סידן הדמיה ב<em&gt; תסיסנית</em&gt; ב ביצת הפעלה

סיכום

מאמר זה מתאר פרוטוקול לשעבר vivo להתאמה המאפשר הדמיה Ca ²⁺ במהלך ההפעלה ביצה תסיסנית.

תקציר

הפעלת ביצית היא תהליך אוניברסלי הכולל סדרה של אירועים המאפשרים לביצית המופרית להשלים מיוזה וליזום התפתחות עוברית. היבט אחד של הפעלת ביציות, שנשמר בכל האורגניזמים שנבדקו, הוא שינוי בריכוז התוך תאי של סידן (Ca²⁺) המכונה לעתים קרובות 'גל Ca²⁺'. בעוד שהמהירות ומספר התנודות של גל Ca²⁺ משתנים בין המינים, השינוי ב-Ca²⁺ התוך-תאי הוא המפתח בהבאת אירועים חיוניים להתפתחות העוברית. שינויים אלה כוללים חידוש מחזור התא, ויסות mRNA, אקסוציטוזיס גרגיר קליפת המוח וסידור מחדש של השלד הציטולוגי.

בביצית הדרוזופילה הבוגרת, ההפעלה מתרחשת בביצית הנקבית לפני ההפריה, ויוזמת סדרה של אירועים תלויי Ca²⁺. כאן אנו מציגים פרוטוקול להדמיית גל Ca²⁺ בדרוזופילה. גישה זו מספקת מערכת מודל הניתנת למניפולציה כדי לחקור את המנגנון של גל Ca²⁺ ואת השינויים במורד הזרם הקשורים אליו.

מבוא

שינוי Ca ^{2 +} ריכוז התאי על הפעלת ביצה (ביצית) הוא מרכיב משומר של כל היצורים שנחקרו ^1,2. אירוע זה יוזם מגוון רחב של התהליכים התלויים ²⁺ Ca, כולל חידוש של מחזור התא ותרגום של mRNAs מאוחסן. בשל דרישה זו עבור Ca ^{2 +,} לדמיין את השינויים החולפים בריכוזים תאיים Ca ^{2 +} כבר עניין מפתח.

מבחינה היסטורית, אורגניזמים מודל נבחרו מחקרים על הפעלת ביצה בהתבסס על גודל וזמינות של ביציהן. גישות להדמיה שונות כבר נוצלו לעקוב ולכמת שינויים התאי Ca ^{2 +} ריכוזים במערכות אלה, ובכלל זה: aequorin photoprotein בדגי medaka ^3; Ca צבעי ניאון ^{2 +} רגישים כגון פורעה-2 ב קיפוד ים ו אוגר ^4,5; וסידן ירוק-1-dextran ב Xenopus ^6.

הדור ושיפור אינדיקטורים סידן מקודדים הגנטי (GECIs) שינה את היכולת לדמיין Ca ²⁺ דינמיקת in vivo ^7. הבונה הגנטית אלה באים לידי ביטוי ברקמות ספציפיות ולהגביל את צורך הכנות רקמות פולשנית ^8.

GCaMPs הוא חלבון פלואורסצנטי ירוקה (GFP) בכיתה מבוססת של GECIs שהיה מאוד יעיל, בשל הזיקה הגבוהה Ca ²⁺ שלהם, יחס אות לרעש ואת היכולת להיות מותאם אישית ^9-11. בנוכחות של Ca ^{2 +,} במתחם GCaMP עובר סדרה של שינויים מרחביים, החל עקידת Ca ²⁺ כדי calmodulin, שתוצאתה היא עוצמת פלורסנט מוגברת של רכיב ה- GFP ^9.

GCaMPs נעשה שימוש נרחב במחקר על נוירונים תסיסנית לדמיין שינויי סידן התאי ^12. Applicati האחרונהעל הטכנולוגיה GCaMP לדמיין Ca ^{2 +} ביצים תסיסנית בוגרת גילה גל יחיד Ca ^{2 +} חולף על הפעלת ביצה ^13,14. גל Ca ²⁺ ניתן דמיין בהגדלה נמוכה בזמן ביוץ in vivo ¹³ או בהגדלה גבוהה יותר באמצעות assay הפעלת vivo לשעבר ^13,14. ב assay vivo לשעבר, ביציות בוגרות בודדות מבודדות מן השחלות והופעלו באמצעות פתרון hypotonic, המכונה חיץ הפעלה, אשר הוכח לשחזר את אירועי in vivo הפעלת ^15-17.

Assay vivo לשעבר זו מאפשר ויזואליזציה ברזולוציה גבוהה הקלה של גל Ca ²⁺ תחת תנאי ניסויים שונים כולל שיבוש תרופתי, מניפולציות פיסיות מוטציות גנטיות. מאמר זה מדגים הכנת ביצים תסיסנית בוגרת vivo לשעבר הפעלה הדואר עוקבת מיקרוסקופיה רגילה לחזות גל Ca ²⁺ באמצעות GCaMP. גישה זו יכולה לשמש כדי לבחון את החניכה ובקר על גל Ca ^{2 +} ו לחקור תוצאות במורד זרם.

פרוטוקול

הערה: ביצוע כל הצעדים בטמפרטורת החדר אלא אם צוין אחרת.

1. הכנה לנתיחה

הערה: השלבים המתוארים כאן הם בהתאם E. Gavis, אוניברסיטת פרינסטון & וייל et. al. ^18. בצע את השלבים הבאים יומיים לפני הדמיה.

1. קח בקבוקון זבוב המכיל כ 10 מיליליטר של מזון מוצק להוסיף כמות קטנה של שמרים יבשים לאחד בפינה, פחות מ 1 גרם מספיק.
   הערה: לקבלת מידע אודות בקבוקונים לטוס או מזון לראות "תסיסנית תחזוקה ^'19.
2. להוסיף 1 - 3 טיפות של מים כדי ללחלח את השמרים.
3. הגדר את הבקבוקון הצידה בזווית של 45 מעלות ולאפשר 3 - 5 דקות על השמרים כדי לקחת את המים.
4. בעוד שמרים סופג את המים, בחר בקבוק זבובים להביע GCaMP5 MYR UASt- ²⁰ מונע על ידי אמבט-VP16GAL4 (המכונה GCaMP5) שצצו לאחרונה (א myristoyטופס lated של GCaMP5 נבחר לספק אות גבוהה יחס רעש דרך קושר את Geci הקרום בתוך הביצה).
5. לטשטש את הזבובים בבקבוק עם גז CO _2. הקפד לשמור את הבקבוק הפוך כדי לא לאבד זבובים במזון הרטוב.
6. עצת הזבובים מורדמים על כרית CO ₂ ולמיין 10 - 15 נקבות ו 5 זכרים באמצעות מכחול תחת מיקרוסקופ לנתח. הערה: זהו תקן לכלול זכרים לספק נקבות בריאות לנתיחה.
7. כאשר את הבקבוקון משלב 1.3 מוכן, מוסיף את הזבובים שנבחרו כדי הבקבוקון. תשמור על עצמך כדי לשמור על אופקי הבקבוקון עד הזבובים להיות פעילים.
8. מניחים את הצנצנת על 25 מעלות צלזיוס למשך כ 36 שעות.
9. החזר את הזבובים הנותרים מפנקס CO ₂ על הבקבוק או שנזרק.

2. השחלות תסיסנית ביתור

הערה: השלבים המתוארים כאן הם בהתאם וייל et. אל. 18.

1. לאחר 36 שעות, לטשטש הזבובים מבקבוקון yeasted עם ₂ CO.
2. לאחר הזבובים בתוך הבקבוקון מורדמים להטות אותם על כרית ₂ CO להיות מסודר עם מברשת צבע תחת מיקרוסקופ לנתח.
3. בחר נקבה.
4. לבודד שתי השחלות מן הנקבה. עבור פרוטוקול מפורט מלא לראות וייל et. al. ^18. לסיכום:
   1. מקום טיפה קטנה של שמן halocarbon מחומצן (סדרה 95) על מס '1.5, 22 x 40 מ"מ coverslip.
   2. אחוז הנשי עם מלקחיים על הקדמי של הבטן.
   3. החזקת הנקבה תחת מיקרוסקופ לנתח, להשתמש בקבוצה השנייה של מלקחיים כדי להסיר את האחוריים של הנקבה בעדינות.
   4. נגב את הרקמה האחורית מן המלקחיים השניים.
   5. סוחט על חלל הבטן עם המלקחיים השניים מן הקדמי אל האחורי של הבטן. שתי ההשחלות האטומות צריכות לדבוק המלקחיים כשבחוץ של FEMAle.
   6. גע השחלות לתוך השמן.
   7. הסר את כל רקמה מן המלקחיים על ידי מנגב את המלקחיים.
   8. חזור על שלבים אלה (2.4.1 - 2.4.7) כדי להשיג שלוש coverslips, כל שחלות המכילות בין זבוב אחד.

3. בידוד פרט ביציות בשלות

1. תחת מיקרוסקופ לנתח סטנדרטי עם ההגדלה מוגדרת 4X, על coverslip הראשון משלב 2.4, להפריד בין שתי שחלות ידי קריעת oviduct.
2. להציג זוג מלקחיים סגורים למרכז בשחלה אחת, נזהר שלא לנקב כל תאי ביצה.
3. כנס חללי לנתח סטנדרטי למרכז השחלה ליד המלקחיים הסגורים.
4. בעדינות לגרור החללית לנתח דרך השחלה לכיוון בקוטב האחורי, שבו הביציות הבשלות (שלב 14 תאי ביצה) ממוקמות.
5. חזור על שלבים 3.1 - 3.4 2 - 5 פעמים בהתאם לגודל של השחלה ומספר הביצים.
   הערה: תוספת של CO ₂ בדרך כלל גורם בתצהיר של ביצה אחת אשר תופיע גדול עם נספחים הגבו עלה מאשר ביצים טרום שהופקד. ביצה זה אמור להיות מושלך הדמיה שכן הוא כבר הופעל בתוך גוף הנקבה.
   הערה: ביציות בשלות צפויות להפריד בקלות מן הרקמה החיבורית שחלות.
6. אם אין ביציות בשלות גלויות מחוץ השחלה, להמשיך מתגרה בעדינות עם החללית לנתח.
7. לאחר הביציות הבשלות גלויות על coverslip מחוץ השחלה, לתמרן 3 - 5 בשורה במרכז coverslip.
   הערה: לקבלת התוצאות הטובות ביותר, הפעל את החללית בעדינות לאורך הצד של הביצים.
   הערה: הימנע משיכת הנספחים הגבי כמו זה יכול לגרום נזק ביצה.
   הערה: בהתאם הגדרת הדמיה בעתיד, ליישר את הביצים כ 200 מיקרומטר בנפרד בניצב coverslip לאזור הדמיה מקסימלית.
8. לאחר מיושר, להסיר את שאר רקמת השחלה על ידי גרירתו מן הביצים מיושר באמצעות forceps.
9. הסר עודף שמן בטופחו עם הפינה של רפואי לנגב. היזהר שלא לגעת ביציות בשלות עם רפואי לנגב ביציות בשלות כמו כי הם פנו יאבדו.
10. צייר crosshair על coverslip בטוש לפשט איתור המדגם תחת מיקרוסקופ.
11. הגדר את coverslip במקום בטוח ולהשאיר את תאי ביצה המוכנים על coverslip לנוח 5 - 10 דקות. זה מאפשר את הביצה להתיישב שמן. דוגמאות ניתן להשתמש עד 1 שעות שלאחר הניתוח.
12. חזור על שלבים 3.1 - 3.11 עבור שאר coverslips עם שחלות עליהם.

4. הכנות לקראת הדמיה

1. תביא חיץ הפעלה מוכן ¹⁵ לטמפרטורת חדר.
   הערה: חיץ ההפעלה היא חיץ hypotonic: 3.3 מ"מ לאא _{2 4} PO, 16.6 מ"מ KH _{2 4} PO, 10 mM NaCl, 50 מ"מ KCl, 5% פוליאתילן גליקול 8000, 2 מ"מ CaCl _2, הביא 6.4 pH עם 1: יחס 5 של NaOH: KOH.לפרטים נוספים, ראה Mahowald, 1983 ^15. Aliquots של חיץ הפעלה יכול להיות מאוחסן ב -20 מעלות צלזיוס במשך חודשים על 4 מעלות צלזיוס עד 2 שבועות.
2. בזהירות להעביר coverslips מוכן, חיץ הפעלה טפטפות זכוכית למתקן הדמיה.
   הערה: שדה רחב, confocal, דיסק מסתובב או מיקרוסקופ גיליון האור יכול לשמש. אנו ממליצים באמצעות מיקרוסקופ הפוכה. תוצאות הנציג שלנו התקבלו באמצעות מיקרוסקופ confocal.
3. אובייקטיבי מתאים הדמיה ביצית בשלה כולו צריך להיבחר (כאן: 20X 0.7 NA).
4. הר coverslip המוכן הראשון על במת מיקרוסקופ. יש להיזהר שלא לשבור את coverslips על הבמה.
5. איכותי לבחור שדה הראייה עם תא ביצית בשלה עבור הפעלה. האם לא תאי ביצה נקבה תמונה או בעלי blebbing בקרום.
   הערה: צעדים 4.6 - 4.7, פקודות תוכנה תשתנינה בהתאם מיקרוסקופ ויצרן.
6. פסק הדמית גדרמטרים עבור עירור GFP רגיל (488 ננומטר) ופליטה (500 - 580 ננומטר). גם הקים נוף שדה בהיר כדי לחזות להתמצא הביצה הבוגרת ושמן עקור.
7. בחר את Z-המטוס הנמוך ביותר שבו ביציות בשלות גלויות ולהגדיר Z-מחסנית מלאה להילקח עבור 40 מיקרומטר בכ 2 מיקרומטר לכל צעד. הגדר את הפרמטרים כך שאין עיכוב בין רכישת מחסנית Z. הגדר את סדרת הזמן לתפוס כ -30 דקות.

5. הפעלת ביצת גופיים הדמיה

1. התחל לכידת תמונה.
2. חכו 1 - מלא 2 Z- ערימות להירכש. זו מציגה את הביצית בשלה לפני ההפעלה.
3. למשוך כ 300 μl של חיץ ההפעלה לתוך פיפטה מזכוכית.
4. מיצוב קצה פיפטה זכוכית המכיל חיץ ההפעלה בזווית של 45 מעלות מעל coverslip, לאט להזיז את פיפטה לתוך נתיב קרן עד שהוא ממש מעל להיות הדמיה ביצית בשלה. פיפטה הזכוכית צריכה2 ס"מ מעל שמן - 1 להיות.
5. להוסיף 1 - 2 טיפות של חיץ ההפעלה בתוך פחות מ -5 שניות מן פיפטה מזכוכית. זה אמור לתפוס את השמן. להימנע מהוספת חיץ הפעלה עודפת או נגיעת הביצה עם פיפטה הזכוכית כפי שהוא יכול לגרום לעקירה של הביצית בשלה. יש להיזהר שלא לגעת coverslip עם פיפטה כמו זה יכול לגרום לשינוי בועות מטוס או אוויר מוקדי להיווצר שמן טבילה בין המטרה לבין coverslip.
6. תוך הוספת חיץ הפעלה במהלך רכישת תמונה, בדוק את הערוץ בהיר שדה כדי להבטיח שהשמן הוחלף על ידי חיץ ההפעלה.
   הערה: זה יהיה ראשון להופיע כצל בשל פיפטה שבירה נתיב הקרן אלא גם יגרום להופעת טיפות שמן זעירות. כמה טיפות שמן יכול להישאר הקשורים ביצית בשלה שישפיע תוצאות הניסוי ואיכות תמונה.
7. אם השמן לא שנעקר מהתוספת הראשונית של חוזרי חיץ הפעלת צעדי 5.4 - 5.6.
8. לאחר השמן הוא עקור בהצלחה, לאפשר הסדרת הזמן לרוץ עד לסיום.
   הערה: בשל נפיחות של ביציות בכל הפעלה, כמה תאי ביצה יעברו בדרמתיות מעל מישור המוקד או שדה הראייה על תוספת של חיץ הפעלה. במצב זה, להפסיק את הרכישה ואת הר coverslip הבא.
9. לאחר רצף התמונה השלים רכישה, לשמור את הנתונים.

6. לאחר רכישת עיבוד תמונה

1. פתח את מערך הנתונים באמצעות פיג'י (http://fiji.sc/Downloads#Fiji), או תוכנת עיבוד תמונה שווה ערך, ובחר את הקבצים הרלוונטיים לניתוח.
2. כדי לבנות השלכה של הנתונים רכשו לבחור: תמונה> סטאקס> Z-פרויקט.
3. בחר פרוסה-Z התחלת א-פרוסת Z תחנה, בדרך כלל הקטע השלם. בחר סוג הקרנה, בדרך כלל מוגדר 'מקס עוצמה ". בדוק תיבת הסימון 'בכל הזמנים Frames' כדי להחיל את ההגדרות שנבחרו לסדרה כולה.
4. אםיותר מערוץ ניאון אחד כבר צילמו, השתמש בכלי ערוצים לאפשר תנועה בין צבעים, לבצע מרוכבים, או להפוך את גווני האפור בתמונה. כלי תמונה> צבעים בוחרים> ערוצים.
5. כדי להתאים את בהירות התמונה ו בניגוד תמונה בחר> התאם> בהירות / ניגודיות.
6. כדי לייצא תמונה אחת, להעביר מחוון זמנים למסגרת רלוונטית בחר File> Save As> Jpeg, או כל פורמט מועדף.
7. בחר מיקום וכותרת עבור הקובץ המיוצא, ולאחר מכן שמור.
   הערת קצב הפריימים מתוכנת ההדמיה יידרש לתת חותמת זמן על התמונה.
8. כדי לייצא את סדרת הזמן כסרט לבחור: File> Save As> AVI, ולאחר מכן בוחר קצב פריימים (~ 7 פריימים לשניים).
9. בחר מיקום וכותרת עבור הקובץ המיוצא, ולאחר מכן שמור.
10. כדי לשמור את הקובץ המותאם בפורמט פיג'י, בחר File> Save.

תוצאות

כאן אנו מדגימים כיצד להכין ביצים תסיסנית בוגרת הפעלת vivo לשעבר. ביצים להביע הדמיה לאפשר Geci של Ca ^{2 +} הדינמיקה בבית ההפעלה ביצה ותחילת ההתפתחות העוברית (איור 1). יצוין כי בהתאם GCaMP בשימוש, במיוחד בנוכחות קבוצת myristoyl, תוצאות עשויות להיות הבדלים איכותיים קלים ^{13 14.} יש לנו גם הפגין תפקיד עבור אקטין תפקודי במהלך הפעלת ביצה על ידי התוספת של מעכב פילמור יקטין, cytochalasin D, למאגר ההפעלה (איור 2) ^14.

דרישת שלד התא ב הפעלת ביצה נשמרת. ב C. elegans, לאחר הפריה, רכיבי cytoskeletal הם מחדש להכין את העובר-תא אחד לחלוקת הסימטרית הראשונה ^21,22. בשנת קיפוד ים, שיבוש cytoskeletal-ארגון מחדש לאחר ההפעלה הוכח להשפיע על מחזור התא על ידי מניעת טבעת התכווצות היווצרות ^23. תפקידיו של תקטין בתיווך גל Ca ²⁺ ותפקוד ההמשך שלה ב הפעלת ביצת תסיסנית נשארו הובהרו באופן מלא.

ב תסיסנית, שיתוף להדמיה של שלד התא Ca ^{2 +} גל אקטין יכולה להיות מושגת באמצעות assay ההפעלה vivo לשעבר זה. סדרת זמן של ערוצים מרובים ניתן לרכוש ודינמיקה של Ca התאי ²⁺ ניתן להתאים עם שינויים בארגון יקטין הביצית (איור 3).

איור 1:. גל אחד Ca ^{2 +} ב תסיסנית ביצה הפעלת סדרת זמן של vivo לשעבר בוגרת ביצה תסיסנית להביע UASt- myrGCaMP5 הבאים אddition של חיץ ההפעלה (AH). העלייה Ca ציטופלסמית ²⁺ מקורו בקוטב האחורי (ב ') מתפשטת (BF) עם מהירות ממוצעת של כ -1.5 מיקרומטר / sec. ייזום של גל בדרך כלל הוא ציין בתוך 3 דקות של תוספת של חיץ ההפעלה. בעקבות ההפעלה, רמות סידן תאיים של ביצית בשלה חוזר טרום הפעלת רמות (G, H). ראה השלים סרט 1 (דקות בסה"כ זמן 33). ברי סולם = 50 מיקרומטר. מקס הקרנה = 40 מיקרומטר. לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 2: תוספת של Cytochalasin D כדי הפעלת מאגר מדאיג Ca^{2 +} גל רביה. סדרת זמן של vivo לשעבר בוגרת ביצה תסיסנית להביע UASt- myrGCaMP5 הבאים תוספת של חיץ ההפעלה המכיל 10 מיקרוגרם / מ"ל cytochalasin D הריכוז הסופי (AH). בעוד גל Ca ²⁺ הוא יזם בקוטב האחורי (א), זה נפגע ואינו להגיע הקדמי של הביצה (F) (ראשי החץ לבנים מציינים חלק הקדמי של הגל). אין עוד שינויי Ca ^{2 +} נצפו למעלה מ -30 דקות). ראה השלים סרט 2 (דקות בסה"כ זמן 30). ברי סולם = 50 מיקרומטר. מקס הקרנה = 40 מיקרומטר. לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 3: Co-להדמיה של אקטין Ca ^{2 +} ב Eהפעלת gg תסיסנית. סדרת זמן של vivo לשעבר בוגרת ביצה תסיסנית להביע UASt- myrGCaMP5 (ציאן) ו UASp -f-Tractin.tdTomato (מגנטה) התוספת הבאה של חיץ ההפעלה (AH). גל Ca ²⁺ יוזם מהקוטב האחורי ומשחזר כמו באיור 1. תקטין נראה שינוי לאורך זמן, ראשי חץ לבנים (A נגד H). העדר זיהוי אותות Ca ^{2 +} במרכז ביצית בשלה הוא עקב תנועה של המדגם במהלך לכידת תמונה. ברי סולם = 50 מיקרומטר. מקס הקרנה = 40 מיקרומטר. לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

דיון

השלב הקריטי הראשון בפרוטוקול זה הוא בידוד הביציות הבוגרות ללא נזק. ניתן להשיג זאת על ידי תמרון גויים של הביצים עם בדיקת הניתוח. תרגול יאפשר לבצע מניפולציה זו ללא נזק לביציות. שלב מכריע שני הוא הימנעות מאובדן הדגימה כאשר מפעילים מאגר הפעלה על הביצה הבוגרת בשמן. יישום מאגר ההפעלה צריך להיעשות לאט וללא מגע עם הכיסוי. שלב זה יכול להיות מאתגר אם הגדרת המיקרוסקופ אינה מאפשרת גישה נוחה לדגימה. רצוי להזיז חלקים מבית השחי של המיקרוסקופ, כגון חממת טמפרטורה.

ניתן לבצע שינויים בפרוטוקול זה על מנת לדמיין גורמים אחרים המתויגים פלואורסצנטית, במקום Ca²⁺ בעת הפעלת הביצית. באופן כללי יותר, ניתן לנתח שלבים שונים של התפתחות דרוזופילה או את התוצאות של הוספת מאגר אחר באמצעות פרוטוקול זה.

ייתכן שיידרש פתרון בעיות אם ההגדרות במיקרוסקופ אינן אופטימליות להמחשת האות מהדגימה. ניתן להשיג זאת על ידי הגדלה או הקטנה של עוצמת הלייזר, שינוי טווח הלכידה והתאמת פרמטרי Z-stack. בעיה נוספת עשויה להיות ביצים שיוצאות באופן עקבי משדה הראייה עם הוספת מאגר ההפעלה. אם זה קורה באופן קבוע, אפשר לביצים הבוגרות להתיישב על החלקות הכיסוי לפרק זמן ארוך יותר, 15 עד 20 דקות. היזהר ששימוש בשמן בעל צמיגות גבוהה יותר ישנה את תזוזה של השמן על ידי מאגר הפעלה.

טכניקה זו המוצגת כאן מוגבלת על ידי מרחק העבודה של המטרה, התייבשות הביצים הבוגרות והיכולת לנתח את הביצים הבוגרות ללא נזק. עם זאת, בהשוואה לשיטות הדמיה in vivo שבהן הביצית הבוגרת עוברת דרך הנקבה הבוגרת ומופקדת ¹³, השיטה שלנו מאפשרת רזולוציה מרחבית רבה יותר, אפשרות לתפעל פיזית את הביצית הבוגרת לפני ההפעלה ויכולת לבדוק את תפקיד הפעלת הביצית ללא הפריה.

ישנם יישומים עתידיים פוטנציאליים רבים של טכניקה זו, כולל בדיקת מבני מדווח לרכיבים תאיים בהפעלת ביצית והדמיה של גל Ca²⁺ על רקע מוטנטי ^14,24. יחד עם כלים ניסיוניים וגנטיים, מבחן הפעלת הביציות ex vivo המוצג כאן מאפשר לחקור את ההשפעות של הטריגר, ההתפשטות וההשפעות במורד הזרם של גל Ca²⁺ השמור באופן אוניברסלי.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
שמרים פעילים יבשים	פליישמן' s	#2192
ניתוח מיקרוסקופ	Leica	MZ6	שונים יעבדו
מנורת	Mircotec סיבים אופטיים	MF0-90	שונים יעבדו
מגבונים רפואיים	תאגיד קימברלי-קלארק	KLEW3020
עט סמן	Stabilo	841/46	OHPen אוניברסלי, שחור - זמין ברוב החנויות הנייחות. רוחב דק במיוחד 0.4 מ"מ
CO2 pad	Genesee Scientific	59-114 (789060 Dutscher)
תלוש כיסוי מס' 1.5, 22 x 50 מ"מ	בינלאומי- No1-VWR Cat=631-0137-22-50 מ"מ	מנזל-גלזר-22-50 מ"מ-MNJ 400-070T
שמן הלוקרבון, סדרה 95	Halocarbon Products Corp.	מפיץ באירופה:
Solvadis (GMBH)
שמן 10 S	VWR כימיקלים	24627.188	ניתן להשתמש במקום שמן הלוקרבון, סדרה 95
מלקחיים	Fine Science Tools	11252-00	בעוד שכלים אלה צריכים להיות נקיים, אין צורך בשימוש בחיטוי, אתנול יספיק.
Probe	Fine Science Tools	10140-01
פיפטה מזכוכית	פישרברנד,	FB50251	פיפטות פסטר, זכוכית, לא מחובר, אורך 150 מ"מ
בקבוקון	רג'ינה תעשיות	P1014	GPPS  80 מ"מ x 25 מ"מ