הליך להשתלת תאי סרטן לבלב פלואורסצנטיים ירוקים המבטאים חלבון פלואורסצנטי (PANC-1 GFP) באופן אורתוטופי לתוך הלבלב של עכברי Balb-c Ola Hsd-Fox1nu כדי להעריך את התקדמות הגידול והגרורות מוצג כאן.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
במאמר זה
סיכום
תקציר
סרטן לבלב נשאר אחד מסוגי הסרטן עבורו הישרדות לא השתפרה באופן משמעותי בעשורים האחרונים. רק 7% מהחולים מאובחנים ישרדו יותר מחמש שנים. על מנת להבין לחקות את המיקרו-סביבה של גידולים בלבלב, השתמשנו במודל orthotopic Murine של סרטן הלבלב, המאפשרת הדמיה לא פולשנית של התקדמות הגידול בזמן אמת. תאי סרטן לבלב לבטא חלבון פלואורסצנטי ירוק (Panc-1 GFP) הושעו במטריצת קרום במרתף, ריכוז גבוה, (למשל, Matrigel HC) עם סרום ללא מדיה ולאחר מכן מוזרק לתוך הזנב של הלבלב באמצעות פיום בטן. השעית התא במטריצת הקרום במרתף ריכוז הגבוה הופכת חומר דמוי ג'ל ברגע שהוא מגיע לטמפרטורת חדר; ולכן, זה ג'לים כאשר הוא בא במגע עם הלבלב, יצירת חותם במקום ההזרקה ומניעת דליפת תא. צמיחת גידולים וגרורות לאיברים אחרים מנוטרים חיחיות באמצעות קרינה. זה קריטי להשתמש במסנני מתאים עירור ופליטה של GFP. הצעדים להשתלה orthotopic מפורטים במאמר זה כל כך החוקרים יכולים לשכפל את ההליך בקלות בעכברים בעירום. השלבים העיקריים של פרוטוקול זה הם הכנת תרחיף תאים, ההשתלה כירורגית, ו פלורסנט הגוף כולו בתחום ההדמיה vivo. מודל orthotopic זה נועד לחקור את היעילות של הרפוי רומן על גידולים ראשוניים גרורתי.
מבוא
סרטן הלבלב מאובחן עם שכיחות מוגברת בהשוואה לסוגים אחרים של סרטן, והוא הגורם המוביל 4 th של מקרי מוות הקשורים לסרטן בארצות הברית. מרגע אבחון, מעל 90% מהחולים מתים תוך חמש שנים 1,2. נכון לעכשיו, הסרת גידול כירורגית היא התרופה היחידה לסרטן לבלב, אך פחות מ -20% מהחולים כשירים לעבור ניתוח בעיקר בגלל בעת אבחנת המחלה נמצאת בשלב מתקדם יש גרורות 3,4. היעדר סימפטומים ספציפיים עושה סרטן לבלב מחלה שקטה; חלק מהתסמינים כולל כאבי בטן, כאבי גב, חוסר תיאבון, צהבת ובחילות; אשר יכול להתפרש בקלות כמו מחלות עיכול נפוצות 4. מסיבה זו, חשוב לפתח כלים תרופתיים חדשים כדי לסייע באבחון והטיפול בסרטן לבלב.
השימוש במודלים של בעלי החיים מאפשר לנו להבין את הביולוגיה של pancreסרטן atic ומספק תובנה יישום הידע הזה לבני אדם. מודלים orthotopic xenograft של סרטן הלבלב הם מציאותיים, כי גידולים לגדול האיבר ממוצא 5. בניגוד למודלי heterotopic, שבו שורות תאים או שברי גידול הם מושתלים מתחת לעור, דוגמנות orthotopic מאפשרת הבילוי של microenvironment הגידול ומחק את האינטראקציה של תאים סרטניים עם סביבתה 6. המודל xenograft המתואר כאן נובעת גידולים משורת תאים סרטניים אנושיים הלבלב GFP Panc-1, אשר מהונדסים גנטית כדי לבטא את חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP). זיהוי GFP מאפשר עבור הדמיה לא פולשנית וניטור של גידול וגרור 7. התפתחות גידולים מתרחשת במהירות, באופן ספונטני, דומה מאוד לזה של גידולים ראשוניים של חולי סרטן לבלב אנושיים 8. מודלי Orthotopic לספק חיזוי מדויק יותר של יעילות תרופה בתגובת סוכנים טיפוליים, תוךמחקה את המיקרו-סביבה של הגידול.
כאמור, מודל זה חי מאפשר זיהוי ניאון של גידול וגרור בזמן אמת. איתור פלורסנט מאפשר הדמיה ישירה / חיות לעומת הארה. עם קרינת האור הנפלט היא תוצאה של עירור על ידי אור אחר של אורך גל קצר יותר; ואילו הארה, האור הנפלט הוא התוצאה של תגובה כימית, וייתכן שלא יהיה 9 פליטה חזקה. יתר על כן, כל הגוף הדמיה ניאון vivo אינה מזיקה החיה מאפשר לחוקרים לעקוב אחר גדילת הגידול לאורך זמן בתגובה לטיפולים.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
הפרוטוקול המתואר להלן מבוצע תחת הדרכתו ואישור של טיפול בבעלי חיים מערבי אוניברסיטת ועדת שימוש. כל הניסויים מבוצעים בהתאם לכל ההנחיות הרלוונטיות, רגולציה רשויות רגולטוריות.
1. תרבית תאים
- הכנת בינוני מלא
- שימוש בארון בטיחות ביולוגי Class II, להכין מדיום מלא ידי בסביבה נקיה מחיידקי הוספה בסרום שור עוברי (FBS) ו סטרפטומיצין פניצילין (P / S) כדי בקבוק 500 מיליליטר של מדיום RPMI. מערבבים בעדינות על ידי מתערבל. הריכוז הסופי של כל תוסף הוא 10% FBS ו -1% P / S (v / v). לדוגמה, להשלים 500 מ"ל של התקשורת עם 56 FBS מ"ל ו -6 מ"ל P / S.
- מניחים בינוני מלא באמבט מים ב 37 ° C.
- מפשיר תאים Propagating
- תחזר תאי GFP Panc-1 מ חנקן נוזלי. להפשיר את הבקבוקון על ידי תסיסה עדינה באמבט מים ב 37 ° C.
הערה:פשרה צריכה להיות מהירות (כ 2 - 3 דקות). - לייבל T-75 צלוחיות לשמש עם (א) שם תא אונליין, (ב) מספר המעבר, (ג) תאריך, ו- (ד) ראשי התיבות של החוקר.
- נגב את הבקבוקון עם 70% אתנול ו העברת בקבוקון בארון בטיחות ביולוגי.
- כדי להפיץ את התאים, להוסיף 9.0 מ"ל של בינוני מלא צינור חרוטי 15 מ"ל. בעזרת פיפטה 1.0 מ"ל, ולהעביר את ההשעיה התא בזהירות להתלותו ב 9 מ"ל של מדיום שלם.
- צנטריפוגה ב 125 XG במשך 8 דקות ב RT. מעביר את בקבוקון החרוטים לארון בטיחות ביולוגי ו לשאוב supernatant מבלי להפריע הגלולה.
- להשעות גלולה ב 10 מ"ל של מדיום שלם טרי ידי pipetting ההשעיה בעדינות מעלה ומטה.
- ספירת התאים עם hemocytometer צלחת אותם צלוחיות T-75 בצפיפות של 2.1 x 10 6 תאים / בקבוקון. מניחים בקבוק באינקובטור ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2.
- צג התאים יומי לפי עין ותחת מיקרוסקופ. אם שפעתid חידוש נדרש, בסביבה נקיה מחיידקים לשאוב את מדיום הגידול להשלים מהבקבוק וזורק. להוסיף נפח שווה של בינוני שלם טרי.
- תחזר תאי GFP Panc-1 מ חנקן נוזלי. להפשיר את הבקבוקון על ידי תסיסה עדינה באמבט מים ב 37 ° C.
- הפצת תאים
- בסביבה נקייה מחיידקים, להסיר בינוני מהבקבוק. הוסף 5 מ"ל של תמיסת מלח פוספט חיץ של Dulbecco (DPBS) כדי לשטוף תאים וזורקים.
- לנתק את התאים מהבקבוק על ידי הוספת 3 מ"ל של טריפסין 0.25%. דגירת בקבוק המכיל טריפסין ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 למשך 5 עד 10 דקות.
- שימו לב תאים תחת המיקרוסקופ (בהגדלת 10X) ולוודא שהם עגולים וחלצו.
- לנטרל טריפסין על ידי הוספת נפח שווה של בינוני מלא ולשבור את גושים ידי pipetting בעדינות מעלה ומטה.
- ספירת התאים באמצעות hemocytometer ולהעביר את נפח תא ההשעיה המתאים צלוחיות חדשות על צפיפות התאים מוזכרת 1.2.7; להוסיף מספיק תקשורת טריה ולכן הנפח הסופי הוא 10 מ"ל לכל בקבוק.
- Cell Suspensהכנת יון עבור הזרקה
הערה: מאז מטריקס הקרום במרתף, ריכוז גבוה, מבצר ב RT, לשמור את כל החומרים על קרח. מניחים את כל הטיפים פיפטה סטרילית בקבוקונים במקפיא למשך הלילה, ולשמור על הקרח תוך כדי עבודה על ההשעיה.- שמור בקבוק של RPMI תקשורת ללא כל תוספים על קרח. להפשיר את מטריקס קרום במרתף, ריכוז גבוה, על ידי ביצוע הוראות היצרן. רצוי, aliquot לתוך צלוחיות קטנות יותר כדי למנוע להקפיא להפשיר מחזורים מרובים 10.
- התקשורת לשאוב מכל צלוחיות, ולשטוף עם 5 מ"ל של DPBS. חזרה על כל השלבים בסעיף הקודם עד שלב 1.3.4.
- העבר תוכן לצינור צנטריפוגות חרוטי 15 מ"ל ב 125 XG במשך 8 דקות ב RT. עבר בקבוקון חרוטים לארון biosafety מחדש להשעות גלולה באמצעות 10 מיליליטר של DPBS.
- בעדינות פיפטה ההשעיה למעלה ולמטה כדי לשבור את הגלולה. ספירת תאים באמצעות hemocytometer.
- צנטריפוגות שוב כמתואר בסעיףTEP 1.4.3. לשאוב supernatant תלוי במספר התאים, להוסיף diluent המתאים להניב 3 x 10 6 תאים לתוך נפח של 50 μl. Diluent יהיה תערובת של תקשורת חופשית בסרום קרום מטריקס במרתף בריכוז גבוה במיוחד ביחס של 1: 1 (V / V).
- וורטקס ההשעיה בעדינות ולשמור על הקרח בכל עת. ההשעיה היא כעת מוכנה להזרקה.
- השרשה כירורגי
הערה: ודא שכל החומרים והכלים כירורגית הם עקרים. לתרגל טכניקות מזוהמות בכל העת.- הנח כרית חימום על השולחן ומכסה וילון סטרילית. הגדר את מכונת ההרדמה ולהבטיח את כל האספקה היא בהישג היד.
- מניח את האף של בעל החיים לתוך מסכת ההרדמה ולהקים ההרדמה עד 1 L / min חמצן ו -2.5 isoflurane%.
- לשפשף בעדינות את צד גופה של חיה עם יוד, ולשטוף עם אתנול 70%. חזור שלוש פעמים.
- אשר אתחיה בהרדמה מלאה על ידי צובט את הכף האחורית. החיה היא בהרדמה מלאה ומוכנה לניתוח אם אין תגובה הוא ציין. עם זאת, אם בעל החיים נרתע, להבטיח שיש הרדמה מספיק מאדה ולאפשר החיה יותר זמן ללכת לגמרי בהרדמה.
- טען כ 200 μl של השעיה התא לתוך מזרק TB 1.0 מ"ל עם מחט 18 G (מקורר בעבר). החלף את המחט עם מחט 27 G ולחזור קרח עד מוכן לשימוש.
- אתר את האזור הכללי של הטחול (ברבע העליון השמאלי של הבטן) ו מלקחיים באמצעות לצבוט את העור על גבי אזור זה. בעזרת מספריים כירורגיות עושים חתך של כ 1.0 ס"מ כדי ליצור כיס. באופן דומה, לצבוט את השריר החלק על גבי הטחול לחתוך כדי לגשת חלל הצפק.
- בעדינות לתפוס את סוף הזנב של הטחול ולמשוך אותו אל מחוץ לגוף. הלבלב יצורף הטחול. מורחים את הלבלב באמצעות רטוב stQ-Tip erile ולאתר את הזנב של הלבלב.
- לספק את הזריקה 50 μl לתוך הזנב של הלבלב, להשאיר את המחט בתוך 10 שניות לאט לסובב את המחט של הלבלב. השתלה מוצלחת תיראה כמו בועה שטחית ללא דליפות.
- החזר את הלבלב והטחול אל חלל הצפק. ראשית להקיף את השריר ואז להקיף את העור בנפרד. השתמש 6-0 תפר או מצרך כדי לסגור את החתך. כדי למנוע כאבים בעלי חיים, לנהל ketoprofen תת עורית (SC) (5 מ"ג / ק"ג) מעל 24 שעות. לחלופין, לנהל sc עצירות (0.05 - 0.1 מ"ג / ק"ג) כל 12 שעות במשך 36 שעות.
- לשחזר את החיה מן ההרדמה ולהחזירו לכלוב שלה. גם לפקח על כאב. בעלי חיים חייבים להיות מסופקים עם הקלה על כאב בזמן (או אפילו לפני - מנע) ניתוח. הקלה על כאב נוסף חייבת להינתן לבעלי חיים החווים כאב פי IACCUC-פרוטוקול או כפי שקבע בוטיפל וטרינר או שלוחיהם.
- בתחום ההדמיה vivo
הערה: לכידת תמונה בוצעה באמצעות מערכת הדמיה מסחרית מצוידת בתא חושך את המסננים המתאימים הדמית GFP. תמונה הרכישה נעשתה באמצעות מצלמת CCD ו מערכת אופטית המורכבת עדשות עירור להחלפה / פליטה (עירור: 455 - 495 ננומטר; פליטה: 513 - 557 ננומטר). תמונות שדה מוארות נתפסו ללא מסנן 1 x 1 binning עבור כל נקודת זמן. עירור של ה- GFP מנוצל מקור אור multispectral קסנון. בעלי החיים היו מתוחזקים בהרדמה לאורך כל תהליך ההדמיה ידי חיבור מכונת הרדמת סעפת גז הרדמה משולבת לתוך התא האפל של מערכת ההדמיה.- להרדים את החיה כפי שמתואר 1.5.2. מסיכת הרדמה היא בחלק הפנימי של החדר החשוך של מערכת ההדמיה המסחרית כדי לשמור על בעלי החיים תחת הרדמה במהלך ההדמיהתַהֲלִיך.
- הגדרת מסננים עירור ופליטה הנכון.
- בגין על ידי קבלת תמונה ראשונית באמצעות אור לבן בלבד. שמור באותה תנוחה של החיה לאורך כל הפגישה הדמיה ולעבור מסננים GFP לקחת דימוי נוסף.
- לקבלת התוצאות הטובות ביותר להרכיב שתי התמונות. לנתח את התמונה עבור אזור העוצם פלורסנט.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
שיטה זו מתארת השתלת orthotopic כירורגית של תאי סרטן לבלב אנושיים פלורסנט, התמקדות הכנת השעית התא להזרקה, הרדמה תקינה מכרסמים, משלוח של תרחיף תאים באמצעות פיום בטן, ושימוש ניאון in vivo הדמית חיה קטנה. הגילוי של אותות קרינה ירוקים (אות ה- GFP) בין שניים ושלושה שבועות לאחר השתלה, מספק לחוקרים רמז חזותי כדי לאשר את קיומו של גידול סרטן לבלב פיתוח (איור 1). איור 1 מורכב משלוש תמונות של עכבר עם Panc-1 GFP גידו...
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
אנו מתארים מודל בעכברים orthotopic של סרטן הלבלב המבטא GFP, ובכך מאפשר ניטור פולשני של הגידול באמצעות הגוף כולו בתחום ההדמיה ניאון vivo (איור 1). טכניקה זו מאפשרת לנו לפקח על התפתחות גידולים בזמן אמת (איור 3); זה יכול להיות כלי חשוב לחוקרים ללמוד את היעילות הטיפולית של סוכני רומן נגד סרטן לבלב. היבט חשוב נוסף של מודל זה הוא כי קרינת GFP מספקת רמז חזותי מציין השתלה לצמיחה מוצלחת של סרטן לבלב; אשר שאחרת קשה לאמוד בבעלי חיים. עולה ב...
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
החוקרים אין לי מה לחשוף.
תודות
אנו מודים לאוניברסיטה המערבית למדעי הבריאות על המענק הפנימי.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| RPMI media 1640 | Caisson Labs | RPL03-500ML | |
| סרום בקר עוברי | ג'יבקו | 10437-077 | |
| סטרפטומיצין פניצילין | Thermo Ficher Sci | 15140-122 | |
| Matrigel HC קרום בסיס, קורנינג 354248 | |||
| SutureVet PGA 6-0 PGA | Henry Schein | 39010 | |
| Alcare או Foam Antiseptic | Handrub Steris | 639680 | |
| DPBS (תמיסת מלח פוספט של Dubelcco) | מזרק Thermo Ficher Sci | 21300025 | |
| TB 27 גרם 1/2 | Becton Dickinson | 305620 | |
| Isoflurane | Blutler Schein | 50562 | |
| Ketoprofen | Fort Dodge | ||
| , 5.5 אינץ' מיונז ישר | הנרי שיין | 22-1600 | |
| PANC-1 קו תאים GFP | מערכת הדמיה לבעלי חיים קטנים נגד סרטן, בע"מ | ||
| : iBox Scientia | UVP, LLC. אפלנד, קליפורניה. | מערכת הדמיה של בעלי חיים קטנים לצפייה בגידול הפלואורסצנטי בבעלי חיים |
מקורות
- Siegel, R. Pancreatic Cancer Stats: American Cancer Society: Cancer Facts & Figures. , Available from: http://www.cancer.org/acs/groups/content/@research/documents/webcontent/acspc-042151.pdf (2014).
- Smyth, E., Cunningham, D. Harrison's Principles of Internal Medicine. Kasper, D., et al. , 19th edn, McGraw-Hill Education. (2015).
- Mahipal, A., Frakes, J., Hoffe, S., Kim, R. Management of borderline resectable pancreatic cancer. World J Gastrointest Oncol. 7, 241-249 (2015).
- De La Cruz, M. S., Young, A. P., Ruffin, M. T. Diagnosis and management of pancreatic cancer. Am Fam Physician. 89, 626-632 (2014).
- Frese, K. K., Tuveson, D. A. Maximizing mouse cancer models. Nat Rev Cancer. 7, 645-658 (2007).
- Hoffman, R. M. Patient-derived orthotopic xenografts: better mimic of metastasis than subcutaneous xenografts. Nat Rev Cancer. 15, 451-452 (2015).
- Hoffman, R. M. The multiple uses of fluorescent proteins to visualize cancer in vivo. Nat Rev Cancer. 5, 796-806 (2005).
- Jiang, Y. J. Establishment of an orthotopic pancreatic cancer mouse model: cells suspended and injected in Matrigel. World J Gastroenterol. 20, 9476-9485 (2014).
- Arranz, A., Ripoll, J. Advances in optical imaging for pharmacological studies. Front Pharmacol. 6, 189(2015).
- Corning. Corning Matrigel Matrix: Frequently Asked Questions. , Available from: http://csmedia2.corning.com/LifeSciences/media/pdf/faq_DL_026_Corning_Matrigel_Matrix.pdf (2013).
- Metildi, C. A., Kaushal, S., Hoffman, R. M., Bouvet, M. In vivo serial selection of human pancreatic cancer cells in orthotopic mouse models produces high metastatic variants irrespective of Kras status. J Surg Res. 184, 290-298 (2013).
- Kim, M. P. Generation of orthotopic and heterotopic human pancreatic cancer xenografts in immunodeficient mice. Nat Protoc. 4, 1670-1680 (2009).
- Katz, M. H. Survival efficacy of adjuvant cytosine-analogue CS-682 in a fluorescent orthotopic model of human pancreatic cancer. Cancer Res. 64, 1828-1833 (2004).
- Bouvet, M. Real-time optical imaging of primary tumor growth and multiple metastatic events in a pancreatic cancer orthotopic model. Cancer Res. 62, 1534-1540 (2002).
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
