פרוטוקול זה מספק הנחיות שלב אחר שלב להגדרת ניסויים תחרותיים בהשתלת מח עצם של עכבר כדי לחקור את תפקוד תאי הגזע/אב המטופויאטיים ללא טיהור מוקדם של תאי גזע על ידי מיון תאים.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
השתלות תחרותיות להערכת כושר תאי גזע Hematopoietic
במאמר זה
סיכום
תקציר
הגדרת תקן הזהב של תא גזע המטופויאטי (HSC) היא תא שכאשר הוא מועבר לנמען מוקרן תהיה לו היכולת לבסס מחדש את ייצור תאי הדם למשך תוחלת החיים של המקבל. פרוטוקול זה מסביר כיצד להגדיר בדיקה פונקציונלית כדי להשוות את יכולות ה-HSC של שתי אוכלוסיות שונות של תאים, כגון מח עצם מעכברים משני גנוטיפים שונים, וכיצד לנתח את העכברים הנמענים על ידי ציטומטריית זרימה. הפרוטוקול משתמש במקבילות HSC ולא במיון תאים לצורך סטנדרטיזציה ודן ביתרונות ובחסרונות של שתי הגישות. אנו דנים עוד בווריאציות שונות לפרוטוקול הבסיסי, כולל השתלות סדרתיות, מבחני דילול מגבילים, מבחני ביות והשתלות לא תחרותיות, כולל היתרונות והשימושים המועדפים של גישות מגוונות אלה. מבחנים אלו מרכזיים לחקר תפקוד HSC ויכולים לשמש לא רק לחקירת היבטים מהותיים בסיסיים של HSC בביולוגיה אלא גם לפיתוח בדיקות פרה-קליניות להשתלת מח עצם והרחבת HSC בתרבית.
מבוא
Hematopoiesis הוא תהליך התחדשות המבטיח את replenishing של תאי דם אבדו בגלל פציעה, קרינת מוות של תאים. תהליך זה מובטח על ידי תאי גזע hematopoietic (HSC) השוכנים בעיקר במח העצם הבוגר. בנוסף, תאי גזע hematopoietic יכול לשמש למטרות טיפוליות במחלות אוטואימוניות, מחלות ממאירות המטולוגית ו חסרים חיסוניים 1. יש אפוא צורך להבין טוב יותר את המנגנונים המווסתים פונקציה HSC, ובכלל זה, הרחבת שגשוג שלהם ואת יכולתם להגיע נקלטים במח העצם הנמען לאחר ההשתלה. למרות מחקרים שנעשו לאחרונה דיווחו מספר סמנים פני התא, כולל בני משפחה SLAM CD150 ו CD48, להעשיר HSCs מבוגר פרוספקטיבית HSCs העובר בכ -50% טוהר 2-4, המדד תקן הזהב עבור HSC....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
כל הנהלים מתוארים בפרוטוקול זה אושרו על ידי ועדת אתיקת חיה המוסדית אחרי המועצה הקנדית על הנחיות טיפול בבעלי החיים.
הערה: כדי לשמור על תנאים סטריליים דיור / ספציפיים חינם לפתוגן, לנהל את כל הנהלים הקשורים טיפול ישיר של עכברים חיים בתוך ארון בטיחות ביולוגי או ברדס זרימה למינרית. נקו או לעקר כלובים, התקני ריסון, חומרים דיור, צ'או ומים הניתנים לבעלי החיים כראוי. השתמש רק מחטים סטריליות, חד פעמיות עבור הזריקות לדגימת דם. טכניקת אספטי היא קריטית במהלך תקופת ההכנה של השתל.
1. הכנת עכברים הנמען
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
תיאור כללי של הגדרת ההשתלה התחרותית, לרבות השתלות משניות (דנו בהמשך) ניתן למצוא באיור 1. ניתוח נציג HSCs במח עצם מראש השתלה ניתן למצוא באיור 2. מידע מפורט יותר על הדרת כפילויות ו ניתן למצוא תאים מתים במקום אחר 9.
איורים 3 ו -4 לספק דוגמאות של זרימת cytometry תבניות ניתוח.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
הפרוטוקול המתואר כאן נועד להעריך את הכושר היחסי של HSCs התורם (מבחן) נגד ידוע המתחרה HSCs. המצב של תחרות מגביר את הרגישות היחסית של assay (סיכוי גבוהה יותר לזהות ירידות מתונות כושר תאי גזע) ומספק שליטה טכנית פנימית ליעילות של הקרנה והזרקה. עם זאת, זה לא אמור לשמש מדד מוחלט של כושר HSC; ירידת כינון מחדש תחרותי לא אומרת אוטומטית כי HSCs לא מתפקד היטב בהעדר התחרות. למרות זאת ניתן לטעון כי על רקע תחרותי היא נקודת הזינוק הטובה יותר, כמו התאים המתחרים יצילו פונקצית HSC פגומה וכל עכברי ה.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
המחברים מצהירים שאין להם אינטרסים פיננסיים מתחרים.
תודות
אנו מודים RoxAnn Hétu-ארבור לסיוע עם עיצוב דמות והדגמה של הליכים. מחקר במעבדה נתמך על ידי פרסים מעבר מקרן קול, דיסקברי להעניק אין. 419226-2012 מן למדעי הטבע וההנדסה מועצת המחקר של קנדה (NSERC) וקרן קנדה עבור חדשנות (קרן מנהיגים CFI להעניק אין. 31,377). KMH הוא ג'וניור Chercheur-Boursier עבור Fonds דה משוכלל ונדיר קוויבק - Santé (FRQS).
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| צינורות מיקרוטיינר עם K2EDTA | BD Biosciences | 365974 | |
| 20 גרם מחט | BD מזרק | לדגימת דם מווריד הלסת | |
| התחתונה LabQuake Shaker רוטיסרי | Thermo Scientific | C415110 | |
| מטוהר נגד עכבר CD16/CD32 (שיבוט 2.4G2, בלוק Fc) | BD Biosciences | 553142 | 2.50 μ גרם/מ"ל |
| Pe-Cy7-מצומד נגד עכבר CD3e (שיבוט 145-2C11) | eBioscience | 25-0031 | 0.25 μ גרם/מ"ל |
| מצומד PE נגד עכבר CD19 (שיבוט 1D3) | eBioscience | 12-0193 | 0.25 μ גרם/מ"ל |
| APC-eFluor780 (שווה ערך ל-APC-Cy7) מצומד נגד עכבר GR1 (שיבוט RB6-8C5) | eBioscience | 47-5931 | 0.25 μ גרם/מ"ל |
| FITC-מצומד נגד עכבר CD45.1 (שיבוט A20) | eBioscience | 11-0453 | 2.50 μ גרם/מ"ל |
| eFluor450-מצומד נגד עכבר CD45.2 (שיבוט 104) | eBioscience | 48-0454 | 1.00 μ גר'/מ"ל |
| אנטי-אדם/עכבר ביוטיניל CD45R (B220) (שיבוט RA3-6B2) | eBioscience | 13-0452 | 1.25 μ גרם/מ"ל |
| אנטי-עכבר ביוטיניל CD3e (שיבוט 145-2C11) | eBioscience | 13-0031 | 1.25 μ גרם/מ"ל |
| אנטי עכבר ביוטיניל CD11b (שיבוט M1/70) | eBioscience | 13-0112 | 1.25 μ גרם/מ"ל |
| אנטי-עכבר ביוטיניל GR1 (שיבוט RB6-8C5) | eBioscience | 13-5931 | 1.25 μ גרם/מ"ל |
| אנטי עכבר ביוטיניל TER119 (שיבוט TER119) | eBioscience | 13-5921 | 0.625 μ גרם/מ"ל |
| V500 סטרפטווידין | BD Biosciences | 56149 | 0.5 μ גרם/מ"ל |
| מצומד PE נגד עכבר CD117 (שיבוט 2B8) | BD Biosciences | 553355 | 0.25 μ גרם/מ"ל |
| PE-Cy7-מצומד נגד עכבר Ly6A/E (Sca1) (שיבוט D7) | BD Biosciences | 558162 | 0.25 μ גרם/מ"ל |
| PerCP-eFluor710-מצומד נגד עכבר CD135 (שיבוט A2F10) | eBioscience | 46-1351 | 0.5 μ גרם/מ"ל |
| Alexa fluor 647-מצומד נגד עכבר CD150 (שיבוט TC15-12F12.2) | Biolegend | 115918 | 0.625 μ גרם/מ"ל BD Biosciences ו-eBioscience אינם נושאים את אותו |
| שיבוט מזרק טוברקולין 1 מ"ל עם | מזרק BD | 309623 | |
| מזרק טוברקולין 1 מ"ל עם | מזרק BD | 309626 | |
| 70 μ מסננת תאים m | בז BD | 352350 |
מקורות
- Li, H. W., Sykes, M. Emerging concepts in haematopoietic cell transplantation. Nat Rev Immunol. 12 (6), 403-416 (2012).
- Kiel, M. J., Yilmaz, O. H., Iwashita, T., Terhorst, C., Morrison, S. J. SLAM family receptors distinguish hematopoietic stem and....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
