Method Article

הנדסה תלת מימדי רקמות אפיתל Embedded בתוך מטריקס

DOI:

10.3791/54283

⸱

July 10th, 2016

 , 
1Chemical and Biological Engineering, Princeton University, 2Molecular Biology, Princeton University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כתב יד זה מתאר טכניקה רכה המבוסס ליתוגרפיה להנדס מערכים אחידים של תלת ממדי (3D) רקמות אפיתל של גיאומטריה מוגדרת מוקפות תאי מטריקס. שיטה זו ניתנת למגוון רחב של סוגי תאים והקשרים ניסיוניים מאפשרת הקרנת תפוקה גבוהה של משכפל זהה.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הארכיטקטורה של איברים מסועפים כמו הריאות, הכליות ובלוטות החלב נוצרת באמצעות תהליך התפתחותי של מורפוגנזה מסועפת, המווסתת על ידי מגוון אותות מסיסים ופיזיים במיקרו-סביבה. מתוארת כאן שיטה שנוצרה כדי לחקור את תהליך הסתעפות המורפוגנזה על ידי יצירת רקמות אפיתל תלת מימדיות מהונדסות (3D) בעלות צורה וגודל מוגדרים המשובצות לחלוטין בתוך מטריצה חוץ-תאית (ECM). שיטה זו מאפשרת יצירת מערכים של רקמות זהות ומאפשרת בקרה על מגוון גורמים סביבתיים, כולל גיאומטריית רקמות, מרווחים והרכב ECM. ניתן לשלב שיטה זו גם עם טכניקות בשימוש נרחב כגון מיקרוסקופ כוח משיכה (TFM) כדי לקבל מידע נוסף על האינטראקציות בין תאים ל-ECM הסובב אותם. ניתן להשתמש בפרוטוקול כדי לחקור מגוון תהליכי תאים ורקמות מעבר למורפוגנזה מסועפת, כולל פלישת סרטן.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ההתפתחות של רקמות אפיתל מסועפות, המכונות הסתעפות morphogenesis, מוסדרת על ידי נגזר תאים, פיסיים, וגורמים סביבתיים. בלוטת החלב, הסתעפות morphogenesis הוא תהליך חוזר ונשנה שדרכו מודרך נדידת תאים קולקטיבית יוצרת אדריכלות עץ דמוי. השלב הראשון הוא היווצרות ניצן ראשית ממנהל צינוריות החלב, ואחריו ייזום סניף ואת התארכות 1,2. פלישה של סניפים לתוך stroma שמסביב היא מושרה על ידי השחרור המערכתי של הורמוני סטרואידים בגיל ההתבגרות. ניצנים ראשוניים חדשים ולאחר מכן ליזום מקצות סניפים קיימים, ותהליך זה ממשיך ליצור עץ אפיתל 3. למרות אותות ביוכימיים רבים חשוב זוהו, הבנה מקיפה של מנגנונים ביולוגיים תא המנחים תהליך התפתחותי מו....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. הכנת פתרונות

  1. כדי להכין פתרון 5 מ"ג / מ"ל של אינסולין, לדלל את המניות אינסולין אבקת עם חומצה הידרוכלורית 5 מ"מ (HCl) ב DH 2 O (500 אינסולין מ"ג ב 100 מ"ל ממס). הכן 100 מ"ל ממס על ידי הוספת 50 μl של מרוכז HCl ל -100 מ"ל מים מזוקקים (DH 2 O).
  2. כדי להפוך את פתרון 1x של PBS, לדלל 10x המלוח שנאגר-פוספט (PBS) פתרון מניות 1X עם DH 2 O בתנאים סטריליים.
  3. הכן את polydimethylsiloxane (PDMS) אלסטומר פתרון כדלקמן: מערבבי....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

סכמטית כללית של microfabrication רקמות אפיתל חלב

סכימטי כללי של הליך microfabrication מתאר את זרימת העבודה הניסויית מוצג באיור 1. התוצאה הסופית היא מערך של רקמות אפיתל של גיאומטריה זהה וריווח מוטבעים לחלוטין בתוך ג'ל ECM. ניסוי נציג משתמשת בתאי אפיתל החלב עכבר EpH4 בתרבית ג'ל מסוג שור אני קולגן בריכוז של 4 מ"ג / מ"ל. כדי להבטיח את האיכות הגבוהה של.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הפרוטוקול המתואר לעיל מתאר שיטה לייצור רקמות אפיתל זהות בעלות צורה מוגדרת מראש, המאפשרת שליטה מרחבית על הלחץ המכני שחווים תאים ברקמה. תבנית אלסטומרית משמשת ליצירת חללים בקולגן מסוג I שלאחר מכן ממולאים בתאי אפיתל ומכוסים בשכבת קולגן נוספת כך שהתאים עטופים לחלוטין בסביבת מטריצת קולגן תלת מימדית. תרבית נוספת של רקמות אלו וטיפול בגורמי גדילה כדי לגרום להסתעפות מהארכיטקטורה הראשונית הופכים את המערכת הזו למתאימה לחקר מורפוגנזה מסועפת של תאי אפיתל. ישנם מספר שלבים קריטיים בפרוטוקול. הראשון הוא הרמת תבניות ה-PDMS ישר כלפי מעלה מ.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים מצהירים שאין להם אינטרסים פיננסיים מתחרים.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עבודה זו נתמכה בחלקה על ידי תרומות של NIH (HL118532, HL120142, CA187692), דוד & לוסיל פקארד קרן, קמיל & הנרי דרייפוס קרן, ואת בורוז ברוך הבא הקרן. ASP נתמכה בחלקה על ידי מלגת כבוד שרלוט אליזבת פרוקטר.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
פולידימתילסילוקסן (PDMS)דבקי אלסוורת'סילגארד 184
חומר ריפוי PDMSדבקים אלסוורת'סילגארד 184
סיליקון מאסטר בדוגמת ליטוגרפיהמתוצרת עצמיתN/A
סירת משקל פלסטיקפישר סיינטיפיק08-732-115
צלחות פטרי בקוטר 100 מ"מBioExpressD-2550-2
אלכוהול אתילי 200 הוכחהPharmco-Aaper111000200הכינו תמיסת 70% EtOH (v:v) על ידי ערבוב עם סכין גילוח dH2O
סכין גילוחבטיחות אמריקאי620179
1:1 Dulbecco' s Modified Eagle' s בינוני : חזיר' s F12 תערובת נוטריאנטים (DMEM/F12) (1:1)HycloneSH30023FS
סרום בקר עוברי (FBS)Atlanta BiologicalsS11150H
10x Hank' s תמיסת מלח מאוזנת (HBSS)Life Technologies14185-052
אינסוליןסיגמא אולדריץ'I6634-500MG
GentamicinLife Technologies15750-060
10x תמיסת מלח חוצצת פוספט (PBS)Fisher ScientificBP399-500
נתרן הידרוקסיד (NaOH)Sigma Aldrich221465-500G
בקר קולגן מסוג I (ללא פפסין)KokenIAC-50
אלבומין מסרום בקר (BSA)Sigma AldrichA-7906
פינצטה מעוקלת מנירוסטהDumont7
כלי תרבית רקמות בקוטר 35 מ"מBioExpressT-2881-6
15 מ"ל צינורות חרוטייםBioExpressC-3394-2
1.5 מ"ל Eppendorf Safe-Lock TubeUSA Scientific1615-5500
כיסויי זכוכית עגולים #1, בקוטר 15 מ"מBellco Glass Inc.הזמנה מיוחדת
0.05% 1x Trypsin-EDTALife Technologies25300-054
ParaformaldehydeVWR100503-916
Triton X-100Perkin ElmerN9300260חומר ניקוי
HGFSigma AldrichH 9661מושעה ב-dH2O ב-50 מ"ג/מ"ל
ארנב נגד עכבר FAK נוגדןחיים טכנולוגיותAMO0672
עיזים נגד ארנב Alexa 488 נוגדןLife TechnologiesA-11034
Adobe PhotoshopAdobeN/Aמשמש לקידוד צבע מפות תדר פיקסלים.
פיג'י (ImageJ)NIHN/Aתוכנה חינמית לניתוח תמונות המשמשת לסף, רישום וכיסוי תמונות ליצירת מפת תדר פיקסלים. התוסף StackReg שימש לרישום תמונות בינאריות.

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Affolter, M., et al. Tube or not tube: remodeling epithelial tissues by branching morphogenesis. Dev Cell. 4 (1), 11-18 (2003).
  2. Zhu, W., Nelson, C. M. PI3K signaling in the regulation of branching morphogenesis. Biosystems. 109 (3), 403-411 (2012).<....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

3D Epithelial TissuesBranching MorphogenesisExtracellular MatrixCollagen GelPDMS StampsTraction Force MicroscopyCell SeedingTissue GeometryHGF TreatmentFocal Adhesion Kinase

Related Articles