פרוטוקול זה מתאר את השימוש של אסטרטגיית מיקרופלואידיקה מבוסס אינרציאלית חיץ החליפין לטהר תאים מהונדסים מיקרו / ננו-חלקיקים עם דלדול יעיל של חלקיקים מאוגד.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
Microfluidic מאגר Exchange להנדסת תאים ללא התערבות מיקרו / Nanoparticle
במאמר זה
סיכום
תקציר
תאים הנדסה עם מיקרו / חלקיקי ננו פעילים בעלי מרכיבים טעונים (NPS) הופך פופולארי יותר ויותר בשיטה כדי לשפר תכונות טיפוליות הילידים, לאפשר הדמיה ביו ולשלוט פנוטיפ התא. סוגיה קריטית עדיין התייחסה כראוי היא המספר המשמעותי של חלקיקים שנותרו מאוגד לאחר תיוג תא אשר לא ניתן להסיר בקלות על ידי צנטריפוגה קונבנציונלי. זה מוביל לעלייה רעשי רקע הדמיה ביו יכול להקנות ההשפעה הטרנספורמטיבית על תאי היעד הלא שכנות. בפרוטוקול זה, אנו מציגים אסטרטגיה חילופית חיץ מיקרופלואידיקה מבוסס אינרציאלית כפי שכונתה חלוקת זרימת דין (DFF) להפריד תאי שכותרתו ביעילות צירופים חינם באופן תפוקה גבוה. Microdevice הספירלה שפותח מסייע באיסוף רציף (> התאוששות תא 90%) של תאים מטוהרים (THP-1 ו MSCs) מרחפי פתרון חיץ חדש, תוך השגה> 95 דלדול% של צבע פלואורסצנטי מאוגד או צירופים טעונים לצבוע (silICA או PLGA). בשלב יחיד זה, אסטרטגית טיהור מבוססת תאי גודל מאפשרת קצב העברת נתוני עיבוד תא גבוה (10 6 תאים / min) והוא שימושי מאוד עבור טיהור תא גדול בנפח של תאים מהונדסי מייקרו / ננו-חלקיקים כדי להשיג יישום קליני ללא התערבות.
מבוא
סוכן טעון מייקרו / חלקיקי הנדסת תאים על ידי (NPS) היא שיטה פשוטה, גנומית אינטגרציה נטולה, צדדי כדי לשפר יכולת bioimaging ומגביר / להשלים התכונות הטיפוליות המקוריות שלו ברפואת רגנרטיבית. 1-3 שינויים סלולריים מושגות על ידי תיוג קרום או הציטופלסמה פלזמה עם ריכוז עודף של צירופים טעון סוכן להרוות את אתרי הקישור. עם זאת, החיסרון העיקרי של שיטה זו הוא כמויות משמעותיות של חלקיקים מאוגד הנותרים בתמיסה לאחר תהליכי תיוג תא, אשר יכולים לבלבל זיהוי מדויק של תאים מהונדסים חלקיק או לסבך תוצאות טיפוליות. 4,5 בנוסף, חשיפה צירופים המכילים טרנספורמטיבי סוכנים (גורמי גדילה, סטרואידים, וכו ') בריכוז גבוה יתר על מי....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
1. חלקיקים (NPS) תיוג של בתאי גזע mesenchymal ומונוציטים
- בתאי גזע mesenchymal התרבות (MSCs) במדיום של הנשר השונה של Dulbecco (DMEM) בתוספת 10% בסרום שור עוברי (FBS) ואנטיביוטיקה כדי ≥80% confluency לפני התיוג. באופן דומה, תרבות THP-1 תאים (ATCC) ברוזוול ממוריאל פארק המכון (RPMI) בינוני 1640 בתוספת 10% FBS כדי בצפיפות של ~ 10 6 תאים / מ"ל.
- צירופים סיליקה טען (~ 500 מיקרומטר) עם פתרון צבע calcein (200 מיקרומטר) באמצעות ערבוב בין לילה. לפברק AM PLGA-calcein (CAM) באמצעות פרוטוקול ש....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
לאחר סימון התאים עם צירופי סוכן טעון הדמיה ביו לילה, התאים שכותרתו (המכיל חלקיקים חינם) נקצרים מטוהרים על ידי microdevice ספירלת DFF להסיר צירופים חופשיים (איור 1 א) יחיד שלב בתהליך. 2-הכניסה, microchannel ספירלת 2-לשקע הוא תוכנן על ידי תוכנת הנדסת microfabricated באמצעות photoresist SU-8. פרוסות סיליקון בדוגמת מכן משמשות כתבנית דפוס העתק PDMS באמצעות טכניקות ליתוגרפיה רכות (איור 1 ב). כדי לבצע מיון תא, מדגם התא נש.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
טכנולוגית טיהור תא DFF המתוארת כאן מאפשרת הפרדה מהירה ומתמשכת של תאים שכותרתו באופן תפוקה גבוה. גישת פרדה זו היא אידיאלית עבור נפח דגימה גדול או עיבוד מדגם ריכוז תא גבוה, והוא טוב יותר מאשר סינון מבוסס קרום קונבנציונלי אשר נוטה וסותם לאחר שימוש ממושך. באופן דומה, הפרדה מגנטית מבוסס זיקה מחייב צעדי תיוג תא נוספים אשר מייגעים ויקרים. התאים מטוהרים מוצגים לשמור סוכני שכותרתו שלהם ומורפולוגיה תא היטב (איור 3) עם זרימה מינימלית / אפקטים הנגרמת גזירה (τ מאמץ הגזירה, ~ 2.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
החוקרים אין לי מה לחשוף.
תודות
מתנה אדיבה של תאי THP-1 מד"ר מארק צ'ונג וסיוע במיקרו-ייצור מד"ר יוג'ון קאנג וד"ר נישנט ו. מנון (בית הספר להנדסה כימית וביו-רפואית, האוניברסיטה הטכנולוגית נאניאנג) זכו להכרה רבה. פרויקט זה מומן על ידי NTU-Northwestern Institute of Nanomedicine (האוניברסיטה הטכנולוגית נאניאנג). HWH נתמך על ידי מלגת פוסט-דוקטורט של בית הספר לרפואה של לי קונג צ'יאן (LKCMedicine).
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| <קווי תאים חזקים> תאי גזע מדיה | |||
| מזנכימליים (MSCs) | Lonza | PT-2501 | |
| Dulbecco' s שונה Eagle' s בינוני (DMEM) | Lonza | 12-614F | |
| סרום בקר עוברי (FBS) | Gibco | 10270-106 | |
| תאי מונוציטים THP-1 (THP-1) | ATCC | TIB-202 | |
| מכון הזיכרון רוזוול פארק (RPMI) 1640 מדיה | Lonza | 12-702F | |
| <חזק>ריאגנטים & חומרים | |||
| 0.01% פולי-L-ליזין (PLL) | Sigma-Aldrich | P8920 | |
| 3 מ"ל מזרק | BD | 302113 | 3 מ"ל Luer-Lock |
| 60 מ"ל מזרק | BD | 309653 | מזרק 60 מ"ל Luer-Lock |
| סרום בקר אלבומין (BSA) | Biowest | P6154-100GR | |
| Calcein, AM (CAM) | Life Technologies | C1430 | |
| Calcein | Sigma-Aldrich | C0875 | |
| איזופרופנול | פישר כימי#P | /7507/17 | HPLC כיתה 2.5 ליטר |
| מלח פוספט חוצץ (PBS) | Lonza | 17-516Q/12 | |
| שקופיות מיקרוסקופ רגיל | פישר Scientific | FIS#12-550D | 75 x 25 x 1 מ"מ3 |
| פולידימתילסילוקסן (PDMS) | Dow Corning | SYLGARD® 184 | |
| סקוטש טייפ | 3M | 21200702044 | 18 מ"מ x 25 מ' |
| NPs סיליקה (∼ 200 μ m) | Sigma-Aldrich | 748161 גודל נקבוביות 4 ננומטר | |
| קצה מזרק | JEC Technology | 7018302 | 23 גרם 0.013 x 0.25 |
| טריפסין-EDTA (0.25%) | Life Technologies | 25200-056 | |
| Tygon Tubing | Spectra-Teknik | 06419-01 | 0.02 x 0.06 אינץ' 100 |
| פולי (D,L-לקטיד-קו-גליקוליד) (PLGA; 50:50) | סיגמא-אולדריץ' | P2191 | |
| <חזק>ציוד | |||
| ביופסיה אגרוף | האריס Uni-Core | 69036-15 | 1.50 מ"מ |
| Dessicator | Scienceware | 111/4 IN OD | |
| מצלמה מהירה | פנטום | V9.1 | |
| מיקרוסקופ ניגודיות פאזה הפוך | ניקון | Eclipse Ti | |
| מנקה פלזמה | האריק פלזמה | PDC-002 | |
| משאבת מזרק | Chemyx | CX Fusion 200 |
מקורות
- Wiraja, C., et al. Aptamer technology for tracking cells' status & function. Mol. Cell. Ther. 2, 33(2014).
- Yeo, D. C., Wiraja, C., Mantalaris, A., Xu, C. Nanosensors for Regenerative Medicine. J. Biomed. Nanotech. 10, 2722-2746 (2014).
- Naumova, A. V., Modo, M., ....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
