מאמר שיטה

RNA הפרעה מבוססת חקירת הפונקציה של חלבון מחממי הלם 27 במהלך הקרנית אפיתל לריפוי פצעים

DOI:

10.3791/54280

⸱

27 בספטמבר 2016

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Ophthalmology, Saevit Eye Hospital, 2Department of Ophthalmology, University of Ulsan College of Medicine, Asan Medical Center

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לשימוש ב-RNA מפריע קטן ספציפי לחלבון הלם חום 27 (HSP27) כדי להעריך את תפקודו של HSP27 במהלך ריפוי פצעי אפיתל בקרנית. הפרעות RNA הן השיטה הטובה ביותר להפיל ביעילות ביטוי גנים כדי לחקור את תפקוד החלבון בסוגי תאים שונים.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

RNA מפריע קטן (siRNA) הוא בין שיטות הפרעות ה-RNA הנפוצות ביותר להשתקה לטווח קצר של גנים מקודדי חלבון. siRNA הוא דופלקס RNA סינתטי שנוצר כדי למקד באופן ספציפי תעתיק mRNA כדי לגרום לפירוקו והוא שימש לזיהוי מסלולים חדשים בתהליכים תאיים שונים. קיימים מעט דיווחים לגבי תפקידו של חלבון הלם חום זרחני 27 (HSP27) בריפוי פצעי אפיתל בקרנית. כאן, תאי אפיתל קרנית אנושיים מתורבתים חולקו לקבוצה מקושקשת של siRNA וקבוצה שעברה טרנספטציה של siRNA ספציפית ל-HSP27. לאחר מכן בוצעו בדיקות פציעה כיווניות הנגרמות על ידי שריטות, וכתמים מערביים וזרימה ציטומטרית. אנו מסיקים כי ל-HSP27 יש תפקידים בריפוי פצעי אפיתל בקרנית שעשויים לכלול אפופטוזיס ונדידה של תאי אפיתל. כאן ניתנים תיאורים שלב אחר שלב של הכנת הדגימה ופרוטוקול המחקר.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

תאי אפיתל קרניים (CECs) הם לשפוך ברציפות לתוך שכבת דמעות, בזמן שהם מוחלפים בו זמנית על ידי תאים מן לימבוס ושכבות הבזליים אפיתל קרניים. 1 לחצים חיצוניים שונים יכולים לגרום אפופטוזיס קלוף של CECs. 2 חלבוני הלם החום (HSPs) שמורים מאוד ניתן לחלק לשתי משפחות לפי גודל מולקולרי. 3 מש' HSP הגדולה כולל Hsp90, HSP70, ו HSP60, והמשפחה הקטנה כולל HSP27. 4 זירחון של HSP27 ידוע לשחק תפקיד חשוב בהישרדות תא והוא נחוץ לצורך נדידת תאים עקב התפקיד של חלבון זה שיפוץ יקטין. 5-7 לכן, ניסינו לבחון את התפקיד הפוטנציאלי של זירחון HSP27 גירת CEC ו אפופטוזיס מודל במבחנה של ריפוי פצע אפיתל.

התערבות RNA (RNAi) באף אחת קטנה או קצר RNAs התערבות (siRNA) יש geעניין nerated בשתי ביולוגיה בסיסית ויישומים, כפי שהוא עשוי לאפשר את הביטוי של כל גן של עניין להיות דפק למטה. 8 בזאת, השתמשנו siRNA ספציפי-HSP27 להעריך את התרומה של HSP27 לריפוי אפופטוזיס פצע CEC. שיטות RNAi מסורתית עבור הגן לדפוק למטה בתאים להשתמש דופלקסים RNA סינתטיים, לרבות שני oligonucleotides 21-mer ללא שינוי, אשר ניתן לקבץ ליצור siRNAs. RNAi siRNA כי השתמשנו במחקר הנוכחי הוא שיטה פשוטה ויעילה מאוד transfect תאים, מגיב זה עובד עם שורות תאים הנציחו שונות. במחקר הנוכחי, אנחנו מדגימים את השיטות בהן השתמשו בניתוח זה, כולל assay הפצע כיוונית הנגרמת מאפס, סופג המערבי, assay transfection siRNA, assay immunofluorescence, cytometry הזרימה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

שורת תאים 1.

  1. תרבות 10 6 תאים אפיתל הקרנית אדם הנציח טלומרז (HCECs) בצלחת 6-היטב (צפיפות: 1039.9 תא / מ"מ 2) בתוך 37 ° C חממה עם אווירה 5% CO 2 באמצעות מדיום הגידול האפיתל הסימפונות (BEGM) עד הם מגיעים למפגש 95%.

2. ניתוח כתם המערבי לאחר יצירת פצעים Scratch אפיתל

  1. Streak קצה פיפטה 200 μl סטרילי על פני באר HCECs תרבותי ומחוברות ארבע פעמים לכל צלחת בארון בטיחות ביולוגית (Class II, A2 סוג) דגירה HCECs בנפרד 37 ° C חממה עם אווירה 5% CO 2 עבור 1, 5, 10, 30, 60, ו -120 דקות.
  2. השתמש צלחת אחת 6-היטב מזה שישה מדגמים שונים בהתאם לזמן הדגירה לאחר פציעת אפיתל קרנית.
  3. לשטוף monolayers HCEC נפצע שלוש פעמים עם 1x PBS ולאחר מכן להוסיף 2.0 מ"ל BEGM היטב כל אחד.
  4. ניתוק HCECs באמצעות 2מ"ל 0.25% טריפסין-ethylenediaminetetraacetic חומצה (EDTA) לכל היטב במשך 5 דקות, צנטריפוגות ב 900 XG במשך 5 דקות בתוך שפופרת 15 מ"ל, ואת לשאוב טריפסין-EDTA בעזרת פיפטה 1 מ"ל.
  5. להשעות HCECs עם 1 מ"ל 1x PBS ולהעבירם צינור 1.5 מ"ל.
  6. HCECs צנטריפוגה ב XG 10,000 במשך 15 שניות ו PBS 1x לשאוב בעזרת פיפטה 1 מ"ל.
  7. Resuspend HCECs ב 100 חיץ μl קרים כקרח תמוגה (10 מ"מ טריס, 10 mM NaCl, 2 מ"מ EDTA, 25 מ"מ NaF, 2 מ"מ Na 3 VO 4, 1 מ"מ פלואוריד phenylmethanesulfonyl [PMSF], מעכבי פרוטאז [1 מיקרומטר pepstatin A, 1 מיקרומטר leupeptin, ו -0.1 מיקרומטר aprotinin] ו -0.5% Triton X-100 [pH 7]) ומערבבים אותם היטב.
  8. דגירה תאים עבור 30 דקות על הקרח כדי לגרום תמוגה התא.
  9. lysates צנטריפוגה ב 4 ° C. ב XG 10,000 במשך 15 דקות, ולאחר מכן להעביר supernatants 1.5 מ"ל צינורות טרי (90 aliquots μl) ולאחסן אותם ב -80 מעלות צלזיוס.
  10. לקבוע ריכוזי חלבון סך של lysates התא באמצעות יחסי ציבור ברדפורדassay otein. 9
  11. חלבונים הכולל תא טען 30 מיקרוגרם לג'ל acrylamide 10% או 12% עבור ג'ל אלקטרופורזה סולפט-polyacrylamide dodecyl נתרן (SDS-PAGE), ולאחר מכן electrophoretically העברת מופרדים להקות חלבון מסנני nitrocellulose עם זרם 200 מיליאמפר עבור שעה 1 ב 4 ° C להשתמש מבחני כתם מערביים.
  12. ממברנות מסנן nitrocellulose בלוק עם 5% חלב רזה מלוחים טריס שנאגרו עם Tween 20 (TBST) במשך שעה 1, להוסיף נוגדנים polyclonal ארנב העיקרי נגד HSP27 הלא פוספורילציה (1: 1,000 דילול) או נוגדנים polyclonal ארנב העיקרי נגד HSP27 פוספורילציה (1 דילול 1,000) ב אלבומין 5% שור (BSA), ו דגירה ממברנות לילה ב 4 ° C על שייקר:.
  13. זיהוי להקות immunoreactive באמצעות נוגדנים נגד ארנב peroxidase מצומדות חזרת עיזים (1: 10,000 דילול) ב 5% BSA לאחר הכביסה במשך 10 דקות 3 פעמים עם TBST.
  14. דגירה הממברנה של ריאגנטים לומינול המערבי סופג (6-7 מ 'l לכל 10 ס"מ × קרום 5 ס"מ) עבור 1 דקות בטמפרטורת החדר.
  15. הסר את הקרום מפתרון מגיב, להסיר נוזל עודף עם מגבה סופגת, ומניח מגן יריעת פלסטיק.
  16. עבודה בחדר חשוך עם אור בטוח, להציב קרום מכוסה קלטת סרט עם צד חלבון הפונה כלפי מעלה.
  17. מניחים הסרט X-ray על גבי הממברנה ולחשוף דקות 1.

3. siRNA Transfection Assay 10

  1. HCECs תרבות ב 5 × 10 5 תאים / גם בצלחת 6-היטב בתוך 37 ° C חממה עם אווירה 5% CO 2 באמצעות BEGM עד שהם מגיעים למפגש 95%.
  2. לדלל את מגיב transfection (2.5 או 7.5 μl) עם 100 μl בינוני סרום מופחת עבור transfection (גורם לדילול היה 41 או 14.3) ו לפזר את HSP27 הספציפי מקושקש השליטה siRNA ב 100 μl בינוני סרום מופחת ליצור 10 או 50 ננומטר של HSP27 ספציפי מקושקש siRNA שליטה.
  3. מערבבים 100 μ; פתרון siRNA l עם מגיב transfection 100 μl מדולל (1: 1 יחס) דגירה את התערובת במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר.
  4. מוסיפים את מתחמי השומנים-siRNA לתאים. אז אחרי 4 תקשורת hr שינוי להשלים BEGM דגירת התאים למשך 2 ימים ב 37 מעלות צלזיוס.
  5. לנתח תאי transfected על ידי מערבי סופג, כמתואר מ בסעיפים 4.1 ל -4.7 ילדים.

4. Assay כתם המערבי עבור תאים-טרנספקציה siRNA 11

  1. חלץ HSP27 ספציפיים מקושקשות HCECs שליטה transfected-siRNA בתוך ארון בטיחות ביולוגית באמצעות 100 חיץ תמוגה μl קרים כקרח (10 טריס מ"מ, 10 מ"מ NaCl, 2 מ"מ חומצה ethylenediaminetetraacetic (EDTA), 25 מ"מ NaF, 2 מ"מ Na 3 VO 4, 1 מ"מ פלואוריד phenylmethanesulfonyl (PMSF), מעכבי פרוטאז, ו -0.5% Triton X-100, pH 7).
  2. דגירה תאים עבור 30 דקות על הקרח כדי לגרום תמוגה התא.
  3. lysates גלולה ב XG 10,000 במשך 15 דקות ולאחר מכן להעביר supernatants אל גיגית 1.5 מיליליטר טריes (90 μl aliquots) ולאחסן אותם ב -80 ° C.
  4. לקבוע ריכוזי חלבון של התא lysates באמצעות השיטה ברדפורד. 9
  5. דגימות טענו עם כמויות שווות של חלבוני תא הכוללים על ג'ל acrylamide 10% או 12%, לייחד את הג'ל על SDS-PAGE, ו electrophoretically להעביר את להקות חלבון המופרדות כדי מסנני nitrocellulose עם זרם 200 מיליאמפר עבור שעה 1 ב 4 ° C עד להשתמש מבחני כתם מערביים.
  6. ממברנות nitrocellulose מסנן בלוק עם 5% חלב רזה מלוחים טריס שנאגרו עם Tween 20 (TBST) במשך שעה 1, להוסיף נוגדנים ראשוניים נגד HSP27 פוספורילציה הלא פוספורילציה (1: 1,000 דילול), Akt פוספורילציה (1: 1,000 דילול) הלא פוספורילציה Akt (1: 1,000 דילול, לשמש כסמן הישרדות התא), Bcl-2 הקשורים חלבון X (1: 1,000 דילול, משמש חלבון פרו-אפופטוטיים), ו dehydrogenase 3-פוספט glyceraldehyde (GAPDH; 1 : דילול 200, משמש כביקורת טעינה) ב אלבומין 5% שור (BSA), ודגירת ממברנות הלילה ב 4 ° C על שייקר.
  7. זיהוי להקות immunoreactive באמצעות נוגדנים נגד ארנב peroxidase מצומדות חזרת עיזים (1: 10,000 דילול) BSA 5% לאחר הכביסה 3 פעמים עם TBST, 10 דקות כל אחד לשטוף.
  8. דגירה הממברנה של ריאגנטים לומינול המערבי סופג (6-7 מ"ל לכל 10 ס"מ × 5 ס"מ קרום) עבור 1 דקות בטמפרטורת החדר.
  9. הסר את הקרום מפתרון מגיב, להסיר נוזל עודף עם מגבה סופגת, ומניח מגן יריעת פלסטיק.
  10. עבודה בחדר חשוך עם אור בטוח, מניח את הקרום המכוסה קלטת סרט עם צד החלבון הפונה כלפי מעלה.
  11. מניח סרט X-ray על גבי הקרום ולחשוף דקות 1.

5. נגרמת Scratch ערכת Assay פציעה כיוונית של נדידת תאי 12

  1. בארון בטיחות ביולוגית, להפוך פצע ידי גרירת קצה פיפטה סטרילית על פני באר תרבויות ומחוברות שלHSP27 ספציפי-טרנספקציה siRNA או HCECs המלא המקושקש טרנספקציה-siRNA.
  2. מיד לאחר פציעה, לשטוף את התאים פעמיים עם בופר פוספט 1x (PBS) ולשמור אותם בתרבויות BEGM באינקובטור 37 מעלות צלזיוס עם אווירה 5% CO 2 למשך 24 שעות לאחר פציעה.
  3. לצלם תמונות HCEC באמצעות מיקרוסקופ זקוף בהגדלה 100X 24 שעות לאחר ופצע ולבצע משטחת רקע באמצעות מסנן פקודת תוכנת ניתוח תמונה.
  4. באמצעות פקודת המדידות בוחרות, להגדיר השטח של עניין (AOI) עם אותה הצורה מצולע בגודל שיכול לכסות בניצב מקצה לקצה של פצע ראשוני, ולקבוע שלושה AOI שונים באזור הפצוע של כל דגימה.
  5. באופן אוטומטי לספור את המספר הסלולרי בכל תחום באמצעות אפשרויות תפריט מדוד רוזן / גודל.

6. ניתוח cytometry זרימה של אפופטוזיס

  1. תרבות siRNA-טרנספקציה HSP27 ספציפי ובקרה שלאירנ"א-טרנספקציה HCECs המכילים כל 10 ננומטר siRNA בריכוז של 5 × 10 5 תאים / גם ב 6 צלחות היטב עד התאים מגיעים 95 מפגש% בתוך 37 ° C חממה עם אווירה 5% CO 2 ב BEGM.
  2. ניתוק HCECs באמצעות 2 מ"ל 0.25% טריפסין-EDTA לכל טוב במשך 5 דקות, צנטריפוגות ב 900 XG במשך 5 דקות בתוך שפופרת 15 מ"ל, ואת לשאוב טריפסין-EDTA בעזרת פיפטה 1 מ"ל.
  3. שטפו תאים פעמיים עם קר PBS ולאחר מכן resuspend התאים 1x חיץ מחייב (0.1 M HEPES / NaOH [pH 7.4], 1.4 M NaCl, ו -25 מ"מ CaCl 2) בריכוז של 10 6 תאים / מ"ל.
  4. העברת 100 μl ההשעיה תא (1 x 10 5 תאים) לתוך צינור תרבות 5 מ"ל.
  5. הוסף 5 μl והעמסת מצומדות isothiocyanate V Annexin ו יודיד propidium 5 μl.
  6. בעדינות מערבולת התאים דגירה אותם במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר בחושך.
  7. הוסף 200 μl של חיץ מחייב 1x על צינור אחד ולנתח את התאים על ידי ג זרימהytometer בתוך שעה 1.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הביטוי של HSP27 פוספורילציה גדל באופן משמעותי ב 5, 10, ו -30 דקות לאחר שריטה ופצע לעומת HCECs unwounded 13. ניתוח כתם המערבי גילה כי הביטוי של פוספורילציה HSP27 ו פוספורילציה Akt הופחתו הן באופן משמעותי, ואילו הביטוי של Bax הוגדל משמעותית HCECs-טרנספקציה siRNA ספציפיים-HSP27 (איור 1 א-ה). הביטוי HSP27 פוספורילציה הופחת ב -30% ו -40% ב 10 ננומטר ו -50 ננומטר של HSP27 ספציפי בתאי-טרנספקציה siRNA, בהתאמה, לעומת תאי-טרנספקצי...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

במחקר הנוכחי הערכנו את התפקיד הפוטנציאלי של HSP27 בפציעה אפיתל בקרנית באמצעות גישות מבחנה . השלבים הקריטיים כללו טרנספקציה של siRNA עבור נוק-דאון HSP27 כדי לצפות בתפקוד של HSP27 בתאים הנתונים ללחץ. יש לציין כי תפקידו של HSP27 התגלה בניסויים אלה בנדידת תאי אפיתל ואפופטוזיס במהלך ריפוי פצעי אפיתל בקרנית. בניגוד למחקרים קודמים10 שהשתמשו ב-siRNA ספציפי ל-HSP27 של חולדות כדי להעביר תאי שריר חלק בכלי הדם, השתמשנו בטכניקת טרנספקציה של siRNA כדי לשנות את ביטוי הגנים ב-CECs אנושיים כדי להפיל ביעילות ביטוי גנים...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

יש המחברים שום אינטרסים כלכליים או קניינים כל חומר או שיטות שהוזכר במחקר זה.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מחקר זה נתמך על ידי מענק מחקר סטודנטים (13-14) של אוניברסיטת אולסן המכללה לרפואה, בסיאול, קוריאה ומענק (2014-464) ממכון אסאן למדעי החיים, בסיאול, קוריאה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
ארון בטיחות ביולוגיCHC LAB ושות' בע"מ,  דאג'און, הרפובליקה של קוריאה CHC-777A2-06מחלקה II, סוג A2 
RNAi&trade חמקן; siRNAThermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MARNAi siRNA; בקרה-siRNA מקושקשת ו-siRNA ספציפי ל-HSP27
BEGMTMLonza, Inc., Walkersville, MDCC-3171, CC4175מדיום גידול אפיתל הסימפונות 
מעכב פרוטאז סיגמא-אולדריץ', בע"מ, סנט לואיס, מיזוריP8340, P76261 & #956; M פפסטאטין A, 1 & #956; M Leupepettin, 0.1 μ M בדיקת חלבון אפרוטינין
ברדפורד מעבדות ביו-ראד, הרקולס, קליפורניה#500-0001בדיקת חלבון ברדפורד 
מסנני ניטרוצלולוזה אמרשם, ליטל צ'לפונט, בריטניהRPN3032Dקרום הכתם המערבי
HSP27 Abcam Inc., קיימברידג', MAab123511:1,000 דילול (סה"כ HSP27)
HSP27 זרחני (Ser85)Abcam Inc., קיימברידג', MAab5594דילול 1:1,000 HSP27 היה זרחני ב-Ser85
Lipofectamine® RNAiMAX reagent Invitrogen, Carlsbad, CA13-778-075מגיב טרנספקציה
Phosphorylated Akt (Ser473)טכנולוגיית איתות תאים, דנברס, MAמס' 40601:1,000 דילול Akt היה זרחן ב-Ser473 (סמן הישרדות תאים)
Akt  לא זרחני;טכנולוגיית איתות תאים, דנברס, MAמס' 4061דילול 1:1,000 (Total Akt)
חלבון X הקשור ל-Bcl-2 טכנולוגיית איתות תאים, דנברס, MAמס' 40621:1,000 (סמן חלבון אנטי-אפופטוטי)
GAPDHסנטה קרוז ביוטכנולוגיה, סנטה קרוז, קליפורניהמס' 40631:1,000 סמן בקרת העמסה (גן לשמירת בית)
חזרת פרוקסידאז מצומד נוגדנים נגד ארנבThermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MANCI1460KR1:10,000 דילול
OPTI-MEMInvitrogen, קרלסבד, קליפורניה31985מדיום סרום מופחת לטרנספקציה
תוכנה לניתוח תמונותOlympus, Inc., טוקיו, יפןImage-Pro Plus 5.0
אבקת חלב דל שומן Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlstruhe, גרמניהT145.2
Tris אמרסקו LCC, בע"מ סולון, אוהיומס' 0497
נתרן כלורי Amresco LCC, Inc. Solon, OHNo-0241
צלחת תרבית שש בארותThermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA140675 קוטר 35.00 מ"מ /
באר צלחת 24 בארותThermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA142475
שייקר אורביטליN-Bioteck, Inc., סיאול, דרום קוריאהNB1015
אלבומין סרום בקרסנטה קרוז ביוטכנולוגיהסנטה קרוז, קליפורניהsc-2323 
BDFACSCantoTM IIBD Biosciences, פרנקלין לייקס, ניו ג'רזיציטומטריית זרימה
ציטומטריית רנטגן סרט רנטגןקודאק, רוצ'סטר, ניו יורקקלטת רנטגן רפואית עם מסך ירוק 400 
ריאגנט לומינול ווסטרן בלוטינגסנטה קרוז ביוטכנולוגיה, סנטה קרוז, קליפורניהSC-2048 
ערכת זיהוי אפופטוזיס FITC Annexin V IBD Biosciences, פרנקלין לייקס, ניו ג'רזי556547
,

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Dua, H. S., Gomes, J. A., Singh, A. Corneal epithelial wound healing. Br. J. Ophthalmol. 78 (5), 401-408 (1994).
  2. Estil, S., Primo, E. J., Wilson, G. Apoptosis in shed human corneal cells. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 41 (11), 3360-3364 (2000).
  3. Guay, J., et al. Regulation of actin filament dynamics by p38 map kinase-mediated phosphorylation of heat shock protein 27. J. cell. Sci. 110, Pt 3 357-368 (1997).
  4. Park, J. W., et al. Differential expression of heat shock protein mRNAs under in vivo glutathione depletion in the mouse retina. Neurosci. Lett. 413 (3), 260-264 (2007).
  5. Rane, M. J., et al. Heat shock protein 27 controls apoptosis by regulating Akt activation. J. Biol. Chem. 278 (30), 27828-27835 (2003).
  6. Shin, K. D., et al. Blocking tumor cell migration and invasion with biphenyl isoxazole derivative KRIBB3, a synthetic molecule that inhibits Hsp27 phosphorylation. J. Biol. Chem. 280 (50), 41439-41448 (2005).
  7. Jain, S., et al. Expression of phosphorylated heat shock protein 27 during corneal epithelial wound healing. Cornea. 31 (7), 820-827 (2012).
  8. Alekseev, O. M., Richardson, R. T., Alekseev, O., O'Rand, M. G. Analysis of gene expression profiles in HeLa cells in response to overexpression or siRNA-mediated depletion of NASP. Reprod. Biol. Endocrinol. 7, 45(2009).
  9. Park, H. Y., Kim, J. H., Lee, K. M., Park, C. K. Effect of prostaglandin analogues on tear proteomics and expression of cytokines and matrix metalloproteinases in the conjunctiva and corea. Exp. Eye. Res. 94 (1), 13-21 (2012).
  10. Voegeli, T. S., Currie, R. W. siRNA knocks down Hsp27 and increases angiotensin II-induced phosphorylated NF-kappaB p65 levels in aortic smooth muscle cells. Inflamm. Res. 58 (6), 336-343 (2009).
  11. Shi, B., Isseroff, R. R. Arsenite pre-conditioning reduces UVB-induced apoptosis in corneal epithelial cells through the anti-apoptotic activity of 27 kDa heat shock protein (HSP27). J. Cell. Physiol. 206 (2), 301-308 (2006).
  12. Shen, E. P., et al. Comparison of corneal epitheliotrophic capacity among different human blood-derived preparations. Cornea. 30 (2), 208-214 (2011).
  13. Song, I. S., et al. Heat shock protein 27 phosphorylation is involved in epithelial cell apoptosis as well as epithelial migration during corneal epithelial wound healing. Exp Eye Res. 118 (1), 36-41 (2014).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

siRNAWestern BlotScratch Wound AssayBradfordSDS PAGE

מאמרים קשורים