A-תפוקה גבוהה, אוטומטית, מתודולוגיה ייצור וטרנספורמציה טבק פרוטופלאסט מתוארת. המערכת הרובוטית מאפשרת ביטוי גנים מקביל מסיבי וגילוי במודל BY-2 המערכת שאמורה להיות לתרגום לגידולים שאינם מודל.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
פלטפורמה רובוטית עבור תפוקה גבוהה בידוד פרוטופלאסט וההשנאה
במאמר זה
סיכום
תקציר
בעשור האחרון חלה התעוררות מחודשת השימוש פרוטופלאסט צמח נעים בין מיני מודל לחתוך מינים, לניתוח של מסלולי העברת אותות, רשתות רגולטוריות תעתיק, ביטוי גנים, הגנום עריכה-להשתקת גנים. יתר על כן, התקדמות משמעותית נעשתה ההתחדשות של צמחים מפני פרוטופלאסט, אשר יצרה עניין עוד יותר את השימוש במערכות אלה עבור הגנומיקה צמח. בעבודה זו, פרוטוקול פותח לאוטומציה של בידוד פרוטופלאסט וטרנספורמציה מתרבה השעית טבק 2 'צהובה בוהק "(BY-2) באמצעות פלטפורמה רובוטית. נהלי טרנספורמציה אומתו באמצעות חלבון פלואורסצנטי כתום גן כתב (OFP) (pporRFP) תחת השליטה של אמרגן 35S וירוס פסיפס הכרובית (35S). ביטוי OFP ב פרוטופלאסט אושר על ידי מיקרוסקופ epifluorescence. ניתוח כלל גם שיטות יעילות הייצור פרוטופלאסט באמצעות propidiuיודיד מטר. לבסוף, אנזימי כיתת מזון בעלות נמוכה שמשו הליך בידוד פרוטופלאסט, עקיפת הצורך אנזימי מעבדת כיתה כי הם עלות אוסרני ב תפוקה גבוהה אוטומטי בידוד פרוטופלאסט וניתוח. בהתבסס על הפרוטוקול שפותח בעבודה זו, הנוהל במלואו מבידוד פרוטופלאסט לטרנספורמציה יכול להתנהל תחת 4 שעות, ללא כל קלט מהמפעיל. בעוד פרוטוקול שפותח בעבודה זו קיבלה תוקף עם תרבית תאים BY-2, נהלים ושיטות צריכה להיות לתרגום לכל ההשעיה צמח תרבות / מערכת פרוטופלאסט, מה שאמור לאפשר האצה של מחקר הגנום היבול.
מבוא
בשנים האחרונות חלה תנופה משמעותית דגש על העיצוב של יבולים מהונדסים להתגבר מחלות שונות 1, מעניק עמידות עשבים 2, להעניק בצורת 3,4 וסובלנות מלח 5, למנוע herbivory 6, להגדיל את התשואה ביומסה 7, ולהקטין סרבנות דופן תא 8. מגמה זו כבר שנעזר בפיתוח כלים מולקולריים חדשים להפקת צמחי מהונדס, כולל הגנום עריכה באמצעות CRISPR ו TALENs 9, ואת הגן השתקה דרך dsRNA 10, מירנה 11, ו siRNA 12. בעוד הטכנולוגיות הללו יש לפשט את הדור של צמחים מהונדסים, הם גם יצרו צוואר בקבוק, שבו המספר העצום של צמחים מהונדסים שנוצר לא יכול להיות מוק....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
1. הקמת תא תרבויות השעיה
- הכן נוזלי BY-2 מדיה ידי הוספת 4.43 גרם Linsmaier & Skoog התקשורת בסל, 30 גרם של סוכרוז, 200 מ"ג KH 2 PO 4, ו -200 מיקרוגרם של 2,4-dichlorophenoxyacetic חומצה (2,4-D) ל -900 מ"ל של מזוקקים מי pH 5.8 עם 0.1 M KOH. לאחר תקנון pH, להתאים את עוצמת סופית 1,000 מיליליטר עם מים מזוקקים חיטוי. מדיה ניתן לאחסן עד 2 שבועות 4 ° C.
- לחסן בבקבוק 250 מ"ל Erlenmeyer עם 100 מ"ל של נוזל BY-2 התקשורת חתיכה אחת של יבלת BY-2 (> 1 ס"מ קוטר) גדל על BY-2 התקשורת מוצק ....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
במחקר הנוכחי, שיעור ההכפלה של BY-2 נע בין 14-18 שעות תלויות בטמפרטורה שבה התרבויות הודגרו, עולה בקנה אחד עם דיווחים קודמים של אורך מחזור התא ממוצע של 15 שעות. עם שיעור הכפלה זו, ביחס של 1: בידוד החל 100 שמש ליזום תרבויות, מה שמוביל תרבויות עם נפח תא ארוז (PCV) של 50% ב 5-7 ימים. בפרוטוקול הנוכחי, שבו תרבויות גדלו ב -200 מ"ל של התקשורת, PCV של 100 מ"ל נוצר ב -7 ימים, אשר סיפקה מספיק תאים כדי למלא 33 6 צלחות היטב. במונחי תשואה פרוטופלאסט, ע.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
הפרוטוקול המתואר לעיל יאומת בהצלחה לבידוד פרוטופלאסט, ספירה, וטרנספורמציה באמצעות תרבית תאי השעית טבק BY-2; עם זאת, הפרוטוקול יכול בקלות להיות מורחב על כל תרבות השעית צמח. נכון לעכשיו, בידוד וטרנספורמציה פרוטופלאסט הושגה בצמחים רבים, כולל תירס (Zea Mays) 10, גזר (Carota Daucus) 32, צפצפה (צפצפת הפרת) 33, ענבים (גפן היין) 34, שמן דקלים (guineensis Elaeis) 35 36, חסה (S.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
החוקרים מצהירים כי אין להם אינטרס כלכלי מתחרים.
תודות
מחקר זה נתמך על ידי הסוכנות לפרויקטים מחקריים מתקדמים - אנרגיה (ARPA-E) פרס מס. דה-AR0000313.
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| Orbitor RS Microplate Mover | Thermo Scientific | ||
| Bravo Liquid Handler | Agilent | ||
| Synergy H1 Multi-mode Reader | BioTek | ||
| MultiFlo FX Multi-mode Dispenser | BioTek | ||
| Teleshake | Inheco | 3800048 | |
| CPAC Ultraflat מחמם/מצנן | Inheco | ||
| תוכנת אוטומציה של Vworks | Agilent | המשמשת לבקרה וכתיבת פרוטוקולים עבור Agilent Bravo | |
| Momentum Software | תוכנת תזמון משימות Thermo Scientific | ||
| RS Liquid Handling Control 2.17 Software | Biotek | Software המשמשת לבקרה וכתיבת פרוטוקולים עבור MultiFlo FX | |
| IX81 Inverted Microscope | אולימפוס | ||
| זילה 3-Tap מיקרוסקופ מצלמה | Andor | ||
| ET-CY3/TRITC סט מסנן | Chroma Technology Corp | 49004 | |
| Rohament CL | AB אנזימים | מדגם בקבוק | צלולאז בעלות נמוכה |
| Rohapect UF | AB אנזימים | בקבוק מדגם | בעלות נמוכה פקטינאז |
| Rohapect 10L | AB אנזימים | בקבוק מדגם | פקטינאז / ארבינאז בעלות נמוכה |
| Linsmaier & Skoog בסיסי בינוני | Phytotechnology Laboratories | L689 | |
| 2,4-dichlorophenoxyacetic acid | Phytotechnology Laboratories | D295 | |
| propidium iodide | Sigma Aldrich | P4170 | |
| Poly (אתילן גליקול) 4000 | Sigma Aldrich | 95904-250G-F | לשעבר Fluka PEG |
| Propidium Iodide | Fisher Scientific | 25535-16-4 | אקרוס אורגניקס |
| CaCl2 | Sigma Aldrich | C7902-1KG | |
| נתרן אצטט | פישר סיינטיפיק | BP333-500 | |
| מניטול | סיגמא אולדריץ' | M1902-1KG | |
| סוכרוז | פישר סיינטיפיק | S5-3 | |
| KH2PO4 | Fisher Scientific | AC424205000 | |
| KOH | Sigma Aldrich | P1767 | |
| Gelzan CM | Sigma Aldrich | G1910-250G | |
| צלחת 6 בארות | Thermo Scientific | 103184 | |
| 96 בארות 1.2 מ"ל צלחת באר עמוקה | Thermo Scientific | AB-0564 | |
| 96 באר צלחת תחתונה אופטית | Thermo Scientific | 165305 | |
| Finntip 1000 קצות | Pipet רחביםThermo Scientific | 9405 163 | |
| NaCl | Fisher Scientific | BP358-10 | |
| KCl | Sigma Aldrich | P4504-1KG | |
| MES | Fisher Scientific | AC17259-5000 | |
| MgCl2 | Fisher Scientific | M33-500 |
מקורות
- Atkinson, H. J., Lilley, C. J., Urwin, P. E. Strategies for transgenic nematode control in developed and developing world crops. Curr. Opin. Biotech. 23 (2), 251-256 (2012).
- Duke, S. O. Perspectives on transgenic, ....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
