroids (175 ± 25 מיקר...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

Cardiomyocytes נגזר hPSCs הם מקור אטרקטיבי מאוד לשימוש דוגמנות מחלות אנושית, בדיקות הקרנת סמים / רעיל, אולי בעתיד, טיפולים רגנרטיבית. אחד המכשולים העיקריים באמצעות תאים אלה עם זאת, הוא היכולת לספק חומר באיכות גבוהה מספיק עבור השימוש היעיל שלהם. שימוש בפרוטוקול תיאר שלנו, אנו מציעים שיטה מתגבר על מגבלה זו.

לאחרונה, מולקולות קטנות סינטטיות מיקוד מסלולי איתות ספציפי המעורבים cardiogenesis תוארו כדי לשפר 16,17,2...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

המכון לחקר לב ויקטור צ'אנג אינו עוסק, ואינו מוותר, ההרס של עוברים אנושיים למחקר. תרומתה למחקר זה היה מוגבל לעבוד על תאי גזע מושרים אנושיים.

החוקרים מצהירים שאין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.

תודות

מחקר זה מומן על ידי מענקים שניתנו ממכון רויאן, המועצה האיראנית למחקר וטכנולוגיה של תאי גזע, הקרן הלאומית למדע של איראן (INSF), המועצה הלאומית לבריאות ומחקר רפואי של אוסטרליה (NHMRC; 354400), קרן הלב הלאומית של אוסטרליה/Heart Kids Australia (G11S5629) ורשת המחקר הקרדיווסקולרי של ניו סאות' ויילס. HF נתמך על ידי מלגה בינלאומית לתואר שני של האוניברסיטה מאוניברסיטת ניו סאות' ויילס, אוסטרליה. RPH נתמך על ידי מלגת NHMRC אוסטרליה. המחברים מביעים את תודתם לנבדקים האנושיים שהשתתפו במחקר זה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
Knockout DMEMLife Technologies10829018
החלפת סרום נוקאאוט (KO-SR)Life Technologies10828028
GlutamaxLife Technologies35050061
MEM חומצות אמינו לא חיוניותLife Technologies11140-050
β-MercaptoethanolLife Technologies21985-023
גורם גדילה פיברובלסטי בסיסי (bFGF)Miltenyi Biotec130-093-843
RPMI1640Life Technologies11875093
DPBS, ללא סידן, ללא מגנזיוםLife Technologies14190144
DPBSLife Technologies14287072
Attachment Factor (AF)Life TechnologiesS006100
ECM ג'לסיגמא-אולדריץ'E1270
למיניןInvitrogen23017-015
DMEMLife Technologies11965-092                                                                                                                                                                                                             
סרום בקר קטלני (FBS)Life Technologies16140-071
B27 מינוס אינסוליןGibcoA18956-01
פניצילין/סטרפטומיציןLife Technologies15070063
0.05% טריפסין/EDTALife Technologies25300-054
קולגנאז סוג IVLife Technologies17140-019
סידן כלורי (CaCl2)Sigma-AldrichC7902
Mitomycin CBioaustralisBIA-M1183
CHIR99021Miltenyi Biotec130-104-172
IWP2Miltenyi Biotec130-105-335
SB431542Miltenyi Biotec130-095-561
PurmorphamineMiltenyi Biotec130-104-465
מעכב ROCK Y-27632Miltenyi Biotec130-104-169
חומצה אתילנדיאמינטטראצטית (EDTA)Sigma-AldrichE6758
פולי ויניל אלכוהול (PVA)סיגמא-אולדריץ'363073
ג'לטיןסיגמא-אולדריץ'G1890
טריפן כחולביו-ראד145-0013
אקומקס טכנולוגיות תא חדשניות בע"מAM105
סיגמקוט סיגמא-אולדריץ'SL2 
CELLSPINIntegra Biosciences183 001
בקבוק ספינר עם מטוטלת אחת, 100 מ"ל Integra Biosciences182 023
פיברובלסטים עובריים של עכברים (MEF)מוכנים בבית (או זמינים מסחרית)
קווי תאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים (hPSC)מוכנים בבית (או זמינים מסחרית)

מקורות

  1. Thomson, J. A., et al. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282, 1145-1147 (1998).
  2. Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131, 861-872 (2007).
  3. Carvajal-Vergara, X., et al. Patient-specific induced pluripotent stem-cell-derived models of LEOPARD syndrome. Nature. 465, 808-812 (2010).
  4. Vitale, A. M., Wolvetang, E., Mackay-Sim, A. Induced pluripotent stem cells: a new technology to study human diseases. Int. J. Biochem. Cell Biol. 43, 843-846 (2011).
  5. Sharma, A., et al. Human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes as an in vitro model for coxsackievirus B3-induced myocarditis and antiviral drug screening platform. Circ Res. 115, 556-566 (2014).
  6. Zimmer, B., et al. Evaluation of developmental toxicants and signaling pathways in a functional test based on the migration of human neural crest cells. Environ Health Perspect. 120, 1116-1122 (2012).
  7. Diecke, S., Jung, S. M., Lee, J., Ju, J. H. Recent technological updates and clinical applications of induced pluripotent stem cells. Korean J Intern Med. 29, 547-557 (2014).
  8. Kimbrel, E. A., Lanza, R. Current status of pluripotent stem cells: moving the first therapies to the clinic. Nat. Rev. Drug Discov. 14, 681-692 (2015).
  9. Kehat, I., et al. Human embryonic stem cells can differentiate into myocytes with structural and functional properties of cardiomyocytes. J Clin Invest. 108, 407-414 (2001).
  10. Mummery, C., et al. Differentiation of human embryonic stem cells to cardiomyocytes: role of coculture with visceral endoderm-like cells. Circulation. 107, 2733-2740 (2003).
  11. Laflamme, M. A., et al. Cardiomyocytes derived from human embryonic stem cells in pro-survival factors enhance function of infarcted rat hearts. Nat Biotechnol. 25, 1015-1024 (2007).
  12. Fonoudi, H., et al. ISL1 protein transduction promotes cardiomyocyte differentiation from human embryonic stem cells. PLoS One. 8, e55577(2013).
  13. Zhu, W. Z., Hauch, K. D., Xu, C., Laflamme, M. A. Human embryonic stem cells and cardiac repair. Transplant Rev (Orlando). 23, 53-68 (2009).
  14. Jozefczuk, J., Drews, K., Adjaye, J. Preparation of mouse embryonic fibroblast cells suitable for culturing human embryonic and induced pluripotent stem cells. J Vis Exp. (64), e3854(2012).
  15. Stover, A. E., Schwartz, P. H. Adaptation of human pluripotent stem cells to feeder-free conditions in chemically defined medium with enzymatic single-cell passaging. Methods Mol Biol. 767, 137-146 (2011).
  16. Lian, X., et al. Robust cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells via temporal modulation of canonical Wnt signaling. Proc Natl Acad Sci. 109, E1848-E1857 (2012).
  17. Gonzalez, R., Lee, J. W., Schultz, P. G. Stepwise chemically induced cardiomyocyte specification of human embryonic stem cells. Angew Chem Int Ed Engl. 50, 11181-11185 (2011).
  18. Fonoudi, H., et al. A Universal and Robust Integrated Platform for the Scalable Production of Human Cardiomyocytes From Pluripotent Stem Cells. Stem Cells Transl Med. , (2015).
  19. Abbasalizadeh, S., Larijani, M. R., Samadian, A., Baharvand, H. Bioprocess development for mass production of size-controlled human pluripotent stem cell aggregates in stirred suspension bioreactor. Tissue Eng Part C Methods. 18, 831-851 (2012).
  20. Larijani, M. R., et al. Long-term maintenance of undifferentiated human embryonic and induced pluripotent stem cells in suspension. Stem Cells Devt. 20, 1911-1923 (2011).
  21. Baharvand, H., Larijani, M. R., Yousefi, M. Protocol for expansion of undifferentiated human embryonic and pluripotent stem cells in suspension. Methods Mol Biol. 873, 217-226 (2012).
  22. Burridge, P. W., et al. Chemically defined generation of human cardiomyocytes. Nat Methods. 11, 855-860 (2014).
  23. Minami, I., et al. A small molecule that promotes cardiac differentiation of human pluripotent stem cells under defined, cytokine- and xeno-free conditions. Cell reports. 2, 1448-1460 (2012).
  24. Buskirk, A. R., Liu, D. R. Creating small-molecule-dependent switches to modulate biological functions. Chem Bio. 12, 151-161 (2005).
  25. McKinsey, T. A., Kass, D. A. Small-molecule therapies for cardiac hypertrophy: moving beneath the cell surface. Nat Rev Drug Discov. 6, 617-635 (2007).
  26. Niebruegge, S., et al. Generation of human embryonic stem cell-derived mesoderm and cardiac cells using size-specified aggregates in an oxygen-controlled bioreactor. Biotechnol Bioeng. 102, 493-507 (2009).
  27. Bauwens, C. L., et al. Geometric control of cardiomyogenic induction in human pluripotent stem cells. Tissue Eng Part A. 17, 1901-1909 (2011).
  28. Hwang, Y. S., et al. Microwell-mediated control of embryoid body size regulates embryonic stem cell fate via differential expression of WNT5a and WNT11. Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 16978-16983 (2009).
  29. Nguyen, D. C., et al. Microscale generation of cardiospheres promotes robust enrichment of cardiomyocytes derived from human pluripotent stem cells. Stem Cell Reports. 3, 260-268 (2014).
  30. Kempf, H., et al. Controlling expansion and cardiomyogenic differentiation of human pluripotent stem cells in scalable suspension culture. Stem Cell Reports. 3, 1132-1146 (2014).
  31. Hemmi, N., et al. A massive suspension culture system with metabolic purification for human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Stem Cells Transl Med. 3, 1473-1483 (2014).
  32. Tohyama, S., et al. Distinct metabolic flow enables large-scale purification of mouse and human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Cell stem cell. 12, 127-137 (2013).
  33. Nunes, S. S., et al. Biowire: a platform for maturation of human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Nat meth. 10, 781-787 (2013).
  34. Devalla, H. D., et al. Atrial-like cardiomyocytes from human pluripotent stem cells are a robust preclinical model for assessing atrial-selective pharmacology. EMBO Mol Med. 7, 394-410 (2015).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

Cardiomyocyte DifferentiationWNT TGF betaThPSC

מאמרים קשורים