מאמר שיטה

איתור מולקולרית ראפיד והבחנה א נגיפי שפעת A ו- B

15.3K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/54312

⸱

30 בינואר 2017

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Laboratory Medicine, Memorial Sloan Kettering Cancer Center

במאמר זה

סיכום

אנו מתארים assay מהיר, מולקולרי מבוסס השפעת A ו- B. שפעת assay מזהה כל מטרה בתוך 15 דקות על ידי העסקת הגברת בידוד תרמית עם פריימרים ספציפי שפעת ואחריו איתור יעד עם בדיקות משואה מולקולריות. שפעת A ו- B assay הוא ידידותי למשתמש ונזקק ידות על מינימאליות זמן לבצע.

תקציר

שפעת היא מחלה נשימתית מדבקת הנגרמת על ידי נגיפי שפעת A ו- B בבני אדם וגורמת כמות משמעותית של תחלואה ותמותה מדי שנה. שפעת A ו- B assay היה מבחן השפעת מהירה מולקולרית CLIA-ויתרו הזמין הראשון. שפעת A ו- B הבדיקה פועלת על ידי העסקת הגברת בידוד תרמית עם פריימרים ספציפי שפעת ואחריו איתור יעד עם בדיקות משואה מולקולריות. הנה, את הביצועים של השפעת A ו- B assay על קפוא, בארכיון ספוגית אף ולוע (NPS) דגימות מאוחסנות במדיום תחבורת ויראלי (VTM) הושוו assay לוח נשימה.

המופע של assay שפעת A ו- B הוערך על ידי השוואת התוצאות למודל התייחסות לוח הנשימה. רגישות וירוס הכולל שפעת הייתה 67.5% (95% CI (CI), 56.6-78.5) ואת סגוליות 86.9% (CI, 71.0-100). עבור בדיקות B נגיף השפעת, הרגישות והסגוליות עמדו 90.2% (CI, 68.5-100) ו 98.8% (CI, 68.5-100), בהתאמה.

מערכת זו יש את היתרון של זמן בדיקה קצר משמעותי מאשר כל assay מולקולרית אחרת קיימים, ואת ההליך פשוט, ללא פיפטה פועלת על משולבים במלואם, סגור, מערכת-טביעת רגל קטנה. בסך הכל, שפעת A ו- B assay העריכו במחקר זה יש פוטנציאל לשמש כמבחן אבחון שפעת מהירה בנקודת הטיפול.

מבוא

נגיף שפעת לגרום כמות משמעותית של תחלואה ותמותה מדי שנה 1, 2, 3. שפעת מסובכת מאופיינת בתסמינים חוקתיים נשימה כגון חום, כאבי שרירים, כאבי ראש, ואת לא פרודוקטיביים שיעול 4, 5. מבוגרים יחידים, ילדים צעירים, בחולים מדוכאי חיסון, וחולים עם מחלות רקע שבבסיס נמצאים בסיכון גבוה יותר לסיבוכים רציניים כמו דלקת ריאות, דלקת שריר הלב, מחלת מערכת העצבים המרכזית, או מוות 6, 7.

זיהום שפעת הוא ייחודי מפני וירוסים נשימה אחרים כי הממשל הפקודה של טיפול אנטי-ויראלי בתוך 48 שעות מהופעת התסמינים יכולים להפחית את חומרת המחלה, אורך 8. זיהוי מהיר של שפעת כבר גםמפחית את השימוש באנטיביוטיקה מיותרת 9, 10. יתר על כן, חולים מאושפזים עם זיהומי שפעת יש להציב בחדרים מבודדים עם אמצעי זהירות בקרת הזיהום מתאים. עם זאת, מחלות בדרכי נשימה הנגרמות על ידי וירוסים שאינם שפעת יכולות להיות קשות קליני להבחין משפעת. מסיבה זו, בדיקות אבחון מהירות ומדויקות לשפעת חשובה מאוד לניהול מטופל קליני.

מבחנים קיימים מספר לאיתור וזיהוי של נגיפי שפעת. בדיקות לגילוי מהיר אנטיגן שפעת (RIDTs) נמצאים בשימוש נרחב בפרקטיקה הקלינית כבדיקות Point-of-care כי הם פשוט לשימוש לספק תוצאות תוך 15 עד 30 דקות 11, 12; עם זאת, הרגישויות שלהם להשתנות משמעותית (10-80%) בהתאם ליצרן ואת האוכלוסייה נבדקת, ואת סוג שפעת subty13 PE, 14, 15. מבחני קרינה ישירים (DFAs) לספק רגישויות מעולות על RIDTs, אבל הפעם העיבוד גדול (~ 3 שעות) וחייב להסתיים עד וטכנולוגים מיומנים 16, 17. תרבות ויראלי כבר את תקן הזהב לאבחון שפעת ושיפרה רגישות מעל שניהם RIDTs ו DFAs 18. עם זאת, תרבות ויראלי שפעת יכול לקחת בין 2-14 ד להשלים, הולכת ופוחתת השירות שלה בסיוע וניהול החולה 19. לבסוף, בדיקות הגברת חומצות גרעין (NAAT) החליפו טכניקות תרבות כתקן הזהב החדש באבחון שפעת. NAAT נחשבת כבעלות רגישות הגדולה לאיתור שפעת בעוד כמה שעות. עם זאת, NAAT הם המבחנים היקרים ביותר ודורש ציוד וטכנולוגים מיוחדים כדי לבצע 5 , 20, 21, 22, 23, 24, 25.

שפעת assay A ו- B המתואר כאן הוא מבחן השפעת המהיר המולקולרי CLIA-וייתר הראשון שכבר זמין. assay זה עובד על ידי העסקת תגובת הגברה שסחב Endonuclease (NEAR) המשתמשת הגברת בידוד תרמית עם פריימרים ספציפי שפעת ואחריו איתור יעד עם בדיקות משואה מולקולריות. assay זה מבדיל שפעת A מ- B, דורש 2 דקות כדי להגדיר ולעבד דגימה אחת, ודורש בסך הכל 15 דקות כדי להשלים.

כאן, אנו מציגים פרוטוקול עבור assay שפעת A & B. בנוסף, אנו מספקים נתונים לדוגמה להגדיר השוואת הביצועים של שפעת A ו- B assay על ספוגית האף והלוע בארכיון (NPS) דוגמאות טיפוסיות מאוחסן במדיום התחבורה ויראלי (VTM) למשנהו assay לוח הפתוגן הנשימה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

מסר אתיקה: שימוש שמאל מעל דגימות קליניות יאושר והוא פועל בהתאם להנחיות של דירקטוריון הסקירה המוסדי במרכז לחקר סרטן קטרינג סלואן הזיכרון.

1. לפני הפעלת Assay

הערה: השפעת A ו- B assay מאושר דגימות ספוגית אף ולוע ועבור מטליות אף ולוע מאוחסנות תקשורת תחבורת ויראלי. מטליות כלולות בערכה ויש להשתמש בם עבור ביצועים אופטימליים. עם זאת, זהורית, קצף, נהר מטליות או ספוגיות אף פוליאסטר יכולות לשמש גם כדי לאסוף דגימות ספוגית אף.

  1. כדי לאסוף דגימת אף ספוגית, הכנס את הספוגית לתוך הנחיר כי יש ניקוז הבולט ביותר או כי הוא הכי צפוף. עם סיבוב עדין, לדחוף את הספוגית לתוך הנחיר עד ההתנגדות הוא פגשה לסובב מספר פעמים כנגד קיר האף לפני ההסרה לאט מהנחיר. אחסן את מטליות ו להסיעם בקבוקונים המכילים 3 מ"ל של התקשורת התחבורה ויראלי (VTM).
    הערה: תשומת לב קפדנית approprאוסף הדגימה iate חייב להתפרש אוסף הדגימה לקוי עשוי להניב תוצאות שגויות.
    הערה: דגימות ספוגיות צריכים להיבדק בהקדם האפשרי לאחר איסוף. עם זאת, הם עשויים להיות מאוחסנים בטמפרטורת חדר למשך עד שעה 2 או בקירור ב 2-8 מעלות צלזיוס למשך עד 24 שעות אם בדיקות אינן זמינות מייד. טרי דגימות שנאספו הם אידיאליים עבור ביצועים במבחן אופטימליים. טיפול מדגם לא נכון, אחסון, ו / או הובלה עשוי להניב תוצאות שגויות.
    הערה: כאמצעי זהירות, אנשי ביצוע בדיקה זו צריכים להתייחס לכל הדגימות בפוטנציה זיהומיות שמירה על הנחיות בטיחות אוניברסלית בעת טיפול דגימות.
  2. תביאו כל הדגימות לטמפרטורת החדר לפני הבדיקה.
    הערה: כל מרכיבי הבדיקה מיועדים לשימוש יחיד בלבד ולא אמור לשמש לביצוע בדיקות מרובות. אין לערבב מרכיבי ערכת ממספרים הרבה שונים. אין להשתמש ריאגנטים ערכה מעבר לתאריך התפוגה שלהם.
  3. תביא את מקלט המדגם הכחול Rooטמפרטורה מ לפני הבדיקה. בסיס המבחן הכתום ניתן לבדוק ללא הצורך לחמם לטמפרטורת חדר.
  4. השאירו את כל פיסות הבדיקה בתוך האריזה רדיד עד מיד לפני השימוש. הפעל את המכשיר על ידי לחיצה על לחצן ההפעלה בצד של המכשיר. הזן את מזהה המשתמש ולחץ על 'אישור'.

2. הרצת מבחן

  1. כדי להתחיל בתהליך הבדיקה, לגעת 'הפעלה נסיונית "במסך המכשיר. הזן את מזהה המטופל באמצעות המקלדת שעל המסך או סורק ברקוד ולחץ על 'אישור'. פתח את המכסה והכנס את בסיס מבחן אורנג לתוך מחזיק בסיס מבחן אורנג '.
  2. אשר שהמבחן הנכון מוצג על המסך ולחץ על 'אישור'. הכנס את מקלט המדגם הכחול לתוך החזיק מקלט מדגם הכחול.
    הערה: אין לפתוח את השפופרת מדגם לפני הצבת המכשיר זה ימנע למאגר elution מלהגיע טמפרטורת ההפעלה הנכונה ועלול להשפיע על הביצועים במבחן.
  3. חכו מקלט מדגם להתחמם. כאשר תתבקש על ידי המכשיר, להסיר את החותם בנייר כסף ומניחים ספוגית החולה להיבדק לתוך השפופרת המדגם.
    הערה: בעת הסרת הרדיד, הנח שתי אצבעות על שפת הכונס לדוגמא כדי לוודא שהוא נשאר במקום.
  4. במרץ לערבב את הספוגית בנוזל במשך 10 שניות, לחיצה על הראש הספוגי כנגד צד המקבל מדגם כפי שאתה לערבב אותו כדי לעזור לסלק את הדגימה מן הספוגית. 'אישור' לחץ כדי להמשיך. אם מטליות בדיקות מאוחסנות במדיום תחבורת ויראלי, מערבולת VTM במשך 10 שניות ולאחר מכן להוסיף 200 μl למקלט המדגם.
  5. לחץ על מחסנית ההעברה הלבנה לתוך שפופרת המדגם הכחולה. המשך ללחוץ על המקלט מדגם עד שהחיווי הכתום עולה.
  6. רם ולאחר מכן חבר את מחסנית ההעברה לבסיס הבדיקה. שים את המחוון הכתום יורד פעם העברה המחסנית מחוברת כהלכה. לסגור את המכסה ואל תפתח עד "מבחן השלם"מופיעה הודעה על המסך.

3. בקרת איכות

  1. לגעת 'הפעלה QC Test' במסך הבית. בחר את פעולת QC שיופעל. אשר את סוג הבדיקה כדי להתאים מדגם QC שנועד לבדיקה על ידי נגיעה על 'אישור' ובעקבות על מסך כדי להשלים בדיקות.

4. פרשנות תוצאה

  1. לאחר ריצת השלמת הבדיקה, לבחון את תוצאות הבדיקה המוצגת על המסך עם פרשנויות לנוכחות של השפעת A, B, תת ידוע. לקבלת תוצאות חוקיות לחזור על הבדיקה.

תחזוקה וניקיון 5.

  1. נקו את המכשיר באזור הספסל שמסביב יומי עם אתנול 70% או פתרון אקונומיקה 10%. תרסיס לניקוי על מטלית לחה, נטול סיבים לניקוי. אין לשפוך הפתרונות ישירות על המכשיר.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

במחקר זה, בארכיון דגימות NPS נאספו מאושפזים עם הצגת תסמינים דמויי שפעת במרכז הסרטן ממוריאל סלואן קטרינג (MSKCC) במהלך התפרצות שפעת בין 15 בדצמבר, 2012 ו -1 במארס 2013. דגימות NPS הוגשו 3 מ"ל של VTM ונבדק כחלק בפועל קליני שגרתי עם assay מולקולרי שמזהה פאנל של וירוסים בדרכי הנשימה (RP), כולל שפעת A, A-1, A-3, ו- B. במהלך תקופת המחקר, 3,675 דגימות NPS הוגשו למעבדה הקלינית MSKCC לבדיקה. דגימות אלה, 45, 425, 37, ו -77 נדבקו בשפעת וירוסי A-1, A-3, A-un-s...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

נגיפי שפעת גורמים משמעותיים עולמי של תחלואה ותמותה. אבחון מהיר ומדויק של שפעת הוא אחד המפתחות העיקריים לניהול התפרצויות שפעת בעונת נשימה. בדיקות אחרות מבוסס אנטיגן הן מהירות וקלות לביצוע; עם זאת, יש להם רגישויות נמוכות 13. מצד השני, בדיקות מולקולריות מסורתיות השתפרו רגישות, אך דורשות אנשי טכנולוגית מעבדה מנוסות יותר לבצע והם יקרים יותר. שפעת A ו- B assay המתואר במחקר זה ופרוטוקול הוא CLIA-וייתר, בדיקה מולקולרית מהירה לשפעת A ו- B. הטכנולוגיה מבוססת על...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

למחברים אין מה לחשוף.

תודות

אנו מודים לצוות השירות למיקרוביולוגיה קלינית של מרכז הסרטן ממוריאל סלואן-קטרינג על העזרה באיסוף דגימות קליניות. מחקר זה נתמך בחלקו על ידי הסכם מחקר בין MSKCC ל-Alere Scarborough (SK2013-0262).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
Alere i InstrumentAlereNAT-000 (גלובלי), NAT-024 (ארה"ב)
Alere i Influenza A & ערכת בדיקה B 24Alere425-000 (גלובלית), 425-024 (ארה"ב)
Alere i סורק ברקודAlereEQ001001
מדפסת אוניברסליתAlere55115 (גלובלית), alereiprinter ( ארה"ב)
200 ומיקרו; l פיפטה
200 ומיקרו; l קצות
מדיום הובלה ויראליתRemelM4-RT
מדויקתפיפטה חד פעמית

מקורות

  1. Prevention control of seasonal influenza with vaccines. Recommendations of the Advisory Committee on Immunization Practices--United States, 2013-2014. , Report No. 1057-5987 1-43 (2013).
  2. Poehling, K. A., et al. The Underrecognized Burden of Influenza in Young Children. New England Journal of Medicine. 355 (1), 31-40 (2006).
  3. Estimates of Deaths Associated with Seasonal Influenza --- United States, 1976-2007. MMWR. 59 (33), 1057-1089 (2010).
  4. Agrawal, A. S., et al. Comparative evaluation of real-time PCR and conventional RT-PCR during a 2 year surveillance for influenza and respiratory syncytial virus among children with acute respiratory infections in Kolkata, India, reveals a distinct seasonality of infection. Journal of Medical Microbiology. 58 (12), 1616-1622 (2009).
  5. Ginocchio, C. C. Strengths and Weaknesses of FDA-Approved/Cleared Diagnostic Devices for the Molecular Detection of Respiratory Pathogens. Clinical Infectious Diseases. 52, suppl 4 312-325 (2011).
  6. Grohskopf, L. A., et al. Prevention and control of seasonal influenza with vaccines: recommendations of the Advisory Committee on Immunization Practices-United States, 2013-2014. MMWR Recomm Rep. 62 (07), 1-43 (2013).
  7. Molinari, N. -A. M., et al. The annual impact of seasonal influenza in the US: measuring disease burden and costs. Vaccine. 25 (27), 5086-5096 (2007).
  8. Aoki, F. Y., et al. Early administration of oral oseltamivir increases the benefits of influenza treatment. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 51 (1), 123-129 (2003).
  9. Noyola, D. E., Demmler, G. J. Effect of rapid diagnosis on management of influenza A infections. The Pediatric infectious disease journal. 19 (4), 303-307 (2000).
  10. Sharma, V., Dowd, M., Slaughter, A. J., Simon, S. D. EFfect of rapid diagnosis of influenza virus type a on the emergency department management of febrile infants and toddlers. Archives of Pediatrics & Adolescent Medicine. 156 (1), 41-43 (2002).
  11. Dale, S. E., Mayer, C., Mayer, M. C., Menegus, M. A. Analytical and clinical sensitivity of the 3M rapid detection influenza A+B assay. J Clin Microbiol. 46 (11), 3804-3807 (2008).
  12. van Doorn, H. R., et al. Clinical validation of a point-of-care multiplexed in vitro immunoassay using monoclonal antibodies (the MSD influenza test) in four hospitals in Vietnam. J Clin Microbiol. 50 (5), 1621-1625 (2012).
  13. Hurt, A. C., Alexander, R., Hibbert, J., Deed, N., Barr, I. G. Performance of six influenza rapid tests in detecting human influenza in clinical specimens. Journal of Clinical Virology. 39 (2), 132-135 (2007).
  14. Fiore, A. E., et al. Antiviral agents for the treatment and chemoprophylaxis of influenza --- recommendations of the Advisory Committee on Immunization Practices (ACIP). MMWR Recomm Rep. 60 (1), 1-24 (2011).
  15. Harper, S. A., et al. Seasonal influenza in adults and children--diagnosis, treatment, chemoprophylaxis, and institutional outbreak management: clinical practice guidelines of the Infectious Diseases Society of America. Clin Infect Dis. 48 (8), 1003-1032 (2009).
  16. Hannoun, C., Tumova, B. Survey on influenza laboratory diagnostic and surveillance methods in Europe. European Journal of Epidemiology. 16 (3), 217-222 (2000).
  17. Leonardi, G. P. Rapid identification of 2009 H1N1 influenza A virus using fluorescent antibody methods. Am J Clin Pathol. 134 (6), 910-914 (2010).
  18. Chartrand, C., Leeflang, M. M. G., Minion, J., Brewer, T., Pai, M. Accuracy of Rapid Influenza Diagnostic TestsA Meta-analysis. Annals of Internal Medicine. 156 (7), 500-511 (2012).
  19. Lee, G. C., et al. Evaluation of a rapid diagnostic test, NanoSign(R) Influenza A/B Antigen, for detection of the 2009 pandemic influenza A/H1N1 viruses. Virol J. 7, 244(2010).
  20. Tang, Y. W., et al. Clinical accuracy of a PLEX-ID flu device for simultaneous detection and identification of influenza viruses A and B. J Clin Microbiol. 51 (1), 40-45 (2013).
  21. Bandt, D., et al. Economic high-throughput-identification of influenza A subtypes from clinical specimens with a DNA-oligonucleotide microarray in an outbreak situation. Molecular and Cellular Probes. 26 (1), 6-10 (2012).
  22. Pierce, V. M., Elkan, M., Leet, M., McGowan, K. L., Hodinka, R. L. Comparison of the Idaho Technology FilmArray system to real-time PCR for detection of respiratory pathogens in children. J Clin Microbiol. 50 (2), 364-371 (2012).
  23. Teo, J., et al. VereFlu™: an integrated multiplex RT-PCR and microarray assay for rapid detection and identification of human influenza A and B viruses using lab-on-chip technology. Archives of Virology. 156 (8), 1371-1378 (2011).
  24. Babady, N. E., et al. Comparison of the Luminex xTAG RVP Fast assay and the Idaho Technology FilmArray RP assay for detection of respiratory viruses in pediatric patients at a cancer hospital. J Clin Microbiol. 50 (7), 2282-2288 (2012).
  25. Chidlow, G., et al. Duplex real-time reverse transcriptase PCR assays for rapid detection and identification of pandemic (H1N1) 2009 and seasonal influenza A/H1, A/H3, and B viruses. J Clin Microbiol. 48 (3), 862-866 (2010).
  26. Bell, J. J., Selvarangan, R. Evaluation of the Alere I influenza A&B nucleic acid amplification test by use of respiratory specimens collected in viral transport medium. J Clin Microbiol. 52 (11), 3992-3995 (2014).
  27. Nie, S., et al. Evaluation of Alere i Influenza A&B for Rapid Detection of Influenza Viruses A and B. Journal of Clinical Microbiology. 52 (9), 3339-3344 (2014).
  28. Chapin, K. C., Flores-Cortez, E. J. Performance of the Molecular Alere i Influenza A&B Test Compared to That of the Xpert Flu A/B Assay. Journal of Clinical Microbiology. 53 (2), 706-709 (2015).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

A BMolecular BeaconPoint of Care

מאמרים קשורים