מאמר שיטה

פרוטוקול בידוד לחוג עכבר של וויליס

DOI:

10.3791/54352

⸱

22 באוקטובר 2016

 ,  , 
1UPMC Univ Paris 06, Sorbonne Universités

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו מתארים כאן פרוטוקול הניתן לשחזור לבידוד מעגל העכבר של וויליס.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מעגל עורקי המוח (cerebri arteriosus סירקולוס) או המעגל ויליס (פרה) הוא השקת דם המקיפה את ראיית chiasma וההיפותלמוס המספק דם למוח והמבנים שמסביב. זה היה מעורב בכמה הפרעות כלי דם במוח, כולל angiopathy עמילואיד מוחין (CAA) vasculopathies -associated, טרשת עורקים תוך גולגולתי מפרצת תוך-גולגולתי. מחקרים של המנגנונים המולקולריים שבבסיס מחלות אלו לזיהוי מטרות תרופה חדשניות למניעה שלהם דורשים במודלים של בעלי חיים. חלק מן המודלים האלה עשויים להיות מהונדס, ואילו אחרים יהיו כרוכים בידוד של כלי הדם-Cerebro, כולל שיטת CoW.The המתוארת כאן מתאים בידוד פרה בכל שושלת עכבר ויש לו פוטנציאל רב הקרנה (ביטוי של גנים, ייצור חלבונים, שינויי חלבון posttranslational, ניתוח secretome, וכו ') מחקרים על הכלי הגדול של העכבר cerebro-כלי דם. זה יכול לשמש גם עבור מחקרי vivo לשעבר, על ידי התאמת מערכת אמבטית האיבר שפותחה עבור עורקי הרחת עכבר מבודדים.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מעגל עורקי המוח (cerebri arteriosus סירקולוס), הידוע גם בשם מעגל ויליס (פרה), הלולאה של מצולע Willisor וויליס) תואר לראשונה על ידי תומס וויליס 1664. זוהי השקת דם הממוקמת ברחבי האופטי chiasma וההיפותלמוס שיכולה להיחשב כמרכז באספקת הדם למוח ומבנים שמסביב. דם נכנס המבנה הזה דרך התרדמה הפנימית ועורק בחוליות והוא זורם אל מחוץ למעגל באמצעות באמצע הפנים ועורקי מוחות אחוריים. כל אחד העורקים האלה על ימין ועל שמאל סניפים משני צדי המעגל. יעביר basilar, פוסט, ו קדמי תקשורת עורקת לסגור את המעגל (איור 1 ואיור 2). הסיכון של זרימת דם לקויה בכל עורקי היצוא ממוזער על ידי המיזוג של דם הנכנסים למעגל מן התרדמה ועורק מוחות, דבר המבטיח כי דם מספק מסופק בגֶשֶׁם. מבנה זה משמש גם הנתיב העיקרי עבור זרימת הדם בטחונות במחלות occlusive חמורה של עורק התרדמה הפנימי.

ישנם מספר סוגים של הפרעות כלי דם במוח יש מוצאם של פרה. הנפוצים ביותר הם angiopathy עמילואיד מוחין (CAA) vasculopathies -associated, טרשת עורקים תוך גולגולתי מפרצת תוך-גולגולתי. 1, 2, 3 הפרעות אלה עשויים להוביל hypoperfusion בשל התרחבות, וכן תוך-מוחי ו / או תת-עכבישי דימומים בסופו של דבר לתרגם שבץ איסכמי או המורגי או , במקרה הטוב, התקף איסכמי חולף. התקדמות בבדיקות אבחנתיות, כולל הדמייה, ואולי בשילוב עם אנגיוגרפיה, הפכה אותו ניתן לאבחן מחלות כלי דם במוח גדולות האלה קליניות, ללא הצורך בביופסית מוח. אף על פי כן, טיפולים יעילים וספציפיים (תרופתיים או endovascular) חסרים כיום ולכן יש צורך להגדיר חדשמטרות מולקולריות.

זיהוי מטרות תרופה חדשנית למניעת מחלות אלה בבני אדם ידרוש במודלים של בעלי חיים ודרכי לבודד את כלי הדם Cerebro כולל פרה. מודלים כאלה צריכים לספק ראיות ורמזים על השינויים הספציפיים, כוללים שינויים דלקתיים, המתרחשים קירות הכלי הגדול במודלים של בעלי חיים של מפרצת עורקים תוך גולגולתי, CAA או טרשת עורקים תוך גולגולתי. 4, 5, 6

הקמנו שיטה לבידוד העכבר פרה כדי להקל מחקרים של דלקת בכלי במחלת האלצהיימר (AD) ומחלות הקשורות, כגון CAA. שיטה זו לבידוד פרה עכבר פותחתה עבור ההערכה של ביטוי גני כלי דם במוח דלקתי במהלך התקדמות מחלה. יחד עם זיהוי של בתצהיר עמילואיד בטא בתוך דפנות העורקים leptomeningeal ו pial, שיטה זו יכולה להקל להרתיעשלי הקשר האפשרי בין ביטוי גנים דלקתיים בקיר Cerebro-כלי הדם וצבירת Aβ-פפטיד. רשת כלי הדם של המוח, כולל leptomeningeal ו pial במרחב תת-עכבישי, הוא הרחבה של העורקים הגדולים ויוצרים מעגל ויליס. השיטה המתוארת כאן יכולה לשמש כדי לבודד את הפרה של כל שושלת עכבר יכולה לשמש לכל סוגי הקרנה (למשל, ביטוי גנים, ייצור חלבונים ושינויי חלבון posttranslational) על הכלי הגדול של כלי הדם-Cerebro עכבר.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כל הנהלים בוצעו בהתאם לתקני הקהילה האירופית לטיפול ולשימוש בחיות מעבדה, באישור ועדת האתיקה המקומית לניסויים בבעלי חיים (Ile de France-פריז-הוועדה, הרשאה 4270).

1. הרדמה

  1. להשרות מנה קטלנית של pentobarbital (עד 1 מ"ג / 10 g משקל הגוף) intraperitoneally (מחט G27 עם מזרק 1 מ"ל) לתוך עכברים בוגרים לפני הניתוח.

זלוף כלי 2.

הערה: אין צורך להחיל משחת וטרינר לעיניים במהלך זלוף כלי. הליך זה הוא מהיר (5-10 דקות) ומסתיים במותו של החיה. אשר את חוסר התגובה עם קמצוץ הבוהן.

  1. בעזרת מספריים איריס, עושים חתך, באורך של 4 ס"מ, לתוך הקיר הצפק הבטן, ממש מתחת לצלעות.
  2. לעשות חתך קטן (בגודל כמה מילימטרים) ב הסרעפת ואז continuדואר החתך של הסרעפת לאורך כל אורכו של בית החזה כדי לחשוף את חלל פלאורלי.
  3. הרם את החזה משם מהדק את הקצה של עצם החזה עם hemostat; למקם את hemostat על הצוואר. בזהירות לחתוך את רקמת שומן חיבור עצם החזה אל הלב.
  4. לעבור את המחט זלוף 15-מד דרך החדר השמאלי לתוך הקודקוד של הלב.
  5. לבסוף, להשתמש במספריים לחתוך אחד האונה של הכבד ליצירת פורקן.
    הערה: יציאה חלופית ניתן ליצור באמצעות מספרי איריס ליצור חתך אל העלייה הימנית.
  6. Perfuse החיה עם 25 עד 50 מ"ל של בופר פוספט (PBS) עם משאבה ההפעלה בשיעור של 2.5 מ"ל / דקה. הכבד צריך להלבין כשהדם מוחלף PBS.
  7. לאחר כחמש דקות, אחרי שהנוזל מהכבד ברור לחלוטין, להפסיק זלוף.
  8. אם immunostaining או מכתים קבוע מתוכנן, perfuse החיה עם 50 מ"ל של paraformaldehyde(PFA; 4% ב PBS) במשך 15 דקות.
    הערה: שימו לב, אדי PFA רעילים. זלוף של החיה עם PFA צריך להתבצע במנדף מאוורר.

3. בידוד של המוח ואת המעגל ויליס

  1. בידוד של המוח
    1. הסר את הראש עם זוג מספריים כירורגיות.
    2. ביצוע חתך קו אמצע עם מספרי איריס, לאורך העור מהצוואר אל האף.
    3. חתוך את העור כדי לחשוף את הגולגולת ולהסיר כל שרירי שיורים ורקמות שומן עם איריס מספרית.
    4. מניחים את הקצה החד של איריס מספריים לתוך מגנום foramen בצד אחד ובזהירות להחליק אותם על פני השטח הפנימי של הגולגולת אל meatus השמיעה החיצונית (הידוע גם בשם תעלת האוזן).
    5. לשחזר את החתך מתואר 3.1.4 בצד הנגדי ולעשות קו אמצע לחתוך לאורך המשטח הפנימי של העצם בין הקודקודית תחילת תפר sagittal.
    6. לשתול הקשתיתמספרי העצם הפרונטלית, ישר בין העיניים, ב תפר sagittal ולאחר מכן לפתוח אותם לפצל את הגולגולת לשתיים.
    7. הרם את המוח, תופס את נורות חוש הריח באמצעות מספרי איריס לנתק את הקשרים העצבים על פני שטח הגחון שלה.
    8. הסר את המוח ולמקם אותו בצלחת פטרי 60 מ"מ המכיל PBS קר כקרח לבידוד פרה. לחלוטין לטבול את המוח PBS. אם המוח היה קבוע עם PFA 4% (עבור חתך עתידי immunostaining או מכתים רגיל), לשמור אותו באמבט של 4% PFA ב 4 מעלות צלזיוס למשך 24 שעות.
  2. בידוד של המעגל ויליס
    הערה: מיקרוסקופ לנתח נדרש בידוד פרה. המוח צריך להיות כל הזמן על 4 מעלות צלזיוס לאורך כל ההליך כולו.
    1. מכניסים את המוח במהופך (כלומר, על פני השטח הגבי שלה) כדי להמחיש את הפרה.
    2. השתמש מלקחיים קטנים לתפוס את עורקי המוחין הקדמיים (ACA) בבסיס של אונות הרחה ( ב (איור 1).
    3. השתמש הקצוות החדים של מלקחיים כדי להרים ולהסיר את העורקים הגדולים להרכיב את הפרה מהקורטקס.
    4. הרם את תחילת עורקי תקשורת האחורית (PCA) לנתק אותם מהמוח, על ידי אחיזת עורקי המוח האמצעיים (MCA) עם המלקחיים. תרים את העורקים הקדמיים (ACA ו MCA) ולמשוך אותם בעדינויות על אופטיים התצלובת בכיוון קדמי-הגבה. כדי למנוע הפרעה של פרה, להפסיק את ההליך להתמודד עם העורקים האחרים.
    5. חזור על שלבי 3.2.2 ו 3.2.3 עבור העורקים במוח הקטנים המעולים אחוריים (SCA) / (PCA) (ג, איור 1) ו עבור עורק הבסיס (BA) (ד, איור 1), מושכים אותם dorsal- כיוון קדמי. תפסיק בסוף של i ההליך המתוארn 3.2.4.
    6. הסר את הפרה כולה על ידי משיכת בעדינות עם מלקחיים. מניח את הפרה בצלחת 60 מ"מ פטרי מלא PBS קר כקרח להסיר את כל רקמת מוח מצורפת הנותרים עם שני מלקחיים, מחזיק פרה במקום עם סיכות קטנות.
    7. שמור את הפרה שנקטפו ב -80 ° C לעיבוד שלאחר מכן לטיהור RNA (תשואות מיצוי RNA כמויות גדולות של RNA - כ 500 ng) או מיצוי חלבון.
      הערה: ניתן לשמור את פרת vivo לשעבר למשך 24 שעות, על ידי התאמת מערכת אמבטית האיבר שפותחה עבור עורק הרחת עכבר מבודד 7.

figure-protocol-1
איור 1: תרשים סכמטי של צפה גחון של מוח עכבר הדגשה פרה פרה נוצר משני עורקי התרדמה הפנימיים (MCA), אשר נגזרים משני עורקי המוחין הקדמיים (ACA);. basilarעורק (BA) סניפים לתוך האחורי (PCA) מעולה (SCA) עורקים מוחיים, ושני עורקים בחוליות (VA).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

העכבר PBS-perfused נהרג והפרה מבודדת כמפורט בסעיף 3.2 של הפרוטוקול. כאשר לנתיחה מבוצעת כהלכה, פרה צריך לצאת בחתיכה אחת צריך להיות שקוף מעט בשל היעדר הדם שיורית בכלי הדם.

figure-results-1
איור 2: פרה העכבר לאחר בידוד. (א) סקירה של הפרה בצלחת 10 ס"מ פטרי. (ב)

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו מתארים כאן פרוטוקול לשחזור עבור הבידוד של המעגל ויליס. הפרעות כלי הדם במוח ביותר הנפוצות הכוללות פרה הם vasculopathies CAA קשור, טרשת עורקים תוך גולגולתי מפרצה תוך-גולגולתי, שכולן משפיע על דפנות כלי דם העורקיים. גורמי הסיכון ידועים, אבל בפתוגנזה המולקולרי של הפרעות המוחין האלו נשאר ממעטים להבין וסמנים ביולוגיים ספציפיים לניבוי להתרחשותם חסרים. יש עניין רב בשיטות לבידוד הפרה מעכברים מהונדסים לקשר תצפיות מקרוסקופית עם שינויים מולקולריים. לדוגמה, על ידי גרימת מפרצת עקבית במודל של...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למחברים אין מה לחשוף.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עבודה זו נתמכה על ידי פריז VI אוניברסיטת ומענק חדשנות פייר פאבר.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
דולבקו s פוספט חוצץ מלחSigma-AldrichD8537
Dumont #55 מלקחייםFine Science Tools11295-51
מספריים איריס עדין מוקשה Fine Science Tools14090-11
מספריים - ישר / חד / חד    16.5 ס"מכלי מדע עדינים14002-16
דומונט #7b מלקחיים Fine Science Tools11270-20
מיקרוסקופ זום סטריאוסקופיNikonSMZ745T
CellBIND משטח 60 מ"מ צלחת תרבותקורנינג#3295
משאבה פריסטלטית - MINIPULS 3GilsonM312
Pentobarbital SodiqueCeva Santé אנימלFR/V/2770465 3/1992

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Beckmann, N., et al. Age-dependent cerebrovascular abnormalities and blood flow disturbances in APP23 mice modeling Alzheimer's disease. J Neurosci. 23 (24), 8453-8459 (2003).
  2. Sadasivan, C., Fiorella, D. J., Woo, H. H., Lieber, B. B. Physical factors effecting cerebral aneurysm pathophysiology. Ann Biomed Eng. 41 (7), 1347-1365 (2013).
  3. Ritz, K., Denswil, N., Stam, O., van Lieshout, J., Daemen, M. Cause and mechanisms of intracranial atherosclerosis. Circulation. 130 (16), 1407-1414 (2014).
  4. Tulamo, R., Frösen, J., Hernesniemi, J., Niemelä, M. Inflammatory changes in the aneurysm wall: a review. J Neurointerv Surg. 2 (2), 120-130 (2009).
  5. Yamada, M. Cerebral amyloid angiopathy: emerging concepts. J Stroke. 17 (1), 17-30 (2015).
  6. Oy, B. Intracranial atherosclerotic stroke: specific focus on the metabolic syndrome and inflammation. Curr Atheroscler Rep. 8 (4), 330-336 (2006).
  7. Lee, H. J., Dietrich, H. H., Han, B. H., Zipfel, G. J. Development of an ex vivo model for the study of cerebrovascular function utilizing isolated mouse olfactory artery. J Korean Neurosurg Soc. 57 (1), 1-5 (2015).
  8. Hosaka, K., Downes, D. P., Nowicki, K. W., Hoh, B. L. Modified murine intracranial aneurysm model: aneurysm formation and rupture by elastase and hypertension. J Neurointerv Surg. 6 (6), 474-479 (2013).
  9. Gauthier, S. A., Sahoo, S., Jung, S. S., Levy, E. Murine cerebrovascular cells as a cell culture model for cerebral amyloid angiopathy: isolation of smooth muscle and endothelial cells from mouse brain. Methods Mol Biol. 849, 261-274 (2012).
  10. Choi, S., Kim, J., Kim, K., Suh, S. Isolation and in vitro culture of vascular endothelial cells from mice. Korean J Physiol Pharmacol. 19 (1), 35-42 (2015).
  11. Peters, D. G., Kassam, A. B., Yonas, H., O'Hare, E. H., Ferrell, R. E., Brufsky, A. M. Comprehensive transcript analysis in small quantitiesof mRNA by SAGE-Lite. Nucleic Acids Res. 27 (24), (1999).
  12. Badhwar, A. Stanimirovic, Hamel, & Haqqani The proteome of mouse cerebral arteries. J Cereb Blood Flow Metab. 34 (6), 1033-1046 (2014).
  13. Castro, L., Brito, M., et al. Striatal neurones have a specific ability to respond to phasic dopamine release. J Physiol. 591 (13), 3197-3214 (2013).
  14. Hübscher, D., Nikolaev, V. Generation of transgenic mice expressing FRET biosensors. Methods Mol Biol. 1294, 117-129 (2015).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

PBS

מאמרים קשורים