הכנה ויישומים של תרבויות Organotypic הרתי Slice

סיכום

אנו מתארים את הכנת פרוסות הרתי, בשילוב עם cytometry זרימה, יכול לשמש מודל בחירה חיובית ושלילית לפתח תאי T. פרוסות הרתי ניתן להתאים גם לניתוח באתרו של הגירה thymocyte, לוקליזציה, ואיתות באמצעות immunofluorescence ושני פוטון מיקרוסקופית.

תקציר

התמורה מבחר הרתי בתוך microenvironment הרתי ייחודי מאוד מאורגנת וכתוצאה מכך הדור של רפרטואר תא T פונקציונלי, עמיד בפני עצמי. מודלים חוץ גופית ללמוד מחויבות השושלת T ופיתוח סיפקו תובנות חשובות לגבי התהליך הזה. עם זאת, מערכות אלו חסרים את המילייה הרתי תלת ממדים המלאות נחוצה להתפתחות תאי T, ולכן הם קירובים שלמים של in vivo מבחר הרתי. כמה מן האתגרים הקשורים לפיתוח תא דוגמנות T ניתן להתגבר באמצעות במודלים באתרו המספקים microenvironment הרתי שלם שתומך מבחר הרתי מלא לפתח תאי T. תרבויות organotypic פרוסת הרתי משלימים קיימים טכניקות באתרו. פרוסות הרתי לשמור על שלמות של אזורים קורטיקליים מדולרי הרתי ולספק פלטפורמה ללמוד פיתוח של thymocytes כיסו של שלב התפתחותי מוגדר או של ג T אנדוגניאמות בתוך microenvironment הרתי בוגר. בהינתן היכולת ליצור ~ 20 פרוסות לכל עכבר, פרוסות הרתי להציג יתרון ייחודי במונחים של מדרגיות לניסויי קצב העברת נתונים גבוהות. יתר על כן, הקלות היחסית ביצירת פרוסות הרתי ופוטנציאל כיסוי תת הרתי שונה או אוכלוסיות תאים אחרות מרקע גנטי מגוונים משפרת את הרבגוניות של שיטה זו. כאן אנו מתארים פרוטוקול להכנת פרוסות הרתי, בידוד כיסוי של thymocytes, ניתוק של פרוסות הרתי עבור ניתוח תזרים cytometric. מערכת זו יכולה גם להיות מותאמת ללמוד פיתוח תאי T בלתי קונבנציונלי וכן לדמיין גירת thymocyte, אינטראקציות תא-סטרומה thymocyte, ואותות TCR הקשורים בחירה הרתי על ידי מיקרוסקופ שני פוטונים.

מבוא

T תאים להבדיל באמצעות סדרה של ביניים התפתחותיים התימוס במהלכן הם נתקלים בכמה מחסומים המבטיחים בדור של רפרטואר תא T פונקציונלי, עמיד בפני עצמי ^1-3. סלקציה חיובית מקדמת את ההישרדות של thymocytes עם קולטנים של תאי T (TCR) מסוגלים להכיר, עם נמוך הזיקה מתונה, פפטיד שהציגו מולקולות מורכבות histocompatibility גדולות (MHC) על תאי אפיתל הרתי קליפת מוח (cTEC) ^2,3. סלקציה שלילית ו- T רגולטוריים התפתחות התא (T _reg) לתרום להקמת סובלנות עצמית באמצעות חיסול או הסטת thymocytes שמגיבים בחריפות-פפטיד עצמי שהציג MHC ^2,4. בשלה CD4 ⁺ CD8 ⁺ חיובית כפולה (DP) thymocytes להביע TCRs שעוברים תהליך הבחירה להתמיין תת-אוכלוסיות של תאי T בוגרים, שרובם הם מהשורה MHC-מוגבל ואני ציטוטוקסיות CD8 ⁺או בכיתת MHC II-מוגבל CD4 ⁺ עזר יחיד חיובי (SP) ותאי T, לפני היציאה התימוס כדי לבצע פעולות מפעיל באיברים הלימפה משני ^1-3.

מה שמוסיף למורכבות של פיתוח תאי T, ההגירה הדינמית ומפגשים הסלולר לפתח thymocytes ברחבי רשת תא סטרומה ^5-9. בתאי סטרומה אלה ממלאים תפקידים ברורים בפיתוח thymocyte ומופצים באופן דיפרנציאלי בין האזורים קורטיקליים מדולריים הרתי שבו חיובי סלקציה שלילית להתרחש ^10. למרות סלקציה חיובית מתרחשת בעיקר בקליפת המוח, יש ראיות מצטבר thymocytes העקור נודד אל הלשד ולהמשיך לדרוש אותות TCR לפני שהם להתמיין לתאי T בוגרים דבר המצביעים על כך הלשד עשוי לספק אותות נוספים הדרושים להשלמת מבחר חיובי שושלת בידול ^11,12. נוסף,למרות נוכחותם של תאי אפיתל הרתי מדולרי מיוחדים (Mtec) מבטאים ו אנטיגנים הנוכחי מוגבל רקמות הקלת מחיקה של thymocytes אוטוריאקטיבים ^13,14, חלק גדול של סלקציה שלילית מתרחש בקליפה בתגובה הביע בכל מקום בגוף-פפטיד עצמי שהציג הדנדריטים תאים ^15,16. לפיכך, מודלים מדויקים של פיתוח תאי T חייב לספק microenvironment הרתי מאורגן, עם קליפת המוח ללא פגע ואזורים מדולרי, המאפשר אינטראקציה בין thymocytes ותאי סטרומה, ותומך הגירה thymocyte כמו תאים אלה עוברים סלקציה חיובית ושלילית.

כדי להשלים vivo לשעבר מנתח של thymocytes כאמצעי לימוד מבחר חיובי ושלילי, מספר במבחנה, באתרו, ו במודלי vivo של התפתחות תאי T פותח ^17-22. זה כבר ידוע לשמצה קשה לשחזרבחירה במבחנה חיובית, אבל coculture של אוכלוסיות תא גזע או מבשרי תא T עם תאי סטרומה להביע ליגנד Notch, בעיקר OP9-DL1 / 4 תאים, יש לו את היכולת לתמוך במחויבות שושלת T ו סלקציה חיובית מוגבלת מה שהופך אותו לא יסולא בפז במודל חוץ גופייה כדי מחקר תאי T פיתוח ^23-25. מגבלות של מערכת זו, עם זאת, כוללים את העובדה כי תאים אלה חסרים את מכונות עיבוד פפטיד ייחודי המצוי בתאי סטרומה הרתי ואת microenvironment הרתי תלת ממדי.

למרות שלמעלה טכנית מסורבלת, באתרו במודלים vivo של מבחר הרתי יכול להתגבר על מחסומים הקשורים למערכות במבחנה. תרבויות איבר Reaggregate הרתי (RTOC) מכילים מוגדר תערובות של thymocytes ותאי סטרומה הרתי ^18,26,27. reaggregates תא אפיתל הרתי אלה לשמור הביטוי שהייתי בכיתה MHC ו- II והוא יכול לתמוך developmeNT של שני תת התא הקונבנציונלי T, אך עדיין חסרת מוגדר מבנים קורטיקליים מדולריים. תרבות איבר הרתי עוברית (FTOC) היא מודל פופולרי של פיתוח תאי T שניתן זורע עם thymocytes באמצעות תרבות תליית טיפת אונות הרתי lymphodepleted או באמצעות זריקה של thymocytes לתוך lymphoreplete אונות הרתי ולתמוך בפיתוח יעיל של CD4 ⁺ ו- CD8 ⁺ T תאים לאורך זמן בתרבות ^18,28-31. ב החניכה של התרבות של אונות הרתי העובר יש מחסור של mTECs, אך מוגדר מבנים קורטיקליים מדולריים עלולים לפתח לאורך זמן בהתאם לתנאים. שיקול חשוב הוא כי מודל זה עשוי לתמוך עוברי מועדף לעומת פיתוח תא הבוגר T. לבסוף, הזרקת intrathymic של מבשרי הרתי מוגדר בעכברים בוגרים הוא מאתגר מבחינה טכנית אך ברור מספקת סביבה לתמיכה פיתוח תאי T in vivo. אלו באתרו במודלים vivo הם לא כלים מצויניםo מחקר T תא הפיתוח והשימוש שלהם צריך להיחשב על בסיס ניסוי אחר ניסוי.

פרוסות הרתי, לעומת זאת, צמחו לאחרונה כמודל צדדי, משלים ללמוד בחירה הרתי באתרו עם האפשרות להכיל ייחודי, מורכב, ובדרך כלל ניסויי תפוקה גבוהים יותר. פרוסות הרתי לשמור על השלמות של האזורים קורטיקליים מדולריים ולספק מסגרת של תאי סטרומה שתומכת גירת thymocyte במהלך פיתוח, כמו גם מבחר חיובי ושלילי יעיל ^11,32-39. תת thymocyte הוסיף גבי פרוסות הרתי נודדים לתוך רקמות נישת microenvironmental המתאימה שלהם ^34,37. Thymocytes המעולף ניתן להבחין בין תאי אנדוגני פרוסה הרתי באמצעות סמני congenic או תוויות ניאון והוא יכול להישמר בתרבות במשך כמה ימים. תרבויות organotypic פרוסה הרתי יכול לשמש כדי לחקור היבטים שוניםההתפתחות של תאי T כולל מבחר הרתי, התנהגות thymocyte (הגירה אינטראקציות הסלולר), ולוקליזציה thymocyte, בין היתר. בהינתן היכולת ליצור ~ 20 פרוסות הרתי לכל עכבר, את יכולת ההרחבה של ניסויים היא בדרך כלל גדולה יותר מאשר אחרים במודלים באתרו של מבחר הרתי. למרות הכנת פרוסות הרתי דורשת ציוד מיוחד, כגון vibratome, ואת זמן החיים של פרוסות הרתי בתרבות מוגבלת בשל אובדן של תאים לאורך זמן באמצעות מוות של תאים וחוסר קרום encapsulating, פרוסות הרתי לספק מודל מצוין לניתוח של מבחר הרתי של אוכלוסיות מסונכרנות של thymocytes בתוך microenvironment הרתי בוגר. כאן אנו מתארים את הכנת פרוסות הרתי (כולל קצירת התימוס, הטבעת agarose של אונות התימוס vibratome חתך של הרקמות המוטבעות), בידוד שכיסה של thymocytes, הניתוק של פרוסות הרתי עבור ניתוח התזרים cytometric.

פרוטוקול

פרוטוקולים לכל במחקרים בבעלי החיים אושרו על ידי ועדת הטיפול בבעלי החיים בבית המשוכלל והנדיר de המרכז - Hôpital Maisonneuve-Rosemont.

1. קציר עכבר קורנית עבור הכנת הרתי פרוסה השעיות תא בודדות

1. להרדים את העכבר עם CO ₂ ואחריו נקע בצוואר הרחם.
2. במנדף זרימה למינרית, להצמיד בצד הגחון העכבר עד קרש החיתוך. תרסיס העכבר עם אתנול 70%. הסר אלכוהול עודף בטופחו עם גזה כדי למנוע אתנול מלהיכנס חלל בית החזה פגיעה ברקמה.
3. הרם את העור בבסיס של עצם החזה עם זוג מלקחיים ולעשות חתך דרך העור. הארך את החתך של העור כלפי מעלה לכל forelimb.
4. תן קיצוץ נוסף בבסיס עצם החזה להפריד את הסרעפת מן הצלעות. ואז לחתוך בכל צד של כלוב הצלעות כלפי עצם הבריח. תהפוך את כלוב הצלעות מעל לכיוון הראש לחשוף את חלל בית החזה. שתי האונות שלהתימוס לשכב על החלק העליון של הלב.
5. הסר את רקמת חיבור סביב האונות הרתי באמצעות מלקחיים, מספרי מייקרו לנתיחה, ו / או במספריים מעוגלים חדים. השתמש זוג מלקחי קצה מעוקל בסדר להרים את האונות בודדות מתחת או באמצעות נותרי רקמת חיבור.
   הערה: אין לתפוס את התימוס ישירות.
6. מניחים את האונות הרתי צינור חרוטי 15 מ"ל המכיל PBS ומניחים בצד על הקרח עד הצורך.

2. והטבעה Agarose ו Vibratome חיתוך של הרתי אונות

1. הכן 4% פתרון agarose להטבעת ידי המסת 2 גרם agarose נקודת התכה נמוכה ב 50 מ"ל סטרילי PBS ו במיקרוגל בעוצמה נמוכה עד agarose נמס לגמרי. מכסים הבקבוק בנייר כסף ומניחים אלומיניום באמבט מים ב 55 ° C עד מוכן לשימוש.
2. במנדף בתרבית רקמה, להכין התקשורת RPMI להשלים-1640 המכיל 10% בסרום שור העובר (FBS), 4 מ"מ גלוטמין, פניצילין / סטרפטומיצין 1x, ו -10 מיקרומטר2-mercaptoethanol.
3. הוסף 1.5 מ"ל להשלים התקשורת RPMI-1640 לכל היטב צלחת תרבית תאים 6 באר ומקום הכנס תרבית תאים בכל טוב. הגדר את הצלחת בצד באינקובטור ב 37 מעלות צלזיוס עד הצורך.
4. כן אמבט מי קרח עכור עם מים וקרח בתוך דלי קרח.
5. מוציאים בזהירות את כל רקמות החיבור שנותרו סביב כל האונה הרתי באמצעות מלקחיים טיפ נאה. האם זה בעוד האונה הרתי היא שקועה PBS בצלחת בתרבית רקמה, לאחר העביר לתוך ממחטת נייר לנגב ספוגת PBS, או תחת מיקרוסקופ לנתח.
6. אפשר agarose להתקרר מתחת ל -40 מעלות צלזיוס, כאשר הבקבוק הוא רק חם למגע, כדי למנוע התחממות יתר הרקמה. יוצקים את 4% מקורר agarose לתוך תבנית רקמה עד לגובה של ס"מ 1 ~.
7. השתמש זוג מלקחיים להעביר את האונה הרתי בקפידה כדי רקמה לנגב ולגלגל אותו בעדינות כדי לייבש אותו מבלי לפגוע ברקמה. ודא כי הרקמה מתייבש לגמרי או שזה יהיה להחליק החוצה של agarose במהלך חיתוך.
8. בזהירות להכניס את האונה לתוך agarose ולמקם אותו או אופקית (כדי להגדיל את שטח הפנים של כל פרוסה) או אנכית (כדי להגדיל את מספר פרוסות) בתחתית התבנית. מניחים את התבנית במי קרח למשך 5-10 דקות, כדי לאפשר agarose כדי לחזק.
9. במהלך תקופה זו, להכין את vibratome עבור חיתוך על ידי הרכבת מגש החיץ, להרכבת דיסק הדגימה, והחדרת להב vibratome. מניחים חתיכת סרט במעבדה על הדיסק הדגימה. לעקר את סביבת העבודה נקייה, התאספו עם 70% אתנול.
10. לאחר agarose מבצרת, להפוך את התבנית ולחץ בעדינות במרכזה לשחרר את האונה מוטבע agarose.
11. השתמש סכין חד לחתוך את agarose העודף סביב האונה עוזב ~ 2 מ"מ של agarose בכל צד ו ~ 0.5 סנטימטר בתחתית.
12. Secure כל בלוק agarose עם טיפת דבק רקמות חתיכת סרט על דיסק הדגימה. יכול להיות דבוק בלוקים מרובים בקלטת.
13. יישר את wi להב vibratome th העליון של הבלוק agarose. מלאו את מגש חיץ עם PBS סטרילי עד הבלוק הלהב agarose (ים) שקועים לחלוטין.
14. סעיף הרקמה מוטבע agarose להשיג פרוסות בעובי של 400-500 מיקרומטר. הגדר את vibratome כדי 0.225 מ"מ / מהירות שניות, 100 הרץ תדיר, ו -5 ° זווית.
15. השתמש מרית והתכופפה לאסוף את הפרוסות הרתי לתוך צלחת בתרבית רקמה המכילה PBS סטרילית כפי שהם נחתכים. מחק את הפרוסה הראשונה והאחרונה.
16. בדוק את הפרוסות תחת מיקרוסקופ אור בהגדלת 4X. בחר את הפרוסות עם רקמת הרתי שלמה סביב agarose (איור 1 א).
17. מעביר את הפרוסות לצלחת מוכנה בשלב 2.3 באמצעות קצה פיפטה כדי להחליק את פרוסת הרתי בעדינות מן המרית מכופף על כנס תרבית תאים. כל כנס יכול להכיל ~ 3 פרוסות. ודא פרוסות לא נוגעים זה בזה או הקירות להכניס תרבית תאים.
18. שמור את הצלחת על 37 מעלות צלזיוס עד הצורך.

class = "jove_title"> 3. הכנת thymocytes עבור שכיסה

1. לבודד האונות הרתי כמתואר בסעיף 1. לנתק את האונות באופן ידני כדי לעשות השעיה תא בודד באמצעות מטחנת 15 מעוקר מ"ל רקמות מלא 5 מ"ל של PBS סטרילי המכיל 2% FBS. העברת התאים צינור חרוטי 15 מ"ל.
2. צנטריפוגה התאים ב 545 XG במשך 5 דקות ב 4 ° C.. בטל supernatant ו resuspend התאים 1 מ"ל של חיץ תמוגה 1x ACK (0.15 M NH ₄ Cl, 10 מ"מ KHCO _3, 0.1 מ"מ Na ₂ EDTA) בטמפרטורת החדר למשך 3 דקות עד lyse בתאי הדם האדומים.
3. מלאו את צינור עד 15 מ"ל עם PBS המכיל 2% FBS. צנטריפוגה התאים ב 545 XG במשך 5 דקות ב 4 ° C..
4. Resuspend התאים 10 מ"ל של PBS המכיל 2% FBS ולהעביר התאים דרך מסנן רשת 255 מיקרומטר.
5. ספירת תאים באמצעות hemocytometer. צנטריפוגה התאים ב 545 XG במשך 5 דקות ב 4 ° C, ו resuspend התא גלולה ב PBS המכיל 2% FBS בכל concentration של 1 x 10 ⁷ תאים לכל מ"ל.
6. התווית התאים עם צבעים סלולריים כמו אסתר succinimidyl carboxyfluorescein (CFSE) על פי פרוטוקולים של יצרן אם לא באמצעות thymocytes מעכברים להביע סמני congenic או כתבי ניאון מקודד גנטי להבחין מתאי אנדוגני פרוסים.
7. לאחר לשטוף הסופי של התאים שכותרתו, resuspend התא גלולה ב מדיה מלאה RPMI-1640 ב 1-3 x 10 ⁶ תאים לכל 15 μl.

4. שכיסה thymocytes על פרוסות הרתי

1. השתמש פיפטה כדי לשאוב כל נוזל המקיף את הפרוסות הרתי על ההוספה.
   הערה: תשמרי על עצמך כדי למנוע נזק agarose. אם agarose פגום, thymocytes המעולף לא לצרף אל פני השטח פרוסה כתוצאה מאובדן מתח פנים.
2. מבלי לגעת פרוסה עם קצה פיפטה, כיסוי 15 μl של thymocytes מוכן בסעיף 3 על כל פרוסה הרתי.
3. דגירת PLAטה ב 37 מעלות צלזיוס למשך 2 שעות כדי לאפשר לתאים לנדוד אל פרוסות הרתי.
4. לאחר 2 שעות, לשטוף את פרוסות הרתי 3 פעמים עם 1 מ"ל PBS להסיר thymocytes מעולף עודף שעדיין לא עברו לתוך הרקמה.
5. דגירה את הצלחת על 37 מעלות צלזיוס עד שהפרוסות הרתי מוכנות להיות שנקטף, בדרך כלל 1-72 שעות תלויות בניסוי.

5. דיסוציאציה של הרתי פרוסות cytometry זרימה

1. הכן צינור microcentrifuge עבור כל פרוסה על ידי הוספת 150 μl של PBS המכיל 2% FBS.
2. הוסף 1 מ"ל של PBS המכיל 2% FBS כדי להכניס את בתרבית רקמה עם פרוסות הרתי ומערבבים בעדינות עם מרית כפוף לנתק את פרוסות מפני השטח של להכניס תרבית תאים.
3. מעביר את הפרוסה מן הכנס אל צינור microcentrifuge בעזרת מרית מכופפת.
4. ידני לשבש את הפרוסה באמצעות עלי מדגם צינור microcentrifuge. להוסיף 150 μl של PBS המכיל 2% FBS לנפח סופי 300μl.
5. סנן את הרקמה ניתקה דרך פילטר 40 מיקרומטר לתוך צינור microcentrifuge חדש. התאים המסוננים מוכנים להיות מוכתם עבור ניתוח התזרים cytometric ^40.
6. סנן תאים בשנית לפני העברת על cytometer זרימה כדי להבטיח כי כל agarose מוסר ואינו לסתום את זרימת cytometer.
7. רוכש את התאים על cytometer זרימה ולנתח נתונים כפי שתואר קודם לכן ^40.

תוצאות

ניתוח תמיכת פרוסות הרתי של היבטים שונים של פיתוח תא T כגון מבחר חיובי ושלילי. עבור ניסויים מוצלחים, איכות הפרוסה הרתי היא בעל חשיבות עליונה. לפיכך, פרוסות הרתי צריך להיבדק כדי להבטיח את שלמות הרקמה הרתי וכי agarose סביב פרוסה הרתי הוא תמים (איור 1 א). מתח פנים אפשר להתפשר כאשר agarose פגום וגרם לצמצום משמעותי במספר thymocytes הנודדים אל הרקמות. לפיכך, פרוסות הרתי עם סימנים של נזק לרקמות או ניקס / דמעות agarose צר...

דיון

כאן אנו מתארים פרוטוקול להכנת פרוסות הרתי ותוצאות נציג מבחר חיובי ושלילי היעיל של הגבלה אני בכיתת MHC מראש מבחר המעולף thymocytes המהונדס TCR ידי cytometry זרימה. מערכת זו נוצל בעבר בהצלחה דומה לתמוך סלקציה חיובית של הכיתה MHC II-מוגבל CD4 ⁺ T תאים thymocytes העקורים מראש מבחר ^32, ו, בנוכחות אנטיגן אגוניסט, סלקציה שלילית ופיתוח _reg הרתי T ^{11,12, 36,38,39,43,44.} פרוטוקול זה יכול להיות שונה כדי ללמוד בחירה הרתי בנוכחות או בהעדר מעכבים, פפט...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
Vibratome	Leica Biosystems	VT1000S
NuSieve GTG Agarose	Lonza	50080	אגרוז בטמפרטורת התכה נמוכה
(קטומה - T12)	Polyciences	18986	22 מ"מ x 22 מ"מ מרובע, קטום ל-12 מ"מ x 12 מ"מ
להבי הכנה כפולים	Personna	74-0002
דבק רקמות	3M	1469SB
0.4 ומיקרו; m מוסיף תרבית תאים	BD Falcon	353090	מבין מספר מותגים שנבדקו, אלה שמרו על התאים על גבי הפרוסות הטוב ביותר
של Dulbecco's Sulbecco Sul-Buffered	Salt ThermoFisher	21600-010
RPMI-1640 עם L-גלוטמין	Wisent	350-000-CL
סרום בקר עוברי	Wisent	080-110	מומת בחום
, 200 מ"מ	Wisent	609-065-EL
פניצילין/סטרפטומיצין, 100x	Wisent	450-201-EL
2-Mercaptoethanol	אלפא Aesar	A15890
15 מ"ל מטחנות רקמות Tenbroeck	Wheaton	357426
אספקת רכיב מסנן רשת ניילון		U-CMN-255
צינור מיקרוצנטריפוגה מדגם עלי	Bel-Art	F19922-0000
40 ומיקרו; m מסננת תאי ניילון	BD Falcon	352340
מלקחיים קצה אינוקס	Dumont	RS-5047	מלקחיים מעוקלים בקצה עדין, גודל .17 x .10 מ"מ
מיקרו מלקחיים	Dumont	RS-5090

תבנית הטבעה L-גלוטמין