אופטימיזציה גודל המצרפי Microwells עבור מבוססי השעיה בידול לב של תאי גזע אנושיים pluripotent

Summary

בשיטות מקובלות ליזום בידול מצטבר המבוסס השעית לב של פלוריפוטנטיים אדם נובע תאים (hPSCs) הם הטרידו עם ההטרוגניות תרבות ביחס גודל וצורה המצרפי. כאן אנו מתארים שיטה חזקה לבידול לב העסקת microwells ליצור שבשליטת הגודל hPSC אגרגטים בתרבית בתנאים לקידום לב.

Abstract

התמיינות לבבית של תאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים (hPSCs) מתבצעת בדרך כלל באגרגטים של תאי תרחיף. היווצרות מצטברת קונבנציונלית של hPSCs כרוכה בפירוק מושבות תאים לגושים קטנים יותר, עם בקרת גודל של הגושים נשלטת בגסות על ידי פיפטינג של תרחיף התא עד להשגת גודל הגוש הרצוי. אחד האתגרים העיקריים של התמיינות לבבית קונבנציונלית מבוססת אגרגטים של hPSCs הוא שההטרוגניות התרבית וחוסר הארגון המרחבי מובילים לתפוקת קרדיומיוציטים משתנה ולא יעילה. אנו ואחרים דיווחנו בעבר כי ניתן לווסת את הגודל המצטבר של תאי גזע עובריים אנושיים (hESC) כדי לייעל את יעילות האינדוקציה הלבבית. התמודדנו עם אתגר זה על ידי שימוש בגישה ניתנת להרחבה ומבוססת מיקרובאר כדי לשלוט בפרמטרים פיזיקליים של היווצרות אגרגטים, במיוחד גודל וצורה מצטברים. השיטה שאנו מתארים כאן מורכבת מצבירה כפויה של מספרי hPSC מוגדרים במיקרובארות, ותרבית לאחר מכן של אגרגטים אלה בתנאים המכוונים אינדוקציה לבבית. ניתן לשנות את קנה המידה של פרוטוקול זה בקלות בהתאם לגודל ומספר הבארות המשמשות. באמצעות שיטה זו, אנו יכולים להשיג באופן עקבי תפוקות תרבית עם תדרי קרדיומיוציטים גדולים מ-70%.

Introduction

תרבית תאים במבחנה יכולה להתבצע תחת מספר שיטות, אבל בדרך כלל מתבצע בין אם דו ממדי תנאים חסידים או בתנאי השעיה תלת ממדים שיותר לשחזר באופן מלא במערכות vivo. כתוצאה מכך קיימת מגמה הולכת וגוברת בתחומים רבים של מחקר לפיתוח שיטות חזקות ליצירה תלת ממדי בונת רקמות. בתרחישים בם סוגי תהליכים בתא דורשים מטריקס תומך (ECM) אותות משטח דבקים, תלת ממד תרבות עשויה להיות מופעלת באמצעות בונת פיגום, שבו תאים בתרבית על או בתוך אקסוגניים תמיכת מטריקס ^1. תאים ותהליכים שאינם דורשים הדבקה למטריצה תומכת יכולים להתבצע השעיה כמערכות unscaffolded המורכבות בעיקר או באופן בלעדי של תאים (אשר עשוי מכן להמשיך ליצור מטריצות אנדוגני משלהם) ^2,3. כאן, אנו מציגים פרוטוקול o בידול לבתאי גזע פלוריפוטנטיים אדם f (hPSCs - תאי גזע מסוגלים להפוך לכל סוג תא בגוף, אם ממקורות עובריים או אחרים) מבוקרים בגודל, מדים, אגרגטים unscaffolded.

דיפרנציאציה של hPSCs כמו אגרגטים השעיה סובלת וריאציות גדולות גודל מצטבר הוא בתוך לרוץ בין ריצות. השתנות זו היא תוצאה של השיטה המועסקת בדרך כלל כדי ליצור אגרגטים אלה, אשר כרוך ניתוק מכאני של מושבות תאים. כדי להפחית השתנות זו, מספר גישות שמשו לשלוט במספר תאים לכל סך הכל וכן בקוטר המצרפי ואחיד. דוגמאות כוללות היווצרות של אגרגטים צינורות microcentrifuge ⁴ או כפי תלוי טיפות ^5, micropatterning מוגדרות דו ממדי מושבות hPSC ⁶ אז מה שיכול להיות מועבר ההשעיה, או צנטריפוגה של תאים לתוך U- או V-תחתון צלחות רבות גם ^{7,8, 9.} עם זאת, כל אלה approaches מוגבל על ידי התפוקה שלהם הנמוכה של דור המצרפי. ובכן מבוססות מערכות לנקוט גישה דומה למערכות צלחת V-תחתון, אולם הגודל הקטן יותר של microwells (בפרוטוקול זה שלכל אחד מהם ברוחב של 400 מיקרומטר) מאפשר את הדור של מספרים גדולים יותר של אגרגטים אחיד מתרבות-צלחת אחת גם (בקוטר רמת ~ 15.5 מ"מ המכיל ~ 1,200 microwells) מאשר היה להיווצר מתוך צלחת V-התחתון כולו ^10. ובכן מבוססי היווצרות המצרפי נעשה שימוש בכמה הגדרות כולל בידול של hPSCs כדי Ectodermal ^11, endodermal ^12, mesodermal ¹³ ו extraembryonic ¹⁴ גורלות; chondrogenesis מתאי גזע mesenchymal ^15; דור של מצעים אחידים להקרנה טוקסיקולוגית ^16; וחקירות של mechanobiology ^17.

אחד האתגרים העיקריים בפיתוח פרוטוקולים הייצור חזקים לייצור hPSC הנגזרות cardiomyocytes כבר וחוסר השחזור יעיל בידול לב בין ריצות. הראינו בעבר ששונה זו ניתן לייחס ההטרוגניות באוכלוסיית hPSC החלה, המהווה הוא עצמי חידוש hPSCs ומבדל תאים המבטאים גנים הקשורים בידול האנדודרם עצבי ^6,18. איתותי המופרשים מתאי המבדילים הללו להשפיע אינדוקציה הלב. באופן ספציפי, endoderm extraembryonic מקדם אינדוקצית לב, ואילו אבות עצביים לעכב אינדוקצית לב. עם צבירת hPSC, תאים בתוך להבדיל האוספים ומארגנים כך hPSCs המובחן מוקפים בשכבת תאי extraembryonic endoderm המתפתחים על פני השטח המצרפי ^13. על ידי שליטת גודל מצטבר, אנו יכולים לווסת את היחס של תאי האנדודרם וישכנע לב כדי hPSCs המובחן (שטח פן יחס נפח) לייעל את היחס הזה לזירוז לב מרבי ^13.

Protocol

1. הכנת רכיבים בינוני

1. כן לשטוף בינוני. לכל 100 מ"ל של DMEM / F12, להוסיף 1 מ"ל של 100x פניצילין / סטרפטומיצין (עט / סטרפטוקוקוס), 1 מ"ל של 100x L- גלוטמין, ו -5 מ"ל של החלפת בסרום.
2. הכן את מדיום אינדוקצית לב בסל הגדרה הכימית פי הוראות היצרן.
3. כן ריאגנטים המניות הבאים למדיה אשר ישמשו בפרוטוקול זה.
   1. L-Ascorbic Acid: כן פתרון מניות של 5 מ"ג לכל מיליליטר ב 4 מעלות צלזיוס, מים מזוקקים טהורים סטרילי בתוך שפופרת חרוטים.
      1. השאירו את הפתרון הזה על הקרח מערבולת הצינור מעת לעת עד המומס הוא נמס לגמרי. סנן לעקר את הפתרון חומצה אסקורבית באמצעות מסנן מזרק 0.22 מיקרומטר.
      2. הכן 1 aliquots מ"ל של תמיסת חומצה אסקורבית ולאחסן aliquots אלה ב -20 ° C. השתמש aliquot טרי מופשר כל מדיום זמן מוכן.
   2. ביום הכנה בינונית, לדלל 13 μl של monothioglycerol (MTG) ב 1 מ"ל של מדיום אינדוקציה בסל לב. בטל MTG בשימוש, בדילול מלא.
   3. הכן 1 aliquots מ"ל של transferrin (30 מ"ג / מ"ל) כדי לאחסן ב -20 ° C. חנות מופשרת aliquots ב 4 מעלות צלזיוס למשך עד 3 חודשים.
   4. הכן 4 חומצה הידרוכלורית מ"מ (HCl) המכיל 0.1% שור סרום אלבומין (BSA). במנדף קטר, להוסיף 30 μl של 6.0 פתרון N HCl 50 מ"ל מים מזוקקים טהורים לחלוטין. מסנן לעקר את הפתרון באמצעות מזרק מסנן 0.22 מיקרומטר. הוסף 2 מ"ל של תמיסת BSA 25% לפתרון HCl 50 מ"ל.
   5. כן בופר פוספט (PBS) המכיל 0.1% BSA. הוסף 20 μl של פתרון BSA 25% לכל מ"ל PBS.
   6. כן האדם העצם המוךפו"גנטי שהולך חלבון 4 (BMP-4) פתרון מניות (10 ng / μl). ממיסים 10 מיקרוגרם lyophilized BMP-4 ב 1 מ"ל של 4 פתרון חיץ מ"מ HCl המכיל 0.1% BSA. כן 50 μl aliquots לאחסן ב -20 ° C.
   7. כן 2 פקטור גדילת פיברובלסטים אדם (bFGF) פתרון מניות(10 ng / μl). ממיסים 10 מיקרוגרם lyophilized bFGF ב 1 מ"ל של בופר פוספט (PBS) המכיל 0.1% BSA. כן 50 μl aliquots לאחסן ב -20 ° C.
   8. הכן פקטור הגדילה של אנדותל כלי דם האדם (VEGF) פתרון המניות (5 ng / μl). ממיסים 5 מיקרוגרם VEGF lyophilized ב 1 מ"ל של PBS המכיל 0.1% BSA. כן 50 μl aliquots לאחסן ב -20 ° C.
   9. כן Activin פתרון מניות (10 ng / μl). ממיסים 10 מיקרוגרם lyophilized Activin א '1 מ"ל של PBS המכיל 0.1% שור סרום אלבומין (BSA). כן 50 μl aliquots לאחסן ב -20 ° C.
   10. כן מונע של Wnt הפקה-2 (IWP-2) פתרון מניות (10 מ"מימ). ממיסים 2 מ"ג IWP-2 ב 429 μl דימתיל sulfoxide (DMSO). כן 10 μl aliquots לאחסן ב -80 מעלות צלזיוס.
4. כן בינוני אינדוקצית לב שלם. ל -100 מ"ל של Basal לב אינדוקציה בינונית, מוסיפים 1 מ"ל של 100x פן / סטרפטוקוקוס, 1 מ"ל של 100x L- גלוטמין, 500 μl של transferrin, 1מ"ל של חומצה אסקורבית מופשר טרי, ו -300 μl של MTG. בטל בינוני בשימוש.

2. הכנת צלחת microwell

הערה: כל הצעדים צריכה להתבצע בתוך ארון בטיחות ביולוגית.

1. הוסף 0.5 מ"ל פתרון שטיפה (רכיב בערכה) היטב כל אשר ישמשו על הצלחת. כדי להבטיח כי המגעים פתרון פני השטח כולו בתוך כל microwell, בצנטריפוגה צלחת ב 840 XG למשך 2 דקות.
2. דגירה את הצלחת למשך 30 עד 60 דקות ב RT.
3. לשאוב את פתרון השטיפה מהבארות. לשטוף כל פעמיים גם כדלקמן: הוסף 1 מ"ל של PBS על כל טוב, צנטריפוגה את הצלחת ב 840 XG למשך 2 דקות, ולאחר מכן לשאוב PBS.

3. גיבוש hPSC אגרגטים פלייט microwell

הערה: כל הצעדים צריכה להתבצע בתוך ארון בטיחות ביולוגית.

1. מניחים לשטוף בינוני באמבט מים 37 מעלות צלזיוס.
   הערה: נפח נדרש = 1 מ"ל x מספר בארות של HPSC כי יהיה ניתק.
2. לנתק hPSCs תאים בודדים
   הערה: שלבים אלה מתארים את הניתוק של תאים בתרבית על 6 צלחות היטב - הכרכים מגיבים וניתן לשנותם באופן יחסי עבור פורמטי תרבות אחרים.
   1. לשאוב את המדיום תרבות מכל תרבות hPSC גם דיסוציאציה. יש לשטוף היטב עם כל 1 מ"ל של אנזים דיסוציאציה, ומיד לשאוב האנזים דיסוציאציה מכל טוב.
      הערה: אנזים דיסוציאציה שיורית צריך להספיק כדי לנתק את התאים.
   2. דגירה את הצלחת על 37 מעלות צלזיוס במשך 3 דקות.
   3. הוסף 1 מ"ל של לשטוף בינוני זה טוב מכנית לנתק את התאים מפני השטח בתרבית רקמה על ידי pipetting וואש בינוני עם micropipettor P1000 על פני בתרבית רקמה. אם הניתוק שנראה גושים שלמים ותא להישאר, לעבור את ההשעיה דרך מסנן בנקודה זו.
   4. מעבירים את ההשעיה לתא צינור חרוטי 15 מ"ל ולאחסןהצינור בחממה בעוד שמספר התא מתבצע בשלב הבא.
   5. בצעו ספירת תאים:
      1. לקחת דגימת 10 μl של השעית התא שנאספה בשלב הקודם. הוסף 30 μl של Trypan כחול ומערבבים ההשעיה היטב על ידי pipetting.
      2. העבר 10 μl של Trypan כחול מוכתם תאים לכל מקום משכנו של hemocytometer ולדמיין תחת מיקרוסקופ הפוכה במטרה 10X. ספירת התאים.
   6. מתוצאות ספירת תאים, לחשב כמה בארות ניתן זורעים 1.2 x 10 ⁶ תאים לכל גם צלחת microwell. חישוב צבירת בינוני נדרש זרע התאים ב 1 מ"ל לכל טוב.
   7. כן בינוני צבירה. לכל 10 מיליליטר של מדיום אינדוקצית לב מלא, להוסיף 0.5 μl של פתרון מניות BMP4 (ריכוז סופי = 0.5 ng / ml) ו- Y-27632 ROCK מונע (ריכוז סופי = 10 מיקרומטר).
   8. הסר את צינור חרוטי המכיל את hPSCs מן החממה centrifuge הצינור ב XG 200 במשך 5 דקות. לשאוב את המדיום לשטוף ו resuspend התאים במדיום צבירה בצפיפות של 1.2 x 10 ⁶ תאים לכל מיליליטר.
   9. לשאוב את הפתרון לשטוף PBS מבאר כל צלחת microwell. באמצעות micropipettor P1000, להפיץ זרע 1 מ"ל שווה של השעיה התא היטב כל על צלחת microwell. לזרע מספר רב של בארות, מעת לעת מערבולת השעית התא למנוע שיקוע.
   10. צנטריפוגה את הצלחת ב XG 200 במשך 5 דקות. שים את הצלחת תחת מיקרוסקופ כדי לאשר תאים טוו לתחתית של כל microwell.
   11. דגירה את הצלחת למשך 24 שעות על 37 מעלות צלזיוס חממה 5% CO _2, 5% O ₂ (חוסר חמצן).

4. אינדוקציה הלב שלב 1

1. יום אחד לאחר צבירה (יום 1), להכין את נפח הנדרש בינוני אינדוקציה שלב 1 (24 צלחת היטב, נפח = 1 מ"ל x מספר בארות). עבור 1 מ"ל של שלמהבינוני אינדוקצית לב, להוסיף 1 μl של פתרון מניות BMP4 (ריכוז סופי = 10 ng / ml), 0.5 μl של פתרון מניות bFGF (ריכוז סופי = 5 ng / ml), ו -0.6 μl של Activin A (ריכוז סופי = 6 ng / מ"ל). מניחים את המדיום באמבט מים 37 מעלות צלזיוס במשך 15 דקות לפחות.
2. הסר את צלחת microwell מן החממה. בדוק את אגרגטים תחת מיקרוסקופ. לעומת צבירה שלאחר צנטריפוגות מיד, הם צריכים להופיע שלמים עם קצוות חלקים (יותר עגול פחות מרובע מאשר יום קודם לכן).
3. הסר את supernatant מבלי להפריע אגרגטים בתוך microwells:
   1. החזק את צלחת microwell אופקית ברמה (כלומר., לא להטות אותו). עבור כל טוב על צלחת microwell, הנח את הקצה של micropipettor P1000 על פני השטח של מדיום התרבות על קצה הבאר.
   2. לאט להסיר את המדיום, נזהר שלא להפריע המצרפים בתחתית של microwells. לאחר שהוריד tהוא ברמה בינונית לכ 1 עד 2 מ"מ מפני שטח microwell מרקם, לאט להטות את הצלחת לאסוף בינוני בצד אחד של הבאר (פעם העצמה נמוכה מספיק, בתנועה זורמת מופחתת במידה ניכרת וזה קל יותר להימנע אגרגטים מקבלים הרים מתוך microwells האישי שלהם). לאט פיפטה את המדיום הנותרים הבאר.
4. כדי להוסיף בינוני אינדוקציה טריים שלב 1 תוך הקפדה על אגרגטים להישאר microwells האישיים שלהם: צייר 1 מ"ל של מדיום אינדוקציה שלב 1 עם micropipettor P1000. החזק את קצה פיפטה כנגד הקצה הפנימי של הבאר לאט מאוד לוותר על המדיום אל הקיר הפנימי של הבאר. חזור על הבארות הנותרות.
5. מחזיר את הצלחת אל האינקובטור בתנאי חוסר חמצן במשך 3 ימים.

5. אינדוקצית לב שלב 2

1. ביום 4, במקום לשטוף בינוני (נפח = מספר בארות x 2 מ"ל) באמבט המים 37 מעלות צלזיוס למשך תקופה מינימלית של 15 דקות.
2. הכן את הנפח של בינוני אינדוקציה שלב 2 (נפח = מספר בארות x 1 מ"ל): לכל מ"ל של מדיום אינדוקציה לב מלאה, להוסיף 2 μl של פתרון המניות VEGF (הריכוז הסופי = 10 ng / ml) ו -0.5 μl IWP-2 פתרון מניות (= 5 מיקרומטר ריכוז סופיים). מניחים את המדיום אינדוקציה מוכן שלב 2 באמבט מים 37 מעלות צלזיוס למשך תקופה מינימלית של 15 דקות.
3. בעזרת פיפטה 5 מ"ל סרולוגית, לקצור המצרפים מבאר כל צלחת microwell לאסוף את ההשעיה המצרפי צינור חרוטי 15 מ"ל (לאסוף עד 10 בארות לכל שפופרת 15 מ"ל).
4. אפשר המצרף להתיישב במשך 15 דקות בתוך חממה היפוקסי.
   הערה: שלב זה חשוב להפריד תאים בודדים ופסולת הסלולר מן אגרגטים ללא פגע.
5. לשאוב supernatant בזהירות resuspend המצרפים ב 10 מ"ל של בינוני מחומם מראש לשטוף כדי להסיר ציטוקינים אינדוקטיביים שיורית (למשל, Activin A הוא מולקולת איתות חזק אפילו שיתוף נמוך מאודncentrations).
6. צנטריפוגה אגרגטים ב 50 XG למשך 2 דקות. לשאוב supernatant. Resuspend המצרפים pelleted במדיום אינדוקציה 2 מחומם מראש.
7. מעבירים את ההשעיה המצרפי מצורף אולטרה-נמוכה 24 גם צלחת (אולא) ב 1 מ"ל לכל טוב. שים המצרפים מתחת למיקרוסקופ כאחידות, צבירי תאים חזקים. דגירה בתנאי חוסר חמצן עד יום 6.

6. אינדוקציה הלב שלב 3

1. ביום 6, להכין את הנפח של בינוני אינדוקציה שלב 3 (נפח = מספר בארות x 1 מ"ל). עבור 1 מ"ל של מדיום אינדוקציה לב מלאה, להוסיף פתרון המניות 2 μl VEGF (הריכוז הסופי = 10 ng / ml), ו -0.5 μl של פתרון מניות bFGF (ריכוז סופי = 5 ng / ml). מניחים בינוני אינדוקציה שלב 3 מוכן באמבט מים 37 מעלות צלזיוס למשך תקופה מינימלית של 15 דקות.
2. השתמש פיפטה 5 מ"ל סרולוגיות להעביר את אגרגטים ל -15 מ"ל צינורות חרוטי, איגום עד 10 מ"ל של המצרפיים לכל צינור.
3. אפשר 10 דקות עבור אגרגטים להתיישב. לשאוב supernatant ו resuspend המצרפים במדיום אינדוקציה שלב 3 מחומם מראש. בעזרת פיפטה 5 מ"ל סרולוגית, להפיץ מחדש המצרפים לתוך צלחת 24 גם אולא ב 1 מ"ל לכל טוב.
4. ביום 10, להכין את הנפח של בינוני אינדוקציה שלב 3 (נפח = מספר בארות x 1 מ"ל) לפי שלב 6.1.
5. השתמש פיפטה 5 מ"ל סרולוגיות להעביר את אגרגטים ל -15 מ"ל צינורות חרוטי, איגום עד 10 מ"ל של אגרגטים לכל צינור.
6. אפשר 10 דקות עבור אגרגטים להתיישב. לשאוב supernatant ו resuspend המצרף בשלב 3 אינדוקציה בינונית. בעזרת פיפטה 5 מ"ל סרולוגית, להפיץ מחדש המצרפים לתוך צלחת 24 גם אולא ב 1 מ"ל לכל טוב.
7. דגירה בתנאי חוסר חמצן במשך ימים. ביום 12, להתחיל דוגרי התאים ברמות חמצן normoxic לשארית תקופת התרבות (37 ° C, 20% O _2, 5% CO _2).
   הערה:לאחר נקודת זמן זו, תאים הם כבר לא מתורבתים בתנאי חוסר חמצן.
8. חזור על חילופי בינוני מלא זה (שלבי 6.2 ו -6.3) כל 4 ימים, החלו ביום 14 עד קציר תאים (בדרך כלל, ריכוזי cardiomyocyte שיא נצפים לאחר יום 14 של בידול).

7. ניתוח cytometry זרימה של Cardiac Troponin T (cTnT) תדירות הביטוי של פלט תרבות microwell

1. לנתק את אגרגטים כדלקמן:
   1. השתמש פיפטה סרולוגיות 5 מ"ל להעביר 1 גם של אגרגטים על צינור חרוטי 15 מ"ל. צנטריפוגה אגרגטים ב 50 XG למשך 2 דקות ובזהירות לשאוב supernatant.
   2. הוסף 1 מ"ל של טרי מומס 1 מ"ג / מ"ל ​​Collagenase פתרון Type II כדי המצרפים. מעבירים את ההשעיה המצרפי צינור 1.5 מ"ל microcentrifuge. דגירה אגרגטים Collagenase Type II הלילה בטמפרטורת החדר.
   3. למחרת, השתמש micropipettor P1000 בעדינות כדי לנתק את אגרגטיםלתוך השעית תא בודדת הומוגנית. אם המצרפים לא לנתק בקלות, ליישב את אגרגטים, לשאוב supernatant, דגירה אגרגטים 700 μl של אנזים דיסוציאציה 1 עד 2 דקות ב RT. בעדינות פיפטה המצרפים 1 עד 2 פעמים עם micropipettor P1000 לנתק.
   4. לדלל את אנזים דיסוציאציה: הוסף 700 μl של שטפי בינוני המכיל 14 μl של 1 מ"ג / פתרון המניות DNAse מ"ל. לקחת דגימה 10 μl לבצע ספירת תאים, צנטריפוגות ההשעיה הנותרים באמצעות microcentrifuge הספסל העליון ב XG 300 במשך 2 דקות.
2. בצע ספירת תאים: כתם מדגם הספירה 10 μl עם נפח שווה של כחול Trypan ולספור באמצעות hemocytometer.
3. הסר את צינור 1.5 מ"ל microcentrifuge המכיל את התאים הנותרים מן microcentrifuge. לשאוב supernatant ו resuspend התאים, בריכוז של 200,000 ל -500,000 תאים לכל 100 μl, ב הנקס מאוזן תמיסת מלח המכיל2% בסרום שור עוברי (HF).
4. עבור כל תנאי, להעביר 100 μl של ההשעיה תא לכל היטב 2 בארות של צלחת 96-היטב (גם אחד יהיה מוכתם עם נוגדן cTnT והשני יהיה שליטה נוגדנים משני).
5. צנטריפוגה את הצלחת ב 300 XG למשך 2 דקות. הסר את supernatant עם micropipettor רב.
6. תקן את התאים: הוספת 200 μl של פתרון קיבוע (רכיב בערכה) לכל היטב דגירת הצלחת במשך 15 דקות ב RT.
7. צנטריפוגה את הצלחת ב 300 XG למשך 2 דקות. השתמש micropipettor רב כדי למשוך את supernatant בזהירות מבארות. השלך את supernatant מיכל פסול paraformaldehyde.
8. לשטוף את התאים הקבועים פעמים: הוספת 200 μl של HF היטב כל אחד. צנטריפוגה את הצלחת ב 300 XG למשך 2 דקות. לשאוב supernatant, וחזור על השלב לשטוף פעם נוספת. תאים קבועים ניתן לאחסן עד שבוע ב HF על 4 מעלות צלזיוס.
9. Permeabilize התאים:
   1. צנטריפוגה את הצלחת ב 300XG למשך 2 דקות.
   2. הוספת 100 μl של פתרון Permeabilization (רכיב בערכה) היטב כל דגירה את הצלחת בטמפרטורת החדר למשך 5 דקות.
   3. צנטריפוגה את הצלחת ב 300 XG למשך 2 דקות ו לשאוב supernatant.
10. להכין תערובת אמן אנטי-cTnT ב HF בריכוז האופטימלי עבור ממספרת נתון (הדילול האופטימלי צריך להיקבע על ידי טיטרציה ובדרך כלל נע בין 1: 500 עד 1: 2,000).
11. עבור כל תנאי (2 בארות לכל מצב), להוסיף 100 μl של מיקס מאסטר גם אחד (מדגם מוכתם) ו -100 μl של HF הרגיל לבאר האחרים (שליטת נוגדנים משני). דגירת התאים ב 4 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות.
12. צנטריפוגה התאים ב XG 300 במשך 2 דקות. לשאוב supernatant ולהוסיף 200 μl של HF לכל טוב. חזור על שלב זה לשטוף פעם נוספת.
13. להכין תערובת מאסטר של נוגדנים משני. העבר בהיקף של HF שמקביל 100 μl לכל היטב (שליטה נוגדנים משניcTnT מוכתם) מטופלת. הוסף 1 μl של נוגדנים משני אנטי עכבר APC עז לכל 200 μl של HF (1: 200 דילול).
14. כתם הדגימות. הוספת 100 μl של פתרון מכתים היטב כל (הן את השליטה נוגדנים משני ובארות אנטי cTnT מוכתם). דגירה תאים בחושך על 4 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות (לשמור על צלחת מכוסה או בחושך לאחר הוספת נוגדנים משני ניאון כדי להימנע photobleaching).
15. צנטריפוגה התאים ב XG 300 במשך 2 דקות. לשאוב supernatant ולהוסיף 200 μl של HF לכל טוב. חזור על שלב זה לשטוף פעם נוספת.
16. העברת דגימות 5 מ"ל עגול זרימת התחתונה cytometer צינורות ניתוח ולבצע cytometry הזרימה עבור האות בערוץ APC באמצעות פרוטוקולים סטנדרטיים עבור המכשיר ^19.

Results

אגרגטים שבשליטת גודל של hPSCs יכול להיווצר ביעילות באמצעות מערכת microwell, תלוי רק ריכוז של תאים ואת שטח microwell. בעקבות צנטריפוגה קצר, המספרים המתאימים של תאים (1,000 בפרוטוקול זה) הם הביאו יחד בכל microwell (איור 1 א). חשוב לציין, תאים אלה מחדש קשרים תאיים בתוך 24 שעות, ולא צריך עוד למלא באר, אך הן מופיעים אגרגטים קומפקטיים עם קצוות חלקים (איור 1 ב). אגרגטים אלה מספקים את החומרים המוצא לבידול נוסף לקראת גורל לב. אם התאים אינם מהווים אשכולות חזקים, זה מצביע על מוות של תאים אפשריים בעקבות התנתקות reaggregation, ואת התאמתו של ריכוזי passaging ורוק התא בודדים מעכב עבור קו תא מסוים צריכים להיבחן. שלושת הימים הבאים microwells להראות שינוי קטן מורפו המצרפי משעמם, למרות צמיחה כמה ניכרת. כאשר יוסר microwells, אגרגטים צריכים לשמור ההקפה, מורפולוגיה צפופה ולהיות בסדר גודל דומה לזה (איור 1 ג). תרבות 24 גם צלחות אולא תאפשר הרחבת תא נוספת וצמיחה.

במשך היום 8, לאחר החשיפה הראשונה איתות Activin, ועיכוב Wnt, המצרפים יתחילו להופיע כמו אגרגטים גדולים ובהירים (1D איור). במהלך תקופה זו, פסולת הסלולר ניכרת תהיה ברורה בתחתית כל טוב יש להסיר על ידי המאפשר אגרגטים להתיישב לפני הסרת תקשורת. לפעמים, אגרגטים רבים מךתןז. זה לא לעכב את הבידול של אגרגטים אחרים הבאר, אם כי אלה "אגרגטים סופר" נוטים שלא להציג את השינויים המורפולוגיים לראות עם אגרגטים קטנים נוטים פחות לעבור התמיינות מלאה.

"Jove_content" FO: keep-together.within-page = "1"> תוצאות בידול המשך שינויים מורפולוגיים בולטים המצרפים עם גודל מוגבר והופעת האזורים סיביים מאורגנים. במשך היום 12, אגרגטים קבלנות ניתן לצפות. אלה תמיד יהיו מורכבים של תאים גדולים, שקופים ולעתים קרובות כוללים תאי מטריקס נרחבים מחוץ במצטבר (איור 2). בעוד צירים המצרפי-רחבים מצביעים אבחון מוצלח, ביטוי סמן לב עשוי להיות גם ציין אגרגטים שאינו מופיעים להתכווץ. בעקבות ניתוק של אגרגטים immunolabeling, רוב התאים יהיה חיובי עבור cTnT סמן cardiomyocyte ידי cytometry זרימה (איור 3). הביטוי של סמן זה הוא יציב לתאים ועלולים להיות שנצפה אגרגטים מאוחר ככל יום 19 של בידול.

1.jpg "/>
איור 1: ציר הזמן של hPSC הבדיל כלפי גורל לב מיד לאחר צבירה, תאים כמעט ממלאים כל microwell (א).. יום אחד מאוחר יותר, המצרפים להופיע מרוכז וחלקה (B). מורפולוגיה זו נמשכת גם כאשר אגרגטים יוסרו מן microwells ו מצופה לתוך צלחות גם (C). במשך היום 8, אגרגטים מתחילים להתרחב להופיע בהיר (ד '). סרגל קנה מידה:. 250 מיקרומטר אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 2: אגרגטים בגין המתקשרים יום 12 של בידול לאחר שישה ימים Cardiac אינדוקציה שלב 3 בינוני, התכווצויות המצרפי-רחב כוחנית נצפו (הפאנל העליון:. להירגעation, פאנל באמצע: התכווצות). הפנל התחתון נגזר הפחתת הלוחות הגבוהים ובינוניים, עם רוב ההבדלים משמעותיים המופיעים כשחור או לבן (ראשי חץ). סרגל קנה מידה:. 250 מיקרומטר אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 3:. Immunolabeling עבור Cardiac Troponin T ב הבדיל hPSCs באותו יום 17, רוב התאים הם חיוביים עבור T טרופונין לבבי ידי cytometry זרימה (היסטוגרמה מלא). מוצג גם הם תאים מוכתם נוגדנים משני בלבד (היסטוגרמה ללא מילוי). נא ללחוץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

Discussion

זה נצפה כי בידול הלב ביותר של תאי גזע פלוריפוטנטיים הוא תהליך משתנה מאוד. אמנם זה לא מפתיע כי שורות תאים שונות להפגין נטיות שונות עבור קיבולת בידול כדי סוגי תאים מסוימים, היא נצפתה כי יעילות בידול הלב משתנה באופן דרמטי בין לשכפל פועל באמצעות באותו תא קו ^6. הפרוטוקול המתואר כאן כתובות מקור עיקרי אחת מהשונות ידי ישירות השליט את המספר הסלולרי קלט לכל המצרפי. כדי לצמצם עוד יותר השתנות בין ריצות, מומלץ כי קווי hPSC המותאמים passaging תא בודד משמשים, כמו צורה זו של תוצאות הרחבה ותחזוקת hPSC באוכלוסיות פלוריפוטנטיים עקביות יותר ביחס תדרי ביטוי של סמני pluripotency (למשל, Oct4, Nanog, tra-1-60, וכו.).

הפרוטוקול כפי שנכתב כאן מציין גודל כולל של 1,000 תאים עבור oאינדוקצית לב ptimal משורת תאי גזע עוברית הס-2. כדי להחיל בפרוטוקול זה כדי שורות תאים שונות, זה קריטי, כי מסך גודל מצטבר ראשוני שיש לבצע כדי לקבוע את גודל המצטבר האופטימלי ספציפי שורת תאים. אמנם זה לא משפיע על הנהלים ישירות להיות אחריו כאן, אנו מזכירים לקורא שמשנה בגודל המצרפי צפיפות תאים הכוללות צפויים להשפיע אספקת חמצן. זה עשוי להיות שיקול רלוונטי ביישומים במורד הזרם. בנוסף, מוות של תאים אפופטוטיים היא דאגה במהלך דיסוציאציה של hPSCs תאים בודדים. לכן, חשוב להבטיח כי מעכב ROCK הוא נוכח במהלך צבירת תא כפיית microwells. לבסוף, זה קריטי, כי ביום 4 של בידול המצרפים נשטפים היטב כדי להסיר עקבות Activin A, נוכח בינוני 1 אינדוקציה, לפני resuspension אינדוקציה 2 בינוני. לאחר יום 4 של בידול, Activin מקדם בידול האנדודרם על החשבון טווהאינדוקציה Derm ^20.

היישום העיקרי של שיטה זו הוא להקרין בגדלים המצרפי המקדמים בידול הלב ביותר. עם זאת, אחת המגבלות של הטכניקה הנוכחית היא כי אתה עשוי להתקשות הייצור בקנה מידה לב לרמות רלוונטיות קלינית באמצעות צלחות microwell. עד בסולם של בידול לב בדרך כלל מתבצע בתנאי תרבות בתפזורת bioreactors השעיה עורר ^21. לכן, ברגע שמערכת microwell נעשה שימוש כדי לקבוע טווחים מקובלים של גודל מצטבר לזירוז הלב ביותר, הצעד הבא בהיקף של עד הוא לקבוע מהירויות מאיצות bioreactor שיכול ליצור את הגודל מצטבר תא הרצוי.

אחד ההבדלים המשמעותיים של טכניקה זו ביחס לשיטות אחרות לבידול לב המצרפי מבוסס הוא בכך שהוא מאפשר חקירות ישירות לתוך ויסות את ההשפעות של איתות אנדוגני אגרגטים וכןשיתוף התרבות של סוגי רקמות אינדוקטיביים / מעכבות עם hPSCs ב ^-13 המצרפי. אלו סוגים של חקירות יכולים להודיע ​​פיתוח תהליך ייצור לב בקנה מידה גדולה.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
ארון
פיפטות סרולוגיות
(5 עד 25 מ"ל)
שואב שואב
או פיפטות
15 ו-50 מ"ל צינורות חרוטיים
מכסה אדים
0.22 ומיקרו; מסנן
m 5% CO2, 5% O2, וחממת תרבית תאים מבוקרת לחות			אינקובטור היפוקסי (דל חמצן)
5% CO2, 20% O2, ואינקובטור תרבית תאים מבוקרת לחות
צנטריפוגה במהירות נמוכה עם רוטור דלי מתנדנד המצויד במחזיק צלחות
מיקרו-פיפטורים P2, P20, P200 ו-P1000 וטיפים נלווים
מיקרוסקופ הפוך עם מטרות פאזה של 4X, 10X ו-20X
חיבור אולטרה-נמוך (ULA) 24 לוחות באר	Corning/Costar	3473
צינורות מיקרוצנטריפוגה
מיקרוצנטריפוגה ספסל מיקרוצנטריפוגה
L-חומצה אסקורבית	Sigma-Aldrich	A4403
מים מזוקקים סטריליים אולטרה-טהורים	Sigma-Aldrich	W3500
מערבולת
קרח
-20 מעלות; מקפיא
מונותיוגליצרול	סיגמא-אולדריץ'	M6145	רעיל; מומלץ מאוד להשתמש ב-MTG כדי למזער את החמצון עקב פתיחה חוזרת. ניתן לאחסן Aliquots בטמפרטורה של 4 מעלות; C עד 3 חודשים, -20 ו-deg; C מומלץ לאחסון לטווח הארוך.
StemPro-34 בינוני	תרמו פישר סיינטיפיק	10639-011	מדיום אינדוקציה לבבי בסיסי; התוספת מאוחסנת ב-20 מעלות; C והמדיום הבסיסי ב -4 מעלות צלזיוס.
טרנספרין	רוש	10652202001
BMP-4	R& D Technologies	314-BP
bFGF	R& D טכנולוגיות	233-FB
VEGF	R& D Technologies	293-VE
Activin A	R& D Technologies	338-AC
IWP-2	ריאגנטים ישירים	57-G89
פוספט חוצץ מלח (PBS)	Thermo Fisher Scientific	14190
אלבומין סרום בקר (BSA)	Thermo Fisher Scientific	15561
חומצה הידרוכלורית	סיגמא-אולדריץ'	258148
דימתילסולפוקסיד קורוזיבי (DMSO)	סיגמא-אולדריץ	D2650
DMEM/F-12	תרמו פישר סיינטיפיק	12660
100x פניצילין/סטרפטומיצין	תרמו פישר סיינטיפיק	15140
100x L-גלוטמין	תרמו פישר סיינטיפיק	25030
החלפת סרום נוקאאוט	Thermo Fisher Scientific	10828010
TrypLE Select	Thermo Fisher Scientific	12563	אנזים דיסוציאציה
המוציטומטר
טריפן כחול
Aggrewell 400 צלחות	StemCell Technologies	27845	צלחות
Microwell תמיסת שטיפה Aggrewell	StemCell Technologies	7010	תמיסת שטיפה Microwell
Y-27632 מעכב ROCK	Tocris	1254
קולגנאז סוג II	סיגמא-אולדריץ'	C6885
תמיסת מלח מאוזנת של האנק	Thermo Fisher Scientific	14025092
סרום בקר עוברי	Thermo Fisher Scientific	12483
צלחת באר 96 (לצביעה של FACS)
Intraprep Permeabilization Reagent	Beckman Coulter	IM2389	Kit עם 2 חלקים: תמיסת קיבוע ותמיסת פרמביליזציה;
נוגדני cTnT	רעילים Neomarkers	MS-295
עז נגד עכבר-IgG APC נוגדןThermoFisher	בדיקות מולקולריות	A865
5 מ"ל צינורות ציטומטריה זרימה תחתונה עגולה	תלוי