תלת ממדי Assay תרבות לחקור הפולשנות תאים סרטניים היווצרות גידולים בלוויין

סיכום

תאי סרטן מוטבעים בג'ל קולגן ולאחר מכן נדחקים בג'ל פיברין תאי כדי ליצור מערכת תרבית תלת מימדית שבה ניתן לנטר את הפולשניות והיווצרות גידולי לווין.

תקציר

תרבית תאים יונקת monolayers נעשתה שימוש נרחב ללמוד תהליכים פיסיולוגיים ומולקולריים שונים. עם זאת, גישה זו ללמוד תאי גדלים מניבים לעתים חפצים לא רצויים. לכן, תרבית תאים בסביבה תלת ממדי (3D), לעתים קרובות תוך שימוש ברכיבים תאים מטריקס, הגיחה כחלופה מעניינת בשל דמיון הקרוב אל הילידים ברקמות vivo או איבר. פתחנו מערכת תרבית תאי 3D באמצעות שני תאים, כלומר (אני) תא מרכזי המכיל תאים סרטניים מוטבעים מתנהג ג'ל קולגן כגידול macrospherical פסאודו-יסודי (ii) תא היקפי תא ללא עשוי ג'ל הפיברין, כלומר מרכיב תא מטריקס שונה מאלה ששמשו במרכז, שבו תאים סרטניים יכולים לנדוד (מול פלישה) ו / או יוצרים גידולי microspherical המייצג גידולים משניים או בלווין. ההיווצרות של גידולי לווין בתא הפריפריה היאלהפליא בקורלציה פי מידת האגרסיביות ידוע או מוצא גרורתי של תאים סרטניים הילידים, מה שהופך מערכת התרבות 3D זה ייחודי. גישת תרבית תאים זה עשוי להיחשב להעריך הפולשנות תאים סרטניים תנועתיות, אינטראקציות מטריקס-תאיים תא כשיטה להעריך נכסי תרופה אנטי-סרטניים.

מבוא

חקירת המאפיינים הבסיסיים ואת הביו-רפואיים של פלישת תאים סרטניים / הגירה והקמת גרורות הבאה היא הנושא של ^1,2 מחקר אינטנסיבי. גרורה היא לשלב הסופי של הסרטן והניהול הקליני שלה נותר חמקמק. הבנה טובה יותר של גרורות ברמות התאיות ומולקולריות תאפשר הפיתוח של טיפולים יעילים יותר ^3.

מספר מאפיינים של תאים גרורתי יכולים להיחקר במבחנה ⁴ כולל stemness והפוטנציאל שלהם לרכוש מדינה מעברת (למשל, מעבר mesenchymal-epithelioid) להגר ולפלוש בתוך מן הגידול הראשוני ^5. עם זאת, ההערכה חוץ גופית של תהליכים הפלישה / גר....

פרוטוקול

הערה: אין שיקול אתיקה מאז תאים מן החי וסרטן האדם נרכשו או בתנאי בחביבות לנו.

1. ביצוע תקעי קולגן (גידול פסאודו-יסודי)

1. כן פיזור קולגן. Type I הקולגן בגידים זנב חולדה (RTT) ניתן לחלץ או עיקור כפי שדווח בעבר ^17, או לרכוש. לפזר קולגן RTT מיובש בהקפאה (3.25-3.50 מ"ג / מ"ל ​​חומצה אצטית 0.02 N) באמצעות בלנדר (הגדרת מהירות גבוהה; חמש 2 ריצות דקות) עבור ערבוב אחיד.
2. הקציר (טריפסין-EDTA, בדרך כלל) ולהשתמש הרחקה כחולה trypan לספירת תאי קיימא ....

תוצאות

כאמור, תכונה מעניינת של assay תרבית תאי 3D זה היא כי תאים סרטניים לא יכולים להעביר רק משקעים קולגן כדי הג'ל הפיברין הסמוך, אלא גם להקים גידולים משניים (למשל, לווין גידול מבנים דמויים). זה ניתן לצפות ישירות עם מיקרוסקופ לעומת שלב הפוך בהגדלות נמוכות וגבוהות דרך עובי ג'ל, במיוחד עם מעבה מרחק עבודה ארוכה (איור 2). באמצעות שיטת תרבית תאי 3D זה, התנהגותם של תאים גרורתי ידועים ניתן להשוות בקלות לזה שנמצא בתאים שאינם גרור.......

דיון

בתור הערת שוליים טכני חשוב, זה חיוני כי אין פער קיים בממשק בין מרכזי הג'לים הפריפריה. אחרת, זה עלול להפחית את היכולת של התאים לנדוד / לפלוש הג'ל הפיברין. רווח בין קולגן ג'לים הפיברין עלול להיווצר במהלך תרבות 24 שעות של הראשון אם תרומבין לא דוללו כראוי. אפשר גם כי שורת תאים נבדק עלול להוביל את ג'ל קולגן להתכווץ במהלך התרבות, ובכך לגרום חלל גדול יחסית להיווצר בין שני ג'לים. זה צפוי במיוחד כאשר תאי סטרומה מעורבבים ג'ל קולגן יחד עם תאים סרטניים עקב פעילות myofi.......

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
Sigma-Aldrich	C7661	מיובש בהקפאה	מגיד זנב עכברוש (פיזור מסיס) או תוצרת בית (ראה Rajan et al., ref.#14)
פיברינוגן (מיובש בהקפאה)	Sigma-Aldrich	F8630	סוג I-S, 65 - 85% חלבון עם ≥ 75% מהחלבון ניתן לקרישה
Thrombin	EMD Chemicals Inc.	605157	גיבסטאון, ניו ג'רזי; יחידות NIH/מ"ג משקל יבש
מטריגל מופחת בגורם גדילה	קורנינג	356234	בעבר מ- BD Biosciences
Aprotinin	Sigma-Aldrich	A6279	תמיסה ב-5 - 10 טון IU/ml (יחידת מעכב טריפסין)
מיקרו-כפות	פישר סיינטיפיק	2140115	פישרברנד Handi-Hold Microspatula
96 צלחת באר, בסיס עגול	Sarstedt	3925500
24 באר צלחת	Sarstedt	3922
Dulbecco's Eagle's Medium	Sigma Chemical, Co.	D5546	DMEM
סרום בקר עוברי	VWR	CAA15-701	FBS, ממוצא קנדי.
טריפסין-EDTA	סיגמא כימיקלים, ושות'	T4049
האנק' s תמיסת מלח מאוזנת	סיגמא כימיקלים, ושות'	H8264	HBSS

קולגן