הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

עמית תרבות Microbiome חי עם Microengineered אדם המעיים villi בתוך גוט-על-שבב מכשיר microfluidic

22.5K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/54344

⸱

30 באוגוסט 2016

 ,  ,  ,  , 
1Department of Biomedical Engineering, The University of Texas at Austin, 2Wyss Institute for Biologically Inspired Engineering at Harvard University, 3Vascular Biology Program, Boston Children's Hospital, Harvard Medical School, 4John A. Paulson School of Engineering and Applied Sciences, Harvard University

במאמר זה

סיכום

אנו מתארים פרוטוקול במבחנה Microbiome במעיים שיתוף תרבות villi מעיים במשך תקופה ארוכה באמצעות אדם בטן-על-שבב מערכת microphysiological.

תקציר

כאן אנו מתארים פרוטוקול לבצע לטווח ארוך שיתוף התרבות של Microbiome במעיים רב המין האנושי עם villi המעי microengineered בתוך האדם בטן-על-שבב מכשיר microphysiological. אנחנו לשחזר את ממשק רקמות לומן-נימי המעי במכשיר microfluidic, שבו דפורמציות מכני פיזיולוגיים זרימת גזירה נוזל מוחלים כל הזמן לחקות תנועה פריסטלטית. ב microchannel לומן, האפיתל במעי האדם תאים קאקו-2 הם מתורבתים לגבש האפיתל סיסי 'נבט חינם' ו להתחדש villi המעי הדק. תאי חיידקים טרום בתרבית הם מחוסנים לתוך צד לומן להקים מערכת אקולוגי מארח חיידק. אחרי תאי חיידקים לדבוק למשטח הפסגה של villi, זרימת נוזל דפורמציות מכאניים יתחדשו לייצר microenvironment יציב שבו מדיום תרבות הטריה מסופק כל זמן וחיידקים מאוגדים (כמו גם פסולי חיידקים) יוסרו באופן רציף. לאחר שיתוף התרבות המורחבת from ימים עד שבועות, microcolonies המרובה הם מצאו להיות ממוקמים באופן אקראי בין villi, ושניהם חיידקים ותאים אפיתל להישאר קיימא ופונקציונליים עבור שבוע אחד לפחות בתרבות. פרוטוקול שיתוף תרבות שלנו ניתן להתאים לספק פלטפורמה תכליתי עבור מערכות אקולוגיות מאכסן Microbiome אחרים שניתן למצוא באיברים אנושיים שונים, אשר עשוי להקל במחקר במבחנה של תפקיד Microbiome האדם מנצח בבריאות ובחולי.

מבוא

מעי האדם מטפח מערך מגוון מדהים של מינים של חיידקים (<1,000 מינים) ומספר עצום של תאי מיקרוביאליים (10 פעמים יותר מאשר תאי מארחי האדם) וגנים (100 פעמים יותר מאשר הגנום האנושי) 1. Microbiomes אדם אלה ממלא תפקיד מרכזי בחילוף חומרים מזינים xenobiotics, ויסות מערכת חיסונית, ושמירת הומאוסטזיס 2 מעיים. באופן לא מפתיע, בהתחשב פונקציות מגוונות אלה, Microbiome הבטן commensal בהרחבה מודולציה בבריאות ובחולי 3. לכן, להבנת תפקידו של Microbiome במעי אינטראקציות בין מאכסן חיידק הם בעלי חשיבות רבה לקדם עיכול (GI) בריאות ולחקור רפויים חדש לטיפול בבעיות מעיים 4. עם זאת, קיימים מודלים המעי במבחנה (למשל, תרבויות סטטי) להגביל מאכסן Microbiome שיתוף תרבות לתקופה קצרה של זמן (<1 יום) כי תאי חיידקים לגדול יותר ופשרה מחסום המעייםפונקציה 5. במודלים של בעלי חיים סרוגייט (למשל, נבט חינם 6 או מהונדסים גנטית עכברים 7) הם גם לא נפוץ ללמוד crosstalk Microbiome מארח-בטן משום קולוניזציה ותחזוקה יציבה של Microbiome מעי אנושי קשה.

כדי להתגבר על אתגרים אלה, פיתחנו האדם biomimetic לאחרונה "גוט-על-שבב" מערכת microphysiological (איור 1 א, משמאל) לחקות את האינטראקציות Microbiome מארח-gut המתרחשות במעי האדם החיים 5,8. במעיים-על-שבב microdevice מכיל שני ערוצים microfluidic במקביל מופרד על ידי מטריקס גמיש, נקבובי, תאי (ECM) קרום מצופה צופה על ידי תאים אנושי מעי אפיתל קאקו-2, חיקוי ממשק רקמות לומן-נימי המעיים (איור 1A 9, מימין). אבק מונחה דפורמציות קצבית מחזורית לגרום דפורמציות מכאניות פיסיולוגיות המחקות שינויים בדרך כלל inducאד על ידי תנועה פריסטלטית (איור 1 א, ימין). מעניין, כאשר תאי קאקו-2 גדלים בתוך מעי-על-שבב עבור יותר מ -100 שעות, הם יוצרים באופן ספונטני תלת ממדי (3D) villi מעי עם צומת הדוקים, גבולות מברשת פסגה, תאי שגשוג מוגבלים מאורות הבזליים, ייצור ליחה, פעילות חילוף חומרים סמים מוגברת (למשל, ציטוכרום P450 3A4, CYP3A4), וגלוקוז משופרת reuptake 8. ב microenvironment 'נבט חינם' זה, אפשר היה לשתף תרבות הגנרלגוברנמן רמנוסוס לקטובצילוס פרוביוטי או במערך הטיפולי של תערובת חיידקים פרוביוטיים עם תאי אפיתל המארח עד שבועיים 5,10.

במחקר זה, אנו מתארים את הפרוטוקול המפורט לביצוע Microbiome מארח-gut שיתוף תרבות במעיים-על-שבב במכשיר במשך תקופה ארוכה. בנוסף, אנו דנים בנושאים קריטיים ואתגרים פוטנציאל להיחשב עבור יישום רחב של p תרבות שיתוף מאכסן Microbiome זהrotocol.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

Microfabrication 1. התקן גוט-על-שבב

הערה: בטן-על-שבב הוא מכשיר microfluidic שנעשו על ידי פולימר סיליקון שקוף, גז חדיר (polydimethylsiloxane, PDMS), המכיל שני microchannels מקבילים (רוחב 1 מ"מ x 150 מיקרומטר גובה x 1 ס"מ אורך) מופרדים על ידי גמישים נקבובי (10 מיקרומטר קוטר נקבובי, 25 מיקרומטר נקבוביים המרווח להתעמק) PDMS קרום 5,9. לפברק במעיים-על-שבב (איור 1 א, משמאל) ביצוע הצעדים.

  1. נוהל microfabrication של גוט-על-שבב 5,9.
    1. הכן PDMS דפוקה, degassed על ידי ערבוב prepolymer PDMS ואת הסוכן ריפוי (15: 1 w / w), ומניחים אותו בתוך ייבוש ואקום במשך 30 דקות.
    2. יוצקים 30 גרם ו -3 גרם של PDMS דפוקה, degassed על כל תבנית סיליקון כי יש מבוסס SU-8 micropatterns של העליון ואת microchannels התחתון של הבטן-על-שבב, בהתאמה. ואז לרפא על 60 מעלות צלזיוס בתנור יבש במשך lhr 4 ממזרח.
    3. Demold שכבות PDMS העליונים והתחתונים מכל תבנית סיליקון בחתך סביב קצה באמצעות אזמל כירורגי. פונץ '6 חורים (שני פתחי כניסה, שני שקעים, ושני תאי ואקום) באמצעות אגרופן ביופסיה (2.0 מ"מ קוטר חור).
    4. הכן את הממברנה הנקבובי ידי שפיכת 10 גרם של PDMS הדפוקה ו degassed על פרוסות סיליקון silanized המכילות מערכים פוסט עם עמודים עגולים (10 מיקרומטר קוטר, 25 מיקרומטר גובה) שכיסו עם שטוח, silanized שכבת תמיכת PDMS (15: 1, w / w; 1 ס"מ עובי). מניחים פרסר במשקל 3 ק"ג על ההתקנה ולרפא הפולימר ב 60 מעלות צלזיוס למשך 12 שעות או יותר.
    5. Demold ההתקנה של קרום PDMS נקבובי דבק לוח תמיכת PDMS מן פרוסות סיליקון על ידי הרמה בפינה של הלוח בזהירות מן הרקיק, ואת הקילוף עד הממברנה PDMS הנקבובית מנותקת לחלוטין מן הרקיק.
    6. לחשוף את צד הערוץ של שכבה עליונה (PDMS, 15: 1, w / w) וצד הקרום הנקבובי אל plאסמא שנוצר על ידי treater קורונה כף יד דקות 1, ו -3 שניות, בהתאמה.
    7. מניחים את משטחי פלזמה שטופלו של קרום PDMS נקבובי שכבה microchannel העליונה איש קשר קונפורמי על ידי הצבת כל חתיכה במקביל ללא כל בועות האוויר.
    8. דגירת ההתקנה כולה על 80 מעלות CO / N מליטה הפיכה של שתי שכבות PDMS.
    9. לקלף את שכבת תמיכת PDMS מהמכלול של שכבה עליונה עם קרום נקבובי ידי הרמה בפינת בקפידה של שכבת התמיכה, ואת הקילוף עד ששכבת התמיכה מנותקת לחלוטין מן השכבה העליונה עם הקרום.
    10. לקרוע את המנות של קרום זה ממוקם מעל לתא הוואקום (שני התאים ממוקמים משני צדי הערוץ העיקרי) באמצעות פינצטה בסדר-עצה לעשות תאי ואקום חלולים.
    11. לחשוף את הצד עם הקרום המצורפת על הפיסה העליונה והצד עם ערוצי חרות על החתיכה התחתונה לפלזמה בבית באותו אופן כפי שתואר in לשלב 1.1.6 דקות 1.
    12. יישר את השכבה העליונה microchannel עם קרום נקבובי ועל השכבה התחתונה עם איש קשר קונפורמי על ידי הצבת כל חתיכה במקביל ללא כל בועות אוויר תחת stereoscope.
    13. לרפא את ההתקנה כולה בתנור יבש ב 80 מעלות CO / N כדי לייצר בקנה מידה מלא בטן-על-שבב מכשיר microfluidic המכיל שני תאי ואקום חלולים שלצד ערוץ תא microfluidic.
  2. חיבור צינורות אל הכניסה והיציאה של כל יציאה צמודה העליון או microchannels הנמוך בטן-על-שבב באמצעות מחט קהה-סוף הנירוסטה מכופפת 90 °.
  3. חבר את הצינורות עם החורים צמודים תאי הוואקום באמצעות מחט קהה סוף נירוסטה מכופפת 90 °.
  4. לעקר את microchannels צינורות ידי זורם 70% (V / V) אתנול באמצעות 1 מ"ל לעקר מזרק חד פעמי.
  5. לייבש את microchannels צינורות בתוך O בתנור יבש 60 ° C / N.

צמיחת 2. Microengineered מעי villi במעיים-על-שבב ההתקן

  1. תאי זרע המעיים אפיתל (למשל קאקו-2BBE) על 5,9 Microdevice גוט-על-שבב.
    1. לעקר את המכשיר עם 70% (V / V) אתנול (ראה שלב 1.4) באמצעות מזרק חד פעמי 1 מ"ל מעוקר ואחריו ייבוש בתוך O בתנור יבש 60 ° C / N (ראה שלב 1.5) לפני הפעלת השטח.
    2. לחשוף את ההגדרה השלמה של microsystem בטן-על-שבב (כלומר, גוף של מעי-על-שבב מחובר צינורות) לאור UV (253.7 nm) ו אוזון זמנית במשך 40 דקות.
    3. לצנן את המכשיר ב RT במשך 15 דקות תחת אור UV בתוך ארון בטיחות ביולוגית (BSC).
    4. הציגו 100 μl של ציפוי ECM solution- תערובת מסוג 50 מיקרוגרם / מ"ל ​​לי קולגן 300 מיקרוגרם / מ"ל ​​תערובת תאי מטריקס מדולל בינוני הנשר Modified-סרום חינם של Dulbecco (DMEM) - לשני microchannels העליון והתחתון באמצעות הפנויה , מזרק 1 מ"ל סטרילי.
    5. אינקובטוריםte ההתקנה כולה בתוך 37 ° C humidified 5% CO 2 באינקובטור במשך שעה 1.
    6. דגה 50 מ"ל של טרום התחמם (37 ° C) בינוני תרבות שלמה (DMEM, 20%, V / V, בסרום שור העובר (FBS), 100 יחידות / פניצילין מ"ל ו -100 מיקרוגרם / סטרפטומיצין מ"ל; aliquoted בתוך 3 מ"ל מזרק חד פעמי) באמצעות מערכת סינון 50 מיליליטר (0.45 מיקרומטר הגודל נקבובי) של BSC דקות 1.
      1. לעבור את המדיום מראש חימם דרך מערכת סינון והקש בעדינות על המדיום מסוננים דקות 1 כדי להסיר בועות או גז מומס המדיום.
    7. מניחים את aliquot של בינוני מלא degassed בתוך מזרק חד פעמי 3 מ"ל ו דגירה של 37 מעלות צלזיוס humidified 5% CO 2 באינקובטור במשך שעה 1.
    8. חיבור שני מזרקים חד פעמים 3 מיליליטר המכילים degassed, בינוני תרבות השלמה מחומם מראש ל microchannels העליון והתחתון.
    9. זרימת מדיום תרבית תאים מלאה degassed לתוך microchannel העליון באמצעות משאבת מזרק על הנפחקצב הזרימה של 30 μl / שעה (שווה ערך ל מאמץ הגזירה 0.02 דיין / 2 ס"מ) בתוך 37 ° C humidified 5% CO 2 באינקובטור O / N.
  2. כינונה של Microengineered קאקו-2 villi במעיים-על-שבב.
    1. השתמש בתאי קאקו-2BBE עם מספר המעבר בין 50 ו -65.
    2. לגדל תאי קאקו-2 בבקבוק T75 המכיל בינוני תרבות שלם בתוך 37 ° C humidified 5% CO 2 באינקובטור במשך 4-5 ימים כדי להשיג תאים ומחוברים במלואו.
    3. הוסף 10 מ"ל של Ca 2 + ו Mg 2 + ללא PBS לתאים קאקו-2 ומחוברות מלא גדל בבקבוק T75, לשטוף תאים, ואז לשאוב את PBS. חזור על פעולה זו פעמיים.
    4. הוסף 1 מ"ל של 0.05% טריפסין / פתרון EDTA דגירה של 37 מעלות צלזיוס humidified 5% CO 2 באינקובטור במשך 5 דקות.
    5. Resuspend התאים ניתק עם 10 מ"ל מחומם מראש בינוני תרבית תאים מלאה (עם FBS) על ידי pipetting למעלה ולמטה שלוש עד חמש פעמים.
    6. ספין למטה השעית התא על ידי גentrifugation ב XG 500 במשך 5 דקות, ולאחר מכן להסיר את supernatant.
    7. Resuspend שוב עם 1 מ"ל מחומם מראש בינוני מלא להתאים צפיפות התאים ב ~ 1.5 x 10 5 תאים / 2 ס"מ במכשיר. השתמש hemocytometer כדי להעריך את צפיפות התאים.
    8. להשרות 100 μl של תאים קאקו-2 resuspended לתוך (הצד לומן) microchannel העליון על ידי הצבת מזרק חד פעמי 1 מ"ל מצורף מחט 25 G5 / 8 על היציאה של צינורות המחוברים microchannel העליון.
    9. הצמד את כל פתחי הכניסה שקעים של צינורות המחוברים microchannels העליון והתחתון באמצעות קליפים קלסר.
    10. דגירת ההתקנה כולה בתוך 37 ° C חממה, humidified 5% CO 2 עבור שעה 1 כדי לאפשר תאים ניתקת קאקו-2 לדבוק פני השטח של הקרום הנקבובי.
    11. הסר את המהדק לחדש את זרימת בינוני התרבות היחידה אל microchannel העליון 30 μl / hr באמצעות משאבת מזרק עד תאים מהווים בשכבת תילן 24-36 שעות. השתמש הקונטראס שלבt או התערבות הפרש לעומת זאת (DIC) מיקרוסקופיה לאשר צמתי תאי תאים בשכבת תא.
    12. כאשר תאי יוצרי monolayer, perfuse מדיום התרבות לשני (לומן) עליון ותחתון (נימים) microchannels באותו קצב הזרימה של 30 μl / hr.
    13. יישום של דפורמציות מכאנית מחקה תנועות כמו-peristalsis 5,9.
      1. הפעל את משאבת הוואקום המצויד בציוד המתח.
      2. חבר את תאי הוואקום אל בקר הוואקום דרך צינורות עם מחבר נירוסטה.
      3. הגדר את ההצעה המתיחה של זן תא ממוצע 10% בתדר של 0.15 הרץ עם מצב הפונקציה סינוס המחזורי על התוכנה לשליטת הוואקום, ולאחר מכן לחץ על "התחל".
    14. לשמור על הזרימה הקבועה של מדיום התרבות (30 μl / שעה) בשני microchannel העליון והתחתון בשכבת קאקו-2 ומחוברות תחת דפורמציות מכאני (10%, 0.15 הרץ) עבור ~ 100 שעות.
      הערה: קאקו-2 תאים sponבו-זמנית לעבור morphogenesis סיסי עם תחזיות 3D התנחשלו מושטת לומן של microchannel אפיתל 5,8-10.
  3. כדי לחקות את תפקודי אברים שונים בגוף ברמה של המעי האנושי חי עם ממשק רקמות לומן-נימים במעיים-על-שבב 10, בצע את השלבים כמתוארים.
    1. לגדול villi קאקו-2 microengineered ידי חזרה צעדים 2.1 כדי 2.2.
    2. זרימת מדיום שיתוף ההתרבות המחוממת מראש (תערובת של מדיום תרבית תאי קאקו-2 מלא מדיום תרבות HMVECs המלא, 1: 1 v / v) אל microchannels העליון והתחתון 30 μl / hr.
    3. הציג 100 μl של תאי אנדותל כלי דם נימי אדם נורמלים ניתקים (HMVECs; צפיפות תא סופית, ~ 5.0 x 10 5 תאים / 2 סנטימטר) לתוך microchannel הנמוך בשיטה הזהה כמתואר צעדים מן 2.2.3 כדי 2.2.9.
    4. מניחים פיסת PDMS מלבני נרפא (0.5 ס"מ x 1 ס"מ x 1 ס"מ; גובה x אורך x רוחב; 15: 1, w/ w אלסטומר: סוכן ריפוי) על גבי במעי-על-שבב המכשיר, ואז להעיף את התקנת המכשיר כולו במהופך (כלומר, microchannel העליון פונה כלפי מטה, ואת microchannel התחתון פונה כלפי מעלה).
    5. דגירת ההתקנה ב CO 2 באינקובטור 5% 37 מעלות צלזיוס, humidified במשך שעה 1 כדי לאפשר HMVECs ניתק לדבוק פני השטח של הקרום הנקבובי של microchannel הנמוך.
    6. להוציא התקנה כולה מן CO 2 באינקובטור, ולוחץ על ההתקנה מחדש.
    7. זרימה בינוני תרבות שיתוף מחוממת מראש (תערובת של מדיום תרבית תאי קאקו-2 מלא מדיום תרבות HMVECs המלא, 1: 1 v / v) לשני microchannels העליון ותחתון 30 μl / hr בתנועות מתיחה מכאניות ( 10%, 0.15 הרץ) במשך שלושה ימים לפחות כדי ליצור צמתים תאים תאים של monolayer האנדותל.

3. Host-gut Microbiome משותף התרבות בתוך גוט-על-שבב Microdevice

  1. בצע-תרבות מראש of תאים חיידקיים כדלקמן לשתף תרבות Microbiome commensal הבטן על villi המעי microengineered.
    1. Resuspend את התערובת אבקתי חיידקי פרוביוטיקה מיובש בהקפאה ב 10 מ"ל של תערובת (1: 1, V / V) של מרק לקטובצילוס MRS autoclaved וחיזקו קלוסטרידיאל בינוני.
    2. התאם את צפיפות התאים הסופי בכ -0.2 יחידות צפיפות אופטית (ב 600 ננומטר) על ידי הוספת כמות מתאימה של המדיום, אז aliquot 3 מ"ל של תרחיף תאים מיקרוביאליים בתוך שפופרת סטרילית חד פעמיות 10 מ"ל.
    3. מקום צינורות המכילים resuspended תאי חיידקים במכל אנאירובי. להוסיף שתי חפיסות של שקיות חשמל באמצעות גז אנאירובי בתוך המיכל. סגור את מכסה מיכל בחוזקה דגירה ההתקנה מיכל בלי ללחוץ בתוך 37 ° C humidified 5% CO 2 באינקובטור O / N.
  2. הרכבה של Microbiome ושיתוף תרבות עם מעיים אפיתל תאים 5,10.
    1. כן 3 מיליליטר מזרקים חד פעמים המכילים antibioti degassedג ללא תרבית תאים בינוניים (כלומר, DMEM עם 20% FBS). ראה 2.1.6 עבור הליך degassing של המדיום לתרבות.
    2. להוציא ההתקנה כולה של המעי-על-שבב מכשיר המכיל villi microengineered מן החממה CO2, ולאחר מכן לעבור את ארון בטיחות ביולוגית.
    3. סור מזרקים מחוברים צינורות צמודים microchannels העליון והתחתון. חבר מזרקים ערוכים 3.2.1 למכשיר, להחזיר אל CO 2 באינקובטור, ואז לזרום בינוני תרבות ללא אנטיביוטיקה הזה במשך 12 שעות לפני זריעה של Microbiome.
    4. ספין למטה תאי תערובת חיידקים פרוביוטיים מראש תרבותי (ראה שלבים 3.1) ב XG 10,000 במשך 5 דקות. לשאוב את supernatant באמצעות ואקום, ואז resuspend במדיום DMEM ללא אנטיביוטיקה (צפיפות התאים הסופי, ~ 1.0 x 10 7 CFU / ml).
    5. להשרות את השעית התא לתוך צד לומן של microchannel המכיל את villi "ניבט חינם" המעיים באמצעות מזרק חד פעמי 1 מיליליטר מחובר 25מחט G5 / 8. אפשר את הדבקות של תאי חיידקים כדי למשטח הפסגה של villi המעי עבור ~ 1.5 שעות ללא זרימה על ידי כיווץ לכל סוף הצינורות.
    6. Perfuse מדיום תרבות אנטיביוטיקה ללא מחומם מראש לשני microchannels העליון ותחתונים ב 40 μl / שעה עם דפורמציות קצבית מחזורית (10%, 0.15 הרץ).
    7. עבור שיתוף התרבות של חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) -labeled E. coli (coli GFP א; שאינם פתוגניים DH5-אלפא מארח E. coli) 10,11 תאים עם villi microengineered, מראש לטפח GFP E. קולי תאים במדיום LB autoclaved ב 37 מעלות צלזיוס מתחת רועד במצב (200 סל"ד) למשך 12 שעות. חזור על הליך מ 3.2.5 ל 3.2.6 לבצע שיתוף התרבות של GFP E. קולי תאים עם villi microengineered.
  3. תאי תמונה 5,8-10
    1. בצע דסק"ש, epifluorescence, או סריקת לייזר מיקרוסקופיה confocal להקלטת מיקרוביאליים אפיתל מורפולוגיה 5,8,10.
      1. עבור הדמית דסק"ש, להוציא התקנה ממעי-על-שבב microsystem מן CO 2 באינקובטור, למקם את הגדרת המכשיר על הבמה של מיקרוסקופ, ואז להקליט את מורפולוגיה התא.
      2. עבור דימות פלואורסצנטי של האפיתל סיסי, לזרום PBS לרחיצת התאים ב 100 μl / hr במשך 10 דקות.
        1. תקן villi עם 4% (w / v) paraformaldehyde במשך 15 דקות. ואז לזרום PBS לרחיצת התאים ב 100 μl / hr במשך 10 דקות.
        2. Permeabilize villi עם 0.3% (v / v) טריטון X-100 בדילול מלא PBS המכיל 2% (w / v) אלבומין בסרום שור (BSA) במשך 10 דקות. ואז לזרום PBS לרחיצת התאים ב 100 μl / hr במשך 10 דקות.
        3. תאי בלוק עם 2% (w / v) פתרון BSA ב PBS עבור שעה 1. ואז לזרום PBS לרחיצת התאים ב 100 μl / hr במשך 10 דקות.
        4. הוספת 300 ננומטר של 4 ', dihydrochloride 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) פתרון מדולל PBS עבור המכתים הגרעיני תחת הגנת אור.
        5. הוסף 25 יחידות / מ"ל ​​של phalloidin ניאון(המצומד Phalloidin-CF647) מומס PBS מכתים F- יקטין תחת הגנת אור.
        6. תמונות שיא של התאים המוכתמים fluorescently באמצעות מיקרוסקופ confocal סריקת ליזר.
          הערה: מטרת 25x יושמה עם זום אופטי מתאים במהלך מיקרוסקופיה confocal. באיור 3 ב, כ הגדלה 525X היה בשימוש.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

כדי לחקות את המערכת האקולוגית מאכסן Microbiome אדם מעיים במבחנה, זה צורך לפתח פרוטוקול ניסוי להקים מחדש את שיתוף התרבות ארוך טווח היציבה של חיידקי מעיים ותאים אפיתל אדם מעיים בתנאים פיסיולוגיים כגון מכניקת זרימת נוזל דמוי הפריסטלטיקה. כאן, אנו מנצלים biomimetic בטן-על-שבב microdevice (איור 1A) לשתף התרבות תאים חיים חיידקים במגע ישיר עם החיים villi אדם לתקופות של שבוע או יותר במבחנה. תאי אפיתל...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

הבנת יחסי גומלין בין מאכסן Microbiome היא קריטית לקידום רפואה; עם זאת, מודלי תרבית תאים מסורתיים מתבצעים צלחת פלסטיק או צלחת היטב סטטי אינם תומכים שיתוף התרבות היציבה של תאי מעי אדם עם חי חיידקים במעי במשך יותר מ 1-2 ימים, כי תא חיידקים בעיקר לגדול יותר התאים היונקים במבחנה. אוכלוסיית חיידקים overgrowing צורכת במהירות חמצן וחומרים מזינים, ובהמשך לייצר כמות מוגזמת של פסולת מטבולית (למשל, חומצות אורגניות), אשר ברצינות להתפשר פונקציות מחסום המעי ולגרום מוות של תאים ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

דונלד א. אינגבר הוא מייסד Emulate Inc., מחזיק במניות בחברה ויו"ר המועצה המדעית המייעצת שלה. למחברים האחרים אין גילויים כספיים.

תודות

אנו מודים לסרי קוסורי (מכון וייס באוניברסיטת הרווארד) על אספקת זן האי-קולי המסומן GFP. עבודה זו נתמכה על ידי הסוכנות לפרויקטי מחקר מתקדמים של ההגנה תחת הסכם שיתוף פעולה מספר W911NF-12-2-0036, מינהל המזון והתרופות תחת חוזה #HHSF223201310079C, ומכון וייס להנדסה בהשראה ביולוגית באוניברסיטת הרווארד. ההשקפות והמסקנות הכלולות במסמך זה הן של המחברים ואין לפרש אותן כמייצגות את המדיניות הרשמית, מפורשת או משתמעת, של משרד המחקר הצבאי, מעבדת המחקר של הצבא, מינהל המזון והתרופות או ממשלת ארה"ב. ממשלת ארה"ב רשאית לשכפל ולהפיץ הדפסות חוזרות למטרות ממשלתיות למרות כל סימון זכויות יוצרים במסמך זה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
מדיום הנשר השונה (DMEM) של Dulbecco המכיל 25 מ"מ גלוקוז ו-25 מ"מ HEPESGibco10564-011לחמם אותו ב-37 מעלות; C באמבט מים.
מרק Difco Lactobacilli MRSBD288120הפעל חיטוי ב-121 מעלות; C למשך 15 דקות.
פולי (דימתילסילוקסן)דאו קורנינג3097358-100415: 1 (w/w), PDMS: חומר ריפוי
Caco-2BBE קו קרצינומה של המעי הגס האנושי מרכזמחלות עיכולאדנוקרצינומה של המעי הגס האנושית 
FBSGibco10082-147מומת בחום 20% (v/v) ב-DMEM
פניצילין-סטרפטומיצין-גלוטמיןGibco10378-0161/100 דילול ב-DMEM
4′,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochlorideבדיקות מולקולריותD1306צביעת גרעינים
מצומד פלואידין-CF647 (25 יחידות/מ"ל)Biotium00041צביעת
מערכת מתח Flexcell FX-5000Flexcell International CorporationFX5Kתנועת מתיחה דמוית פריסטלטיקה (10% מתח תאים, תדר 0.15 הרץ)
מיקרוסקופ אפיפלואורסצנטי הפוךZeissAxio Observer Z1הדמיה, DIC
סריקת מיקרוסקופ קונפוקליLeicaDMI6000הדמיה, פלואורסצנטי
UVO מנקהJelight Company Inc342הפעלה על פני השטח של שבב המעי
קולגן מסוג I GibcoA10483-01רכיב מטריצה חוץ-תאית לתרבית תאים לתוך השבב
MatrigelBD354234רכיב מטריצה חוץ-תאית לתרבית תאים לתוך השבב
1 מ"ל מזרק חד פעמיBD309628הזרקת תאים ומדיה 25
גרם 5/8 מחטBD329651 הזרקת תאים ומדיה
משאבת מזרקBraintree Scientific בע"מBS-8000ציוד הזרקה לשבב
VSL#3Sigma-Tau Pharmaceuticals7-45749-01782-6ניסוח של 8 חיידקי מעיים קומנסליים שונים מדיום
קלוסטרידיאלי מחוזקBD218081מדיום תרבית חיידקים אנאירוביים
GasPak EZ מערכת מיכל אנאירובית עם מחווןBD260001שקית לייצור גז אנאירובי 
4% פרפורמלדהידמיקרוסקופיה אלקטרונית מדע157-4-100קיבוע התאים לצביעה
Triton X-100Sigma-AldrichT8787חדירות התאים
אלבומין בסרום בקרSigma-AldrichA7030חומר חוסם לצביעה של התאים
מטפל בקורונהמוצרי אלקטרו-טכניקBD-20ACמחולל פלזמה לייצור השבב
סטריפליפ MilliporeSE1M003M00הסרת מדיום התרבות השלם
המוציטומטר חד פעמיiNCYTODHC-N01לספירת תאים ידנית
הרווארד F-actin

מקורות

  1. Turnbaugh, P. J., et al. An obesity-associated gut microbiome with increased capacity for energy harvest. Nature. 444, 1027-1031 (2006).
  2. Tremaroli, V., Backhed, F. Functional interactions between the gut microbiota and host metabolism. Nature. 489, 242-249 (2012).
  3. Sekirov, I., Russell, S. L., Antunes, L. C. M., Brett Finlay, B. Gut Microbiota in Health and Disease. Physiol. Rev. 90, 859-904 (2010).
  4. Turnbaugh, P. J., et al. The human microbiome project. Nature. 449, 804-810 (2007).
  5. Kim, H. J., Huh, D., Hamilton, G., Ingber, D. E. Human gut-on-a-chip inhabited by microbial flora that experiences intestinal peristalsis-like motions and flow. Lab Chip. 12, 2165-2174 (2012).
  6. Round, J. L., Mazmanian, S. K. The gut microbiota shapes intestinal immune responses during health and disease. Nat Rev Immunol. 9, 313-323 (2009).
  7. Garrett, W. S., et al. Communicable ulcerative colitis induced by T-bet deficiency in the innate immune system. Cell. 131, 33-45 (2007).
  8. Kim, H. J., Ingber, D. E. Gut-on-a-Chip microenvironment induces human intestinal cells to undergo villus differentiation. Integr Biol. 5, 1130-1140 (2013).
  9. Huh, D., Kim, H. J., et al. Microfabrication of human organs-on-chips. Nat Protoc. 8, 2135-2157 (2013).
  10. Kim, H. J., Li, H., Collin, J. J., Ingber, D. E. Contributions of microbiome and mechanical deformation to intestinal bacterial overgrowth and inflammation in a human gut-on-a-chip. Proc. Natl. Acad. Sci. 113, E7-E15 (2016).
  11. Miller, W. G., Lindow, S. E. An improved GFP cloning cassette designed for prokaryotic transcriptional fusions. Gene. 191, 149-153 (1997).
  12. Odijk, M., et al. Measuring direct current trans-epithelial electrical resistance in organ-on-a-chip microsystems. Lab Chip. 15, 745-752 (2015).
  13. Lentle, R. G., Janssen, P. W. Physical characteristics of digesta and their influence on flow and mixing in the mammalian intestine: a review. J Comp Physiol B. 178, 673-690 (2008).
  14. Granato, D., et al. Cell surface-associated lipoteichoic acid acts as an adhesion factor for attachment of Lactobacillus johnsonii La1 to human enterocyte-like Caco-2 cells. Appl Environ Microbiol. 65, 1071-1077 (1999).
  15. Dewhirst, F. E., et al. The human oral microbiome. J Bacteriol. 192, 5002-5017 (2010).
  16. Grice, E. A., Segre, J. A. The skin microbiome. Nat Rev Microbiol. 9, 244-253 (2011).
  17. Hay, P. E., et al. Abnormal bacterial colonisation of the genital tract and subsequent preterm delivery and late miscarriage. Br Med J. 308, 295-298 (1994).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

Caco 2
עמית תרבות Microbiome חי עם Microengineered אדם המעיים villi בתוך גוט-על-שבב מכשיר microfluidic
צור קשר
המלצה לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

2026 © זכויות יוצרים MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.