במבחנה מודלים Vivo ללמוד קרנית האנדותל-mesenchymal מעבר

סיכום

תרבות עיקרית של תאי אנדותל קרניים שור שמשה לחקור את המנגנון של מעבר אנדותל-mesenchymal הקרני. יתר על כן, מודל cryoinjury האנדותל עכברוש הקרני שמש להפגין מעבר אנדותל-mesenchymal קרני in vivo.

תקציר

תאי אנדותל קרנית (CECs) ממלאים תפקיד מכריע בשמירה על בהירות הקרנית באמצעות שאיבה פעילה. ספירת CEC מופחתת עלולה להוביל לבצקת בקרנית ולירידה בחדות הראייה. עם זאת, CECs אנושיים נוטים לפגיעה בפוטנציאל ההתפשטות. יתר על כן, גירוי של צמיחת תאים מסובך לעתים קרובות על ידי מעבר אנדותל-מזנכימלי הדרגתי (EnMT). לכן, הבנת המנגנון של EnMT נחוצה כדי להקל על התחדשות של CECs עם תפקוד מוכשר. במחקר זה, הכנו תרבית ראשונית של CECs בקר על ידי קילוף ה-CECs עם הממברנה של Descemet מכפתור הקרנית והראינו כי CECs בקר הציגו את תהליך EnMT, כולל שינוי פנוטיפי, טרנסלוקציה גרעינית של β-catenin, ומווסתי EMT חילזון ושבלול, בתרבית במבחנה. יתר על כן, השתמשנו במודל פגיעה באנדותל קרנית של חולדות כדי להדגים את תהליך EnMT in vivo. באופן קולקטיבי, התרבות הראשונית במבחנה של CECs בקר ומודלים של פגיעות קריותל בקרנית של חולדות in vivo מציעה פלטפורמות שימושיות לחקירת המנגנון של EnMT.

מבוא

תאי אנדותל קרנית (CECs) ממלאים תפקיד חיוני בשמירה על בהירות הקרנית ובכך על חדות הראייה על ידי ויסות מצב ההידרציה של סטרומה הקרנית באמצעות שאיבה פעילה¹. בגלל פוטנציאל ההתפשטות המוגבל של CECs אנושיים, מספר התאים יורד עם הגיל, ותיקון פצעי אנדותל בקרנית לאחר פציעה מושג בדרך כלל באמצעות הגדלה ונדידה של תאים, ולא מיטוזה של תאים². כאשר ספירת ה-CEC יורדת מתחת לסף של כ-500 תאים/מ"מ², לא ניתן לשמור על מצב ההתייבשות של סטרומה הקרנית, מה שמוביל לקרטופתיה בולוסית וללקות ראייה^3,4.

פוטנציאל ההתפשטות המוגבל של CECs אנושיים יוחס למספר גורמים, כולל ביטוי מופחת של גורם הגדילה האפידרמיס והקולטן שלו בתאים מזדקנים⁵, TGFβ2 אנטי-פרוליפרטיבי בהומור מימי⁶ ועיכוב מגע^2,7. למרות שגורמי גדילה מסוימים, כגון גורם גדילה פיברובלסטים בסיסי (bFGF), יכולים להגביר את ההתפשטות באנדותל קרנית אנושי מתורבת, יעילות התרבות נשארת מוגבלת^8,9. יתר על כן, CECs עשויים לעבור שינוי פנוטיפי במהלך התרחבות ex vivo, בדומה למעבר אפיתל-מזנכימלי (EMT) ^10-13. מעבר אנדותל-מזנכימלי (EnMT) מאופיין בחוסר יציבות של צומת התאים, אובדן קוטביות אפיקלית-בסיסית, סידור מחדש של השלד הציטו, ביטוי אקטין של שריר אלפא חלק והפרשת קולגן מסוג^{I 14}. כל המאפיינים הללו עשויים לבטל את התפקוד התקין של CECs, ולפגוע בשימוש ב-CECs בתרבית ex vivo בהנדסת רקמות. יתר על כן, EnMT נקשר לפתוגנזה של מספר מחלות אנדותל בקרנית, כולל ניוון קרנית אנדותל פוקס והיווצרות קרום רטרו-קרנית^15,16. לכן, הבנת המנגנון של EnMT עשויה לסייע במניפולציה של תהליך EnMT ולהקל על התחדשות של CECs כדי לאפשר תפקוד מוכשר.

במחקר זה, תיארנו שיטה לבידוד CECs של בקר מכפתור הקרנית. בתרבית הראשונית במבחנה, נצפה תהליך EnMT, כולל שינוי פנוטיפי, טרנסלוקציה גרעינית של β-catenin, ומווסתי EMT חילזון ושבלול. תיארנו עוד שיטה להדגמת EnMT in vivo על ידי שימוש במודל פגיעה באנדותל קרנית של חולדות. באמצעות שני המודלים הללו, הראינו כי מרימסטט, מעכב מטריצה מטאלופרוטאינאז (MMP) רחב ספקטרום, יכול לדכא את תהליך ה-EnMT. הפרוטוקולים המתוארים מקלים על ניתוח מפורט של מנגנון EnMT ופיתוח אסטרטגיות למניפולציה של תהליך EnMT להמשך יישום קליני.

פרוטוקול

כל הנהלים המיושמים במחקר זה עולה בקנה אחד עם האגודה לחקר משפט חזון עיניים עבור שימוש בבעלי חי עיניים וחזון המחקר אושרו על ידי ועדת הטיפול בבעלי החיים המוסדיים השתמש בבית החולים האוניברסיטאי הלאומיים בטייוואן.

1. ניתוק, הכנת התרבות ראשית ולאחר Immunostaining של השור CECs

1. רוכשת עיני שור טריות מטבחיים מקומי.
2. לחטא את העיניים בתוך 10% w / v פתרון povidone יוד במשך 3 דקות. לשטוף אותם עם תמיסת מלח פוספט שנאגר (PBS).
3. קציר את הכפתור הקרני עם אזמל ומספריים בתנאים סטריליים. מקלף את הממברנה של Descemet עם מלקחיים תחת מיקרוסקופ לנתח (לציין כי במחקר זה, בעיני השור היו enucleated ידי מטבחיים מקומי, ולכן הליך המחקר הראשון היה חיטוי בעיני preenucleated במעבדה).
4. דגירה הממברנה של Descemet ב 1 מ"ל של לנסותpsin על 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. אסוף את CECs שור על ידי צנטריפוגה ב 112 XG במשך 5 דקות. Resuspend תאי 1 מיליליטר של מדיום אפיתל הורמונלי השלים (שם) המכיל כמויות שווות של מדיום הנשר HEPES שנאגר השונה של Dulbecco והבינוני F12 של חם, בתוספת 5% בסרום שור עוברי, sulfoxide דימתיל 0.5%, 2 ng / ml של אפידרמיס אדם גורם הגדילה, 5 מ"ג / מ"ל ​​של אינסולין, 5 מ"ג / מ"ל ​​של transferrin, 5 ng / ml של סלניום, 1 nmol / L של רעלן הכולרה, 50 מ"ג / מ"ל ​​של גנטמיצין, ו -1.25 מ"ג / מ"ל ​​של B. amphotericin
5. זרעים תאים (כ 1 x 10 ⁵ תאים לכל עין) לתוך צלחת 6 ס"מ. תרבות אותם שם. דגירת הצלחת ב 37 מעלות צלזיוס אווירה של 5% CO ₂ באוויר. שינוי התרבות בינוני כל 3 ימים.
6. כאשר התאים מגיעים למפגש, לשטוף אותם PBS דגירה אותם ב 1 מ"ל של טריפסין על 37 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות. אסוף אותם על ידי צנטריפוגה ב 112 XG במשך 5 דקות. Re- להשעות את התא גלולה ב 1 מ"ל של שם טוב.
   1. ספירת התאים ב hemocytometer. זרעים התאים בשקופיות כיסוי בצפיפות של 1 x 10 ⁴ לכל היטב צלחת 24 גם, והתרבות התאים שם טוב. על חקירת השפעת EnMT-הדיכוי של marimastat, דגירת התאים שם טוב עם 10 מיקרומטר של marimastat הוסיפו לתוך מדיום התרבות, ולשנות את מדיום התרבות כל 3 ימים.
7. תקן את התאים בנקודת זמן מצוינת עם 250 μl של paraformaldehyde 4%, pH 7.4, למשך 30 דקות בטמפרטורת חדר. Permeabilize עם 250 μl של 0.5% Triton X-100 במשך 5 דקות. חסום עם אלבומין בסרום שור 10% למשך 30 דקות.
8. דגירת התאים עם נוגדנים ראשוניים נגד-קטנין ביתא הפעיל (ABC), חילזון, חילזון הלילה ב 4 ° C.. הדילול של הנוגדנים העיקריים בשימוש הוא 1: 200. הנוגדנים הם מדולל diluent נוגדן מורכב של 10 מ"מ PBS, 1% w / v אלבומין בסרום שור, ו 0.09% w / v אזיד הנתרן.
9. שוטפים את התאים פעמיים עם PBS במשך 15 דקות, דגירהמ 'עם נוגדנים משני מצומדות פלואוריד אלקסה (1: 100 ב diluent נוגדן) בטמפרטורת החדר למשך שעה 1.
10. Counterstain בגרעין התא על ידי כיסוי התאים עם 2 מיקרוגרם / מיליליטר של 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole, לשטוף את התאים פעמים עם PBS במשך 15 דקות, ו הר איתם נגד דהיית פתרון גובר.
11. להשיג תמונות immunofluorescent על אורכי גל עירור של 405 ו 488 ננומטר באמצעות מיקרוסקופ confocal סריקת לייזר עם 20X ההגדלה אובייקטיבי.

2. מודל עכברוש קרנית האנדותל Cryoinjury הזרקת Intracameral

1. להרדים 12 שבועות בן חולדות Sprague-Dawley זכר עם זריקה תוך שרירית של 2% xylazine (5.6 מ"ג / ק"ג) ו tiletamine בתוספת zolazepam (18 מ"ג / ק"ג). בעדינות לצבוט את העור של החיות כדי לאשר הרדמה תקינה בהעדר מתעוות עור.
2. להחדיר טיפה אחת של hydrochloride proparacaine 0.5% אל עינו הימנית של כל העכברים כדי למזער את הכאב העין ואת רפלקס מצמוץ. לְהַחדִירמשחת טטרציקלין לעין השמאל כדי למנוע יובש קרני.
3. מגניב בדיקת נירוסטה (קוטר = 3 מ"מ) בחנקן נוזלי. החלת את חללית הנירוסטה אל הקרנית המרכזית של עין ימין למשך 30 שניות. לעתים קרובות להנחיל PBS על עינו הימנית במהלך ההליך כדי למנוע יובש קרני.
4. להחדיר 0.1% אטרופין סולפט גנטמיצין 0.3% מייד לאחר cryoinjury ופעם יומי כדי להקל על כאב עיני נובע התכווצות ריסים ולמנוע זיהום.
   1. לאחר ההליך, לשמור על החולדות לחמם באמצעות מנורת חום, ולבחון החלים כל 15 דקות אחרי ההרדמה עד שהם להחזיר שליטה מוטורית. בנוסף, החל משח טטרציקלין לעין הזכות למנוע יובש קרני במהלך תקופת ההחלמה.
5. חזור על cryoinjury הקרנית במשך 3 ימים רצופים.
6. עבור אספקת marimastat או bFGF לתוך החדר הקדמי של עיני החולדה, להרדים החולדות כפי שתואר לעיל. להחדיר טיפה אחתשל hydrochloride proparacaine 0.5% אל תוך עינו הימנית כדי למזער את כאב עין ואת רפלקס המצמוץ.
7. להשקות את פני השטח של העין עם PBS סטרילית. בצע ניקור הלשכה הקדמית תחת מיקרוסקופ ההפעלה על ידי החדרת מחט 30 G מצורף מזרק 1 מ"ל על הקרנית ברור paralimbal במטוס מעל ובמקביל הקשתית.
8. סובבו את המחט שפוע למעלה, ומעט לדכא את הפצע בקרנית לנקז קצת הומור מימית ולהפחית את הלחץ התוך עיני. להזריק 0.02 מ"ל של התרופה intracamerally. בעדינות לדחוס את דרכי מחט עם קצה כותנה בזמן נסיגת המחט.
9. צלם את שלהוציא בנקודת זמן מצוינת מתחת למיקרוסקופ ההפעלה.

3. קצירי העכברוש קרני לחצן ו Immunostaining

1. כדי להרדים את החולדות, למקם אותם בתא המתת חסד להשרות 100% CO ₂ בקצב מילוי של 10-30% מנפח התא לדקה. שמור עירוי CO ₂ עבורדקה נוספת אחרי חוסר נשימת צבע עיניים דהוי.
2. לחדור לעין עכברוש בבית לימבוס עם להב חד. חותך את הקרניות במספריים קרניים לאורך לימבוס. שטח את הקרניות בשקופית. ודא חתכים רדיאליים נוספים אם הקרניות להתכרבל.
3. תקן את קרניות עם 250 μl של paraformaldehyde 4%, pH 7.4, למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר. Permeabilize עם 250 μl של 0.5% Triton X-100 במשך 5 דקות, ולחסום עם אלבומין בסרום שור 10% למשך 30 דקות.
4. דגירה קרנית עם נוגדנים ראשוניים נגד ABC הלילה ב 4 ° C עם דילול של 1: 200 ב diluent נוגדן. שטפו את קרניות פעמיים עם PBS במשך 15 דקות, דגירה אותם עם נוגדנים משני (1: 100 ב diluent נוגדן) בטמפרטורת החדר למשך שעה 1. Counterstain בגרעין התא על ידי כיסוי תאים עם 2 מיקרוגרם / מ"ל ​​של 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole, לשטוף את התאים פעמיים עם PBS במשך 15 דקות.
5. הר הקרני בתמיסה נגד דהייה גוברת. אובטיין התמונות immunofluorescent באורכי גל עירור של 405 ו 561 ננומטר באמצעות מיקרוסקופ confocal סריקת לייזר ב 20X ההגדלה אובייקטיבי.

תוצאות

לאחר בידוד של CECs שור, התאים היו בתרבית במבחנה. איור 1 מציג את התמונות בניגוד שלב של CECs שור. צורת המשושה של התאים בנקודת המפגש ציינה כי התאים לא היו מזוהמים על ידי פיברובלסטים סטרומה הקרניים במהלך בידוד תא. איור 2 מתארים את immunostaining כי בוצע באמצעות נוגדנים נגד ABC, חילזון, חילזון בנקודת זמן מצוינת. מלבד שינויים פנוטיפי בתרבות במבחנה, טרנסלוקציה גרעין מקבילה של רגולטורי ABC ו- EMT נצפתה. <...

דיון

CECs ידוע נטייתן לעבור EnMT במהלך התפשטות תאים. כדי לפתח אסטרטגיות דיכוי תהליך EnMT למטרות טיפוליות, הבנה מעמיקה של מנגנון EnMT הכרחית. תיארנו 2 דגמים לחקור EnMT, כלומר CEC שור במודל תרבות במבחנה דגם cryoinjury האנדותל עכברוש הקרנית. התוצאות שלנו הוכיחו את תהליך EnMT בשני המודלים. יתר על כן, השפעת מדכאי EnMT של marimastat שוחזרה בשני המודלים, דבר המצביע על כך 2 דגמים אלה לשתף אותו המנגנון.

ועדת ...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
טריפסין	תרמו-פישר סיינטיפיק	12604-013
דולבקו s שונה Eagle medium ו-Ham's F12 medium	ThermoFisher Scientific	11330
סרום בקר עוברי	ThermoFisher Scientific	26140-079
דימתיל סולפוקסיד	Sigma	D2650
גורם גדילה אפידרמיס אנושי	ThermoFisher Scientific	PHG0311
אינסולין, טרנספרין, סלניום	ThermoFisher Scientific	41400-045
רעלן כולרה	סיגמא	C8052-1MG
גנטמיצין	ThermoFisher Scientific	15750-060
אמפוטריצין B	ThermoFisher Scientific	15290-026
פרפורמלדהיד	מדעי מיקרוסקופיה אלקטרונית	111219
טריטון X-100	סיגמא	T8787
אלבומין סרום בקר	סיגמא	A7906
מרימסטט	סיגמא	M2699-25MG
נוגדן בטא-קטנין אנטי אקטיבי	Millpore	05-665
נוגדן נגד חלזונות	סנטה קרוז	sc28199
נוגדן נגד שבלול	סנטה קרוז	sc15391
עז נגד עכבר IgG (H+L) משני נוגדן	ThermoFisher Scientific	A-11001	לצביעה של ABC של בקר CECs עזים
נגד עכבר IgG (H+L) נוגדן משני	ThermoFisher Scientific	A-11003	לצביעה של ABC של חולדה אנדותל
קרנית עז נגד ארנב IgG (H+L) נוגדן משני	ThermoFisher Scientific	A-11008	לצביעה של חילזון ושבלול של בקר CECs
מדלל נוגדנים	Genemed ביוטכנולוגיות	10-0001
4',6-diamidino-2-phenylindole	ThermoFisher Scientific	D1306
הרכבה בינונית	Vector Laboratories	H-1000
מיקרוסקופ קונפוקלי לסריקת לייזר	ZEISS	LSM510
קסילזין	באייר	N/A
טילטמין בתוספת zolazepam	Virbac	N/A	תרופה וטרינרית
פרופרקאין הידרוכלוריד תמיסת עיניים	Alcon	N/A	תרופה וטרינרית
0.1% אטרופין	Wu-Fu Laboratories Co., Ltd	N/A	תרופה קלינית
0.3% גנטמיצין סולפט	תרופה קלינית	Sinphar Group	N/A
גורם גדילה פיברובלסטים בסיסי	תרמו-פישר סיינטיפיק	PHG0024	תרופה קלינית