Method Article

מיקרוסקופי אלקטרונים בהירי-עור גומל באמצעות חלקיקי נקודה קוונטית

DOI:

10.3791/54307

⸱

August 7th, 2016

 , 
1South Western Sydney Clinical School, Faculty of Medicine, University of New South Wales Australia, 2School of Medicine, Western Sydney University, 3Correlative Microscopy Group, Ingham Institute for Applied Medical Research, 4Electron Microscopy Laboratory, Department of Anatomical Pathology, Sydney South West Pathology Service, New South Wales Health Pathology, 5School of Medical Sciences, Faculty of Medicine, University of New South Wales Australia

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מתוארת שיטה לפיה ניתן להשתמש בננו-חלקיקי נקודה קוונטית (QD) למחקרים אימונוציטוכימיים קורלטיביים של רקמת פתולוגיה אנושית משובצת אפוקסי. אנו משתמשים ב-QDs מצומדים של שברי נוגדנים מסחריים המומחשים על ידי מיקרוסקופ אור פלואורסצנטי בשדה רחב ומיקרוסקופ אלקטרונים שידור.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

שיטה מתוארת לפיה נקודה קוונטית (QD) חלקיקים יכולים לשמש ללימודי immunocytochemical גומלים של רקמות הפתולוגיה אנושיות באמצעות מיקרוסקופ אור פלואורסצנטי widefield במיקרוסקופ אלקטרוני הילוכים (TEM). כדי להדגים את הפרוטוקול לנו immunolabeled סעיפי אפוקסי ultrathin של גידול somatostatinoma האנושי באמצעות נוגדן ראשוני סומטוסטטין, ואחריו נוגדנים משני biotinylated ויזואליזציה עם מצומדות streptavidin 585 ננומטר קדמיום-סלניום (CdSe) נקודות קוונטיות (QDs). הסעיפים הם רכובים על רשת הדגימה TEM ממוקם אז בשקופית זכוכית להסתכלות על ידי מיקרוסקופ אור פלואורסצנטי widefield. במיקרוסקופ אור מגלה תיוג QD 585 ננומטר כמו קרינה כתומה בהירה ויוצרת דפוס נקודתית בתוך הציטופלסמה התאים הסרטניים. בשעה נמוכה הגדלה אמצע טווח על ידי מיקרוסקופ אור דפוס התיוג ניתן להכיר בקלות את רמת התיוג שאינו ספציפי או רקע העריכה. זהו קריטיצעד לפרשנות הבאה של דפוס immunolabeling ידי TEM וערכה של ההקשר מורפולוגיים. הסעיף אותו דבר ואז מחק יבש שנצפה על ידי TEM. בדיקות QD נראות תצורפנה חומר אמורפי כלול גרגרי פרשת פרט. תמונות נרכשות מאותו האזור של (ROI) העניין לראות על ידי מיקרוסקופ אור לניתוח גומל. מקביל תמונות מודליות כל יכול אז להיות מעורבב כדי כיסוי נתוני קרינה על ultrastructure TEM של האזור המתאים.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אור גומל במיקרוסקופ אלקטרונים (קלם) הוא גישה חזקה לניתוח אירועים דינמיים חולפים 1, 2 אירועים נדירים, 3 ומורכב 4 מערכות. יש תמורות רבות טכניות שונות זמינות 5 תלויים השאלה נשאלת אולם דרישה נפוצה היא כי אותו המבנה יחיד מדגם 6 הוא צלם ידי שיטות מיקרוסקופיה מרובות. הגישה שלנו בפרט כדי קלם פותחה לחקר רקמות הפתולוגיה האנושית ארכיוני והמקרה משמש כאן כבר מאופיין היטב שפורסמו בעבר 7. המטרה הייתה קודם כל, על מנת למקסם את הנתונים אנליטיים מ ביופסיה אחת או מדגם כירורגית ושנית, להשתמש במיקרוסקופ אור פלואורסצנטי כדי לעזור להבהיר את ההקשר של דפוס תיוג immunocytochemic....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

רקמות 1. Dissection ו קיבוע

  1. Dissection רקמות
    1. לנתח חתיכות רקמת ביופסית דגימה או רקמת גידול resected בניתוח.
      ההערה: הרקמה השתמשה במחקר זה הייתה קבוע שגרתי בפורמלין אבל רקמה טריה היא גם מתאימה. בחרנו שטח אשר ודיווח על ידי פתולוג אנטומיים להכיל גידול somatostatinoma לאחר צביעה היסטולוגית שיגרתית immunostaining אנטי-סומטוסטטין (לא מוצגים).
    2. השתמש פיסות רקמה לא גדולות יותר מ 1.0 מ"מ

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הדגימה הגידול somatostatinoma נעשה שימוש במחקר זה מורכב תאים סרטניים להרכיב מבנים ductal מעורבב עם רקמת stomal collagenous. על ידי מיקרוסקופ אור פלואורסצנטי, תאים סרטניים בודדים שהכיל גרגרי הפרשה בשפע הראו תיוג חיובי עבור ההורמון סומטוסטטין. גרעינים הופיעו חורים כהים עם תיוג הלא ספציפי מזערי לזיהוי (איור 1). בהגדלות נמוכות, קרינה כתומה עזה פרטני variably נתפסה בציטופלסמה של תאים סרטניים היטב מאופיינים אלה. הצבע הכתום של קרינה נקבע .......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מחקר זה הוכיח את התועלת הפוטנציאלית של QDs כמו בדיקות אוניברסליות ללימודים קלם. חלקיקי QD 585 ננומטר בשימוש הראו קרינה בהירה ויציבה כאשר נצפים על ידי מיקרוסקופ אור widefield ונצפו בקלות על ידי TEM. מחקר קודם על ידי אחד הסופרים הנוכחי הוכיח QDs גם להיות מתאים מיקרוסקופ אור סופר-רזולוציה 7. photostability שלהם היה שימושי במיוחד לתקופות צפייה מורחבות וחשיפות הדמיה ארוכות. QDs יכול לשמש גם עבור אימונוהיסטוכימיה זמנית עם בדיקות בגדלים שונים הפולטים ספקטרום בצבעים שונים בו זמ.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למחברים אין ניגוד אינטרסים לחשוף.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים מבקשים להכיר בתמיכתם של שיאו חואן וו (המעבדה לאימונוהיסטוכימיה) והמחלקה לפתולוגיה אנטומית, שירות הפתולוגיה של סידני דרום מערב (SSWPS), NSW Health Pathology, ליברפול, ניו סאות' ויילס, אוסטרליה.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
נתרן קקודילאטProscitechC0205כימיקל מזיק
אוסמיום טטרוקסידProscitechC010השתמש רק במכסה אדים
אורניל אצטטUnivar-Ajax569כימיקל מסוכן
אתנול 100%פרוניןJJ008
אצטון 100%פרוניןJJ006
ERL 4221ProscitechC056
DER 732ProscitechC047
NSAProscitechC059
DMAEProscitechC050
נתרן metaperiodateAnalar BDH10259
נוגדן אנטי סומטוסטטיןDakoA0566
מדלל נוגדניםDakoS3022
Qdot 585 Streptavidin Conjugate InvitrogenQ10113MP
ביוטינילציה עיזים אנטי ארנב נוגדן IgGSigmaB7389-1ML
גלוטרלדהיד 50%EMS16320
סרום עיזים רגילInvitrogenPCN5000
PBS "Dulbecco A"Oxoid 
BSAc (10%)Aurion900.022
ParafilmPechiney PPM
רצועות מחוון pH (pH 2.0 - 9.0)Merck1.09584.0001
MicromoldsProscitechRL063
סכין יהלוםדיאטוםUltra 45
מיקרוסקופ אלקטרונים שידורFEIMorgagni 268D
מיקרוסקופ אור פלואורסצנטיקרל זייסאקסיוסקופ A1
רשתות 300 רשת ניקל (מוט דק)Agar ScientificG2740N
UltramicrotomeRMCPowertome
TEM תוכנת בקרת מצלמההדמיה רכהAnalySISגרסה 3.0
תוכנת עיבוד תמונהAdobe Systems PhotoshopCS2
BR0014G מערכת משולב

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Kukulski, W., Schorb, M., Welsch, S., Picco, A., Kaksonen, M., Briggs, J. A. Correlated fluorescence and 3D electron microscopy with high sensitivity and spatial precision. J Cell Biol. 192 (1), 111-119 (2011).
  2. Introduction to correlative light and electron micr....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Correlative Light Electron MicroscopyQuantum Dot NanoparticlesImmunocytochemical StudiesTransmission Electron MicroscopyWidefield Fluorescence MicroscopySomatostatinoma Tumor TissueStreptavidin Conjugated QDsNickel Grid PreparationAntibody Labeling ProtocolFluorescence TEM Overlay

Related Articles