מאמר שיטה

אפיון של תאי דנדריטים אדם נגזר מונוציטים ידי cytometry זרימת הדמיה: השוואה בין שני פרוטוקולי בידוד מונוציטים

DOI:

10.3791/54296

⸱

18 באוקטובר 2016

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Immunology, Herbert Wertheim College of Medicine, Florida International University, 2Millipore Sigma

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מחקר זה משווה שתי שיטות שונות של בידוד מונוציטים אנושיים להשגת תאים דנדריטיים במבחנה (DCs). מונוציטים נבחרים על ידי היצמדות או מועשרים לרעה על ידי הפרדה מגנטית. תפוקת מונוציטים וכדאיות יחד עם כדאיות MDDC, התפשטות וביטוי סמני פני השטח CD11c/CD14 יושוו בין שתי השיטות.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

תאים דנדריטיים (DCs) הם תאים המציגים אנטיגן של מערכת החיסון הממלאים תפקיד מכריע בתגובות לימפוציטים, מנגנוני הגנה של המארח ופתוגנזה של דלקת. בידוד ומחקר של DCs היו חשובים במחקר הביולוגי בגלל המאפיינים הייחודיים שלהם. למרות שהם מתווכים מרכזיים חיוניים של מערכת החיסון, DCs נדירים מאוד בדם, ומהווים כ-0.1 - 1% מכלל התאים החד-גרעיניים בדם. לכן, חלופות לשיטות בידוד מסתמכות על התמיינות של DCs ממונוציטים המבודדים מתאים חד-גרעיניים בדם היקפי (PBMCs). שימוש בטכניקות בידוד מתאימות המשלבות פשטות, סבירות, טוהר גבוה ותפוקה גבוהה של תאים הוא הכרחי לשקול. במחקר הנוכחי יושוו שתי שיטות שונות ליצירת DCs. מונוציטים נבחרו על ידי היצמדות או הועשרו שלילית באמצעות הליך הפרדה מגנטית ואחריו התמיינות ל-DCs עם IL-4 ו-GM-CSF. כדאיות, התפשטות ופנוטיפ של מונוציטים ו-MDDC הוערכו באמצעות צבעי כדאיות, בדיקת MTT וניתוח סמני משטח CD11c/CD14 על ידי הדמיית ציטומטריית זרימה. למרות ששיטת ההפרדה המגנטית הניבה אחוז גבוה משמעותית של מונוציטים בעלי יכולת התפשטות גבוהה יותר בהשוואה לשיטת ההדבקה, הממצאים הוכיחו את היכולת של שתי הטכניקות לייצר בו זמנית מונוציטים המסוגלים להתרבות ולהתמיין ל-CD11c+ MDDCs ברי קיימא לאחר שבעה ימים בתרבית. שתי השיטות הניבו >-70% CD11c+ MDDCs. לכן, התוצאות שלנו מספקות תובנות התורמות לפיתוח שיטות אמינות לבידוד ואפיון של DCs אנושיים.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

תאים דנדריטים (DCS) הם מתווכים חיוניים של מערכות החיסון המולדת ובעלי כושר הסתגלות. הן מתפקדות לגרום תגובה חיסונית ראשונית להקל על הפיתוח של זיכרון אימונולוגי. תאים אלה אחראים בעיקר עבור לכידת אנטיגן, הגירת גירוי תא T ולכן מכונים תאי מציגי אנטיגן מקצועיים כמו (נגמ"שים) 1 .Manipulation של DCs יכול להיות מנוצל על פני מגוון רחב של תחומי מחקר במסגרת הקלינית לטיפול שונה מחלות דלקתיות כגון HIV 6,7, סרטן 8, מחלות אוטואימוניות 9, ותגובות אלרגיות 10. DCs גם בשימוש למחקר התמכרות לסמים ואלכוהול על מנת לפתור מנגנונים לא ידועים מסלולים כגון אלה הקשורים בתלות באלכוהול 11-14, תלות בסמים 13,15, והשילוב של הידבקות ב- HIV ו חומר התעללות 16-19. מחקרים מתמשכים אלה ומחקרים בעתיד אניn בתחום האימונולוגיה לעשות בדור חוץ גופית של DCs חשוב מאוד למחקר. עם זאת, ישנם מספר קשיים הקשורים לבודד DCs מדם האדם כפי שהם רק מהווים 0.1 - 1% של תאים mononuclear הדם הכולל 20.

עד כה, חלק מהשיטות והמבוססות עבור הדור של DCs במבחנה מורכב דבקות פלסטיק או זכוכית של מונוציטים 21,22, צנטריפוגה שיפוע צפיפות 23, פרדה על בסיס סמן ספציפי כגון תא מגנטי מיון מופעל 22, תא מופעל פלורסנט מיון 24, סלקציה חיובית של מונוציטים CD14 + באמצעות חלקיקים מגנטיים צופה dextran 25, ובידוד מהיר של מונוציטים נקיים במיוחד באמצעות בחירת תא שלילית אוטומטית לחלוטין 26. עם זאת, השיטה הטובה ביותר של בחירה שנויה במחלוקת. לכן, כדי לשפר את טכניקות דור DC, מספר שיטות פותחו בהטוהר של תאים אלה יכולים להיות גדל מאוד על ידי בידול מתאי CD34 + אבי מטוהרים מונוציטים מבודדים מתאי דם היקפיים mononuclear (PBMCs) 27. כאמור לפני, שיטה המשמשת והפופולרי נרחב ליצירת תאים דנדריטים נגזר מונוציטים (MDDCs) היא לחקור את היכולת של מונוציטים לדבוק זכוכית או פלסטיק (שיטת הדבקות) 21,22,27. השיטה הדבקה היא שיטה מהירה וישירה שאינו דורשת שימוש בציוד מורכב. עם זאת, כמה חסרונות של התהליך הזה כוללים זיהום לימפוציטים, גמישות נמוכה, ומניפולציה חולפת מונוציטים 28. שיטה חלופית לשיטת הדבקות היא הבידוד המגנטי של מונוציטים מ PBMCs הכולל, במיוחד עם השימוש של ערכת העשרה מונוציטים אדם, אשר נועדה לבודד מונוציטים מ PBMCs ידי סלקציה שלילית 26. במהלך הליך זה, תאים לא רצויים ממוקדים להסרה עם tetramericמתחמי נוגדן וחלקיקים מגנטיים מצופה dextran. יתרונה של שיטת הבידוד הזה הוא כי התאים שכותרתו הרצויים מופרדים באמצעות מגנט בעוד תאי יעד יכולים להיות ניגרו בחופשיות לתוך צינור חדש ללא צורך עמודות. עד כה, עם הזמינות של נוגדנים ספציפיים monoclonal שיכול לתייג אוכלוסיות תאים ייחודיות, טכניקת הפרדה המגנטית הפכה לא פשוט שיטה נוספת, אלא הכרח עבור הבידוד של תאים נדירים בתחום האימונולוגיה. למשל, טכניקות כגון תא מגנטי מיון עם-חלקיקים MACS פאראמגנטיים זמינים מסחרית הקלו בפיתוח גישות חדשות למחקר ויישומים קליניים 22,29. יתר על כן, מחקרים מהזמן האחרון המשווה בין הדור DC משיטות הטכנולוגיה דבקות מונוציטים ו MACS הוכיחו טוהר DC גבוה ואת הכדאיות באמצעות MACS מופרדים מונוציטים 22,30.

מתנות המחקר הנוכחיותהשוואה בין שתי שיטות לייצור DCs האנושי מונוציטים מבודדים PBMCs: 1) בידוד מונוציטים ידי היצמדות 2) בידוד מונוציטים ידי סלקציה שלילית באמצעות ערכת העשרה מונוציטים אדם מסחרית. מחקר זה מספק ראיות כדי להראות כי נוהל הפרדה המגנט סלקציה השלילית לבודד מונוציטים מייצר את התשואה הגבוהה ביותר של מונוציטים ללא הבדלים משמעותיים כדאי מונוציטים בהשוואת מונוציטים המבודדים בשיטת דבקות. בתורו, לאחר שבעה ימים, מונוציטים מבודדים על-ידי פרדה מגנטית מובחנים לתוך MDDCs עם יכולת שגשוג ואת סכום גבוה יותר באופן משמעותי גבוהים יותר של תאי מבטאים חיוביים כפול (CD11c + / CD14 +) פנוטיפ מבלי להשפיע כדאיות MDDC. בסה"כ, המחקר הנוכחי שונה מחקרים קודמים אשר בסימוכין שכן הוא מדגים את היכולת של שתי הטכניקות בו זמנית לייצר מונוציטים המסוגלים מתרבים ומבדל לתוך CD11c +MDDCs (> 70%) לאחר שבעה ימים בתרבות מבלי להתפשר הכדאיות שלהם. בנוסף, הגישה הנוכחית מספקת לאפיון לראשונה של אוכלוסיות שונות CD11c / CD14 MDDCs ידי זרימת הדמיה cytometry.

לסיכום, מאז DCs לשחק מוקדי תפקיד לגבי מחקר בתחום האימונולוגיה, פרמטרים שונים חייבים להילקח בחשבון כאשר בוחנים כיצד הם מתקבלים ומה שיטות משמשים לבודד ותרבות אותם במבחנה. לכן, מחקר זה נועד לספק תובנה על שתי שיטות שונות של בידוד מונוציטים וכיצד שיטות אלה באופן דיפרנציאלי להשפיע כדאיות מונוציטים ותשואה בסופו של דבר להשפיע על הכדאיות של תאים דנדריטים, התפשטות, פנוטיפ. ממצאים אלו יתרמו רבים בתחום האימונולוגיה ויספקו פרוטוקול מפורט של בידוד DC, טיהור, ואפיון.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

בסך הכל מחקרי דם אדם כבר נבדקו ואושרו על ידי דירקטוריון הסקירה המוסדי (IRB) של FIU, פרוטוקול IRB אישור # IRB-13-0440. leukopaks אדם נרכש מבנק דם הקהילה במיאמי, פלורידה.

1. ניתוק של PBMCs ידי טכניקת שיפוע צפיפות תקן

  1. בצע דילול 1: 1 של דם עם מי מלח 1X פוספט שנאגר בבקבוק T75.
  2. פיפטה 15 מ"ל של תמיסת שיפוע צפיפות לתוך 50 מ"ל צינורות צנטריפוגות שכבת בזהירות (25 - 30 מ"ל / צינור) של דם מדולל על שיפוע זה.
  3. צנטריפוגות במשך 20 דקות ב 1200 XG עם האצה של 1 האטה של ​​0.
  4. לאחר צנטריפוגה, לאסוף את שכבת ממשק (תאי דם לבנים) לתוך צינור צנטריפוגות חדשות 50 מ"ל ולשטוף תאים פעמיים PBS (3 דקות ב 1,080 XG). להשליך supernatant בכל פעם.
  5. פנקו את התאים עם lysing-אשלגן אמוניום כלוריד (ACK) חיץ (כדי lyse תאי דם אדומים). הוסף 10 מ"ל של חיץ ובcubate במשך 15 דקות ב 4 ° C..
  6. פעמיים שטפו תאים עם PBS, צנטריפוגות במשך 3 דקות ב 1080 XG וזורקים supernatant בכל פעם.
  7. שמור גלולה, אשר יכיל את PBMCs.
  8. להמשיך עם שיטת טיהור מונוציטים של בחירה.

2. טיהור מונוציטים ידי דבקות שיטה

  1. הכן בינוני תרבית תאים מלאה המכילה L- גלוטמין (300 מ"ג / מ"ל) שיושלם עם פניצילין (50 U / ml) -streptomycin (50 מיקרוגרם / מ"ל) ו -10% בסרום שור העובר.
  2. אפשר PBMCs לדבוק כ 2 שעות על ידי culturing אותם בבקבוק T75 בריכוז של 5 x 10 7 תאים לכל 10 מ"ל של מדיום שלם ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 באינקובטור humidified.
  3. לאחר דגירה, להסיר תאי צפים שאינם חסידים מן בקבוק התרבות לשטוף בעדינות תאים חסידים פעמים עם PBS.
  4. דגירת תאים חסידים במדיום תרבית תאים מלא בתוספת 2 μl / מיליליטר של macr גרנולוציט אדםמושבה ממגרת גורם ophage (GM-CSF) ו- interleukin 4 (IL-4) מאוחסנים בריכוז מלאה של 10 מיקרוגרם / מיליליטר.
  5. שנה וחצי של המדיום ומלאו ציטוקינים כל 48 שעות.
  6. אפשר 5 - 7 ימים עבור הבידול של מונוציטים לתוך MDDCs.

3. טיהור מונוציטים ידי שיטת הפרדה מגנטית

  1. אסוף PBMCs מן הטכניקה שיפוע צפיפות תקן, יוצקים לתוך צינור קלקר 5 מ"ל מחדש להשעות במאגר PBS בריכוז של תאים / מ"ל.
  2. הוסף קוקטייל ההעשרה מונוציטים האדם באמצעות 50 μl / תאים מ"ל, מערבבים היטב דגירה על 4 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות.
  3. לאחר דגירה, להוסיף חלקיקים מגנטיים באמצעות 50 μl / תאים מ"ל, מערבבים היטב דגירה על 4 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות.
  4. תביאו ההשעיה תא עד נפח כולל של 2.5 מ"ל על ידי הוספת PBS חיץ, ומערבבים היטב על ידי pipetting למעלה ולמטה 2 - 3 פעמים.
  5. מניח את צינור הקלקר בלי כובע לתוך המכשיר המגנטי להפריש ב RT במשך 2.5 דקות.
  6. לאחר הדגירה בתנועה אחת רציפה, להרים המגנט ויוצקים השבר מונוציטים מטוהרים הרצויה לתוך צינור צנטריפוגה 50 מ"ל נקי.
  7. דגירת תאים חסידים במדיום תרבית תאים מלא בתוספת 2 μl / מיליליטר של (CSF-GM) גורם מגרת מושבת מקרופאג-גרנולוציט אדם אינטרלוקין 4 (IL-4) מאוחסנים בריכוז מלאה של 10 מיקרוגרם / מיליליטר.
  8. כל 48 שעות, לשנות וחצי של המדיום, ספין למטה ב 1,080 XG למשך 5 דקות מחדש להשעות גלולה עם מדיה חדשה (CRPMI) וציטוקינים.
  9. אפשר 5 - 7 ימים עבור הבידול של מונוציטים לתוך MDDCs.

4. Assay ליכולת קיום הכללת Trypan הכחול

הערה: השתמש בטכניקה זו כדי להשיג תא תשואה ואת הכדאיות של PBMCs, מונוציטים, ו MDDCs.

  1. קציר תאים באמצעות תקן טריפסין-EDTA ולבצע שטיפות של צלוחיות ואת גלולת התא באמצעות PBS. בהתאם לגודל של הגלולה, מחדשלהשעות ב 5 עד 10 מיליליטר של PBS לפזר את הגלולה.
  2. בתוך צינור מיקרו צנטריפוגות, לבצע דילול 1: 1 של מגיב trypan כחול עם תא גלולה מדולל.
  3. מתוך תמהיל זה, aliquot 10 μl לתא לספור שקופיות ולקרוא תוצאות באמצעות דלפק תא אוטומטי על פי הפרוטוקול של היצרן. אם נגד תא אוטומטי אינו זמין, ספירת תאים דומה אפשרית באמצעות hemocytometer או דלפק ידני.

5. Assay MTT

  1. פלייט תאים בריכוז של 4 x 10 4/100 μl של מדיה מלאה לבאר כל צלחת 96-היטב. אפשר 24 שעות עבור תאים להסתגל לתרבות.
  2. דגירה ולבצע קריאות 0 (יום 0), 36 (יום 3) ו -84 (יום 7) שעות בהתאמה.
  3. במועד ההשלמה של דגירה רצויה, להסיר תקשורת ולהחליף עם 100 μl של PBS לבד.
  4. הכן 3- (4,5-dimethylthiazol-2-י.ל.) פתרון ברומיד tetrazolium -2,5-diphenyl (MTT) (5 מ"ג / מ"ל) על ידי הוספת 10 מ"ל של dimethsulfoxide י.ל. (DMSO) עד 1 גרם של סולפט dodecyl נתרן (SDS).
  5. הוסף 10 μl (5 מ"ג / מ"ל) של פתרון MTT זה היטב לדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך 2 שעות נוספות.
  6. לאחר דגירה, להסיר supernatants המכילים PBS תערובת MTT unconverted (פתרון צהוב צבעים).
  7. הוספת 100 μl של פתרון SDS-DMSO היטב כל דגירה במשך שעה אחת נוספת.
  8. קראו ספיגה ב 540 ננומטר באמצעות קורא microplate.

6. פני תא ניתוח מכתים ידי cytometry זרימת ההדמיה

  1. לאחר 7 ימים של בידול לעומת מונוציטים מטוהרים, לוותר 1x10 6 aliquots תא של התאים הדנדריטים הנגזרות מונוציטים לתוך המספר המתאים של צינורות 1.5 מ"ל.
  2. התחילו מכתימים פני תא על ידי תאי חסימה באמצעות 50 μl של חום מומת (HI) נסיוב אדם, דגירה על 4 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות.
  3. לאחר דגירה, תאים צנטריפוגות ב 720 XG במשך 5 דקות, להשליך supernatant.
  4. לתא Pellet, להוסיף fluorochrome- מצומדות נוגדנים המתאימים (למשל, אנטי CD11c או אנטי CD14) דגירה על 4 מעלות צלזיוס במשך 20 דקות מוגנים מפני אור. ב צינורות נפרדים, להכין דגימות יחיד מוכתם fluorochrome / מ"ל) מאז הם נדרשים לפיצוי.
  5. לאחר דגירה, לשטוף תאים פעמיים 1 מ"ל של חיץ PBS ו צנטריפוגות בכל פעם ב 720 XG במשך 5 דקות.
  6. שמירת תאים המוגנים מפני אור, מחדש להשעות במאגר PBS בריכוז של תאים / 100 μl לניתוח cytometry זרימה.
  7. על מנת שער על תאי קיימא, להוסיף 1 μl של DAPI על צינור אחד לפני רכישת התאים על זרימת הדמית תא הבודדה cytometry מכשיר פי הוראות היצרן.

7. ניתוח סטטיסטי

  1. קלט את כל הנתונים בגיליון אלקטרוני.
  2. השוואת התוצאות באמצעות מבחן t ו / או חד סטרי ANOVA על פי הצורך של התלמיד.
  3. מביא בחשבון הבדלים בין להיות משמעותי מבחינה סטטיסטית אם p <0.05.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

תשואת מונוציטים ידי פרדה מגנטית גבוהה בהשוואת תשואת מונוציטים ידי דבקות שיטה

נתונים המוצגים PBMC תצוגת איור 1 וספירת תאים מונוציטים בשיטת הרחקת trypan הכחולה על היום של בידוד של PBMCs ופרדה של מונוציטים. בממוצע, מונוציטים מבודדים בשיטת דבקות היוו כ 6.2 אחוז PBMCs הכולל תוך מונוציטים מבודדים על-ידי הפרדה מגנטי היוו ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

בהתבסס על הקשיים הידועים של בידוד ויצירת MDDCs מדם אדם, המחקר הנוכחי נועד לספק השוואה מקיפה של שתי שיטות ומבוססות עבור הדור של MDDCs. השיטה הראשונה לעומת שיטה מסורתית ומבוססת להפקה MDDCs תוך ניצול היכולת של מונוציטים לדבוק זכוכית או פלסטיק (שיטת הדבקות) 21,22,27. השיטה הדבקה היא מהירה וחסכונית, ואינו דורשת שימוש בציוד מורכב. עם זאת, כמה חסרונות של התהליך הזה כוללים זיהום לימפוציטים, גמישות נמוכה, 22,30,31 מניפולציה חולפת מונוציטים. שיטת החלופה השנייה לעומת הי...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כל המחברים אינם מגלים אינטרסים פיננסיים מתחרים.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מחקר זה נתמך על ידי המכון הלאומי להתמכרות לאלכוהול ואלכוהוליזם, פרס K99/R00 AA021264. תמיכה נוספת במעבדה כחלק מחבילת הסטארט-אפ התקבלה מהמחלקה לאימונולוגיה, המכון לפרמקולוגיה נוירו-אימונית, מכללת הרברט ורטהיים לרפואה ו-FIU- המשרד למחקר ופיתוח כלכלי. ג'יאנה קסטלירו נתמכה על ידי NIH/NIGMS R25 GM061347. התוכן הוא באחריות המחברים בלבד ואינו מייצג בהכרח את העמדות הרשמיות של המכונים הלאומיים לבריאות.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
Ficoll-PaqueGE Healthcare17-5442-03יש להשתמש ב-RT
Phosphate-buffered מלח (PBS)Life Technologies10010-023
ACK מאגר ליסינגאיכות ביולוגית118-156-101
RPMI 1640 טכנולוגיות חיים בינוניות22400-089
טכנולוגיות חיים אנטיביוטיות-אנטימיקוטיות (100x)Life15240-062
סרום בקר עוברי (FBS)Life Technologies16000-044
מאגר RoboSepStemCell20104
ערכת העשרת מונוציטים אנושיים EasySep StemCell19059
TC20 מונה תאים אוטומטיBio-Rad145-0101
FITC-DextranSigma AldrichFD4-100MG
כתם כחול טריפן (0.4%)Life Technologies15250-061
קורא רב-מצבי סינרג'י 2Biotek7131000
XTT ביו-ריאגנט מלח נתרן (XTT)סיגמא אולדריץ'X4626-100MG
ביורגנט דימתיל סולפוקסיד (DMS)סיגמא אולדריץ'D8418-500ML
תיאזוליל כחול טטרזוליום ברומיד (MTT)סיגמא אולדריץ'm5655-500MG
נתרן דודציל סולפט (SDS)Bio-Rad161-0302
פנאזין מתוסולפט (DMSO)סיגמא אולדריץ'P9626-1G
סרום אנושי מומת (HI)ChemiconS1-100ML
Accuri C6 זרימה ציטומטרBD Accuri653119
FlowSight Amnis זרימה ציטומטרEMD Millipore100300

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Cella, M., Sallusto, F., Lanzavecchia, A. Origin maturation and antigen presenting function of dendritic cells. Curr Opin Imunol. 9, 10-16 (1997).
  2. Banchereau, J., et al. Immunobiology of Dendritic Cells. Ann Rev Immunol. 18, 767-811 (2000).
  3. Banchereau, J., Steinman, R. M. Dendritic cells and the control of immunity. Nature. 392, 245-252 (1998).
  4. Kaouther, M., Ridha, O. Dendritic Cell-Based Graft Tolerance. ISRN Pharmacol. , (2011).
  5. Steinman, R., Gutchinov, B., Witmer, M., Nussenzweig, M. Dendritic cells are the principal stimulators of the primary mixed leukocyte reaction in mice. J Exp Med. 157, 613-627 (1983).
  6. Nair, M. N., et al. RNAi-directed inhibition of DC-SIGN by dendritic cells: Prospects for HIV-1 therapy. AAPS J. 7, E572-E578 (2005).
  7. Agudelo, M., et al. Chapter 10. Dendritic Cells: Types, Life Cycles and Biological Functions. , Nova Publishers. 167-177 (2010).
  8. Kajihara, M., Takakura, K., Ohkusa, T., Koido, S. The impact of dendritic cell-tumor fusion cells on cancer vaccines - past progress and future strategies. Immunotherapy. , (2015).
  9. Suwandi, J., Toes, R., Nikolic, T., Roep, B. Inducing tissue specific tolerance in autoimmune disease with tolerogenic dendritic cells. Clin Exp Rheumatol. 33, 0097-0103 (2015).
  10. Gorelik, M., Frischmeyer-Guerrerio, P. A. Innate and adaptive dendritic cell responses to immunotherapy. Curr Opin Allergy Immunol. 15, 575-580 (2015).
  11. Zwolak, A., et al. Peripheral blood dendritic cells in alcoholic and autoimmune liver disorders. Hum Exp Toxicol. 31, 438-446 (2012).
  12. Agudelo, M., et al. Differential expression and functional role of cannabinoid genes in alcohol users. Drug Alcohol Depend. 133, 789-793 (2013).
  13. Nair, M. P., Figueroa, G., Casteleiro, G., Muñoz, K., Agudelo, M. Alcohol Versus Cannabinoids: A Review of Their Opposite Neuro-Immunomodulatory Effects and Future Therapeutic Potentials. J Alcohol Drug Depend. 3, 184(2015).
  14. Boukli, N. M., et al. Implications of ER Stress, the Unfolded Protein Response, and Pro- and Anti-Apoptotic Protein Fingerprints in Human Monocyte-Derived Dendritic Cells Treated With Alcohol. Alcohol Clin Exp Res. 34, 2081-2088 (2010).
  15. Nair, M. N., Mahajan, S., Sykes, D., Bapardekar, M., Reynolds, J. Methamphetamine Modulates DC-SIGN Expression by Mature Dendritic Cells. J Neuroimmune Pharmacol. 1, 296-304 (2006).
  16. Napuri, J., et al. Cocaine Enhances HIV-1 Infectivity in Monocyte Derived Dendritic Cells by Suppressing microRNA-155. PLoS ONE. 8, e83682(2013).
  17. Nair, M. P. N., Saiyed, Z. M. Effect of methamphetamine on expression of HIV coreceptors and CC-chemokines by dendritic cells. Life Sciences. 88, 987-994 (2011).
  18. Nair, M. P. N., et al. Cocaine Modulates Dendritic Cell-Specific C Type Intercellular Adhesion Molecule-3-Grabbing Nonintegrin Expression by Dendritic Cells in HIV-1 Patients. J Immunol. 174, 6617-6626 (2005).
  19. Reynolds, J. L., Mahajan, S. D., Sykes, D. E., Schwartz, S. A., Nair, M. P. N. Proteomic analyses of methamphetamine (METH)-induced differential protein expression by immature dendritic cells (IDC). Biochem Biophys Acta. 1774, 433-442 (2007).
  20. Van Voorhis, W., Hair, L., Steinman, R., Kaplan, G. Human dendritic cells. Enrichment and characterization from peripheral blood. J Exp Med. 155, 1172-1187 (1982).
  21. Davis, G. The Mac-1 and p150,95 beta 2 integrins bind denatured proteins to mediate leukocyte cell-substrate adhesion. Exp Cell Res. 200, 242-252 (1992).
  22. Delirezh, N., Shojaeefar, E. Phenotypic and functional comparison between flask adherent and magnetic activated cell sorted monocytes derived dendritic cells. Iran J Immunol. 9, 98-108 (2012).
  23. Lehner, M., Holter, W. Endotoxin-Free Purification of Monocytes for Dendritic Cell Generation via Discontinuous Density Gradient Centrifugation Based on Diluted Ficoll-Paque Plus®. Int Arch Allergy Immunol. 128, 73-76 (2002).
  24. Van Brussel, I., et al. Fluorescent activated cell sorting: An effective approach to study dendritic cell subsets in human atherosclerotic plaques. J. Immunol Methods. 417, 76-85 (2015).
  25. Mucci, I., et al. The methodological approach for the generation of humandendritic cells from monocytes affects the maturation state of the resultant dendritic cells. Biologicals. 37, 288-296 (2009).
  26. Yuan, N., et al. The American Association of Immunologists (AAI). , AAI. Miami Beach, FL. (2007).
  27. Romani, N., et al. Proliferating dendritic cell progenitors in human blood. J Exp Med. 180, 83-93 (1994).
  28. Bennett, S., Breit, S. N. Variables in the isolation and culture of human monocytes that are of particular relevance to studies of HIV. J Leukoc Biol. 56, 236-240 (1994).
  29. Grützkau, A., Radbruch, A. Small but mighty: How the MACS®-technology based on nanosized superparamagnetic particles has helped to analyze the immune system within the last 20 years. Cytometry Part A. 77A, 643-647 (2010).
  30. El-Sahrigy, S. A., Mohamed, N. A., Talkhan, H. A., Rahman, A. M. A. Comparison between magnetic activated cell sorted monocytes and monocyte adherence techniques for in vitro generation of immature dendritic cells: an Egyptian trial. Cent Eur J Immunol. 40, 18-24 (2015).
  31. Curry, C. V. Differential Blood Count. , http://emedicine.medscape.com/article/2085133-overview (2015).
  32. Sallusto, F., Lanzavecchia, A. Efficient presentation of soluble antigen by cultured human dendritic cells is maintained by granulocyte/macrophage colony-stimulating factor plus interleukin 4 and downregulated by tumor necrosis factor alpha. J Exp Med. 179, 1109-1118 (1994).
  33. Cavanagh, L. L., Saal, R. J., Grimmett, K. L., Thomas, R. Proliferation in Monocyte-Derived Dendritic Cell Cultures Is Caused by Progenitor Cells Capable of Myeloid Differentiation. Blood. 92, 1598-1607 (1998).
  34. Ardeshna, S. M., et al. Monocyte-derived dendritic cells do not proliferate and are not susceptible to retroviral transduction. Br J Haematol. 108, 817-824 (2000).
  35. Chapuis, F., et al. Differentiation of human dendritic cells from monocytes in vitro. Eur J Immunol. 27, 431-441 (1997).
  36. Zhou, L. J., Tedder, T. F. CD14+ blood monocytes can differentiate into functionally mature CD83+ dendritic cells. Proc Natl Acad Sci. 93, 2588-2592 (1996).
  37. Caux, C., et al. B70/B7-2 is identical to CD86 and is the major functional ligand for CD28 expressed on human dendritic cells. J Exp Med. 180, 1841-1847 (1994).
  38. Caux, C., et al. Activation of human dendritic cells through CD40 cross-linking. J Exp Med. 180, 1263-1272 (1994).
  39. Fujii, S. i, Liu, K., Smith, C., Bonito, A. J., Steinman, R. M. The Linkage of Innate to Adaptive Immunity via Maturing Dendritic Cells In Vivo Requires CD40 Ligation in Addition to Antigen Presentation and CD80/86 Costimulation. J Exp Med. 199, 1607-1618 (2004).
  40. Mohammadi, A., Mehrzad, J., Mahmoudi, M., Schneider, M., Haghparast, A. Effect of culture and maturation on human monocyte-derived dendritic cell surface markers, necrosis and antigen binding. Biotech Histochem. 90, 445-452 (2015).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

Monocyte IsolationDendritic Cell GenerationImaging Flow CytometryMagnetic SeparationAdherence MethodCD11c CD14 AnalysisPeripheral Blood Mononuclear CellsHuman Monocyte DifferentiationViability Proliferation AssessmentSingle Cell Analysis

מאמרים קשורים