רקמות קרינה הופעלו מיון תאים (FACS) וניתוח ביטוי גנים של נוירונים Fos להביע מ טרי קפוא מוח החולדה

סיכום

כאן אנו מציגים מיון תא הופעל קרינה (FACS) פרוטוקול ללמוד שינויים מולקולריים Fos להביע רכבים עצביים משתי רקמת מוח טריה וקפואה. שימוש רקמה קפוא מאפשר בידוד FACS של אזורי מוח רבים על פני פגישות מרובות כדי למקסם את השימוש בנושאי בעלי חיים בעלי ערך.

תקציר

המחקר של פלסטיות עצבית ושינויים מולקולריים התנהגויות למדו עובר מהמחקר של אזורים במוח כולו ללימוד קבוצות הספציפיות של נוירונים מופעלים בדלילות שנקראים רכבים עצביים אשר מתווכות למדו עמותות. תא קרינת מיון מופעל (FACS) כבר מותאם לאחרונה עבור רקמת מוח עכברוש מבוגר ואפשר בידוד של נוירונים מופעלים באמצעות נוגדנים נגד הסמן העצבי NeuN ו Fos חלבון, סמן של נוירונים הופעל בחום. עד עכשיו, פוס-להביע עצב סוגי תאים אחרים נותקו מן הרקמה טריה, שהיה כרוכות ימי עיבוד ארוכים ואפשרו מספרים מצומצמים מאוד של דגימות המוח יוערכו לאחר נהלי התנהגות ממושכים ומורכבים. כאן מצאנו כי התשואות של Fos-להביע עצב ו Fos mRNA מ בסטריאטום הגבי היו דומות בין רקמות טרי גזור ורקמות קפוא ב -80 ºC עבור 3 - 21 ימים. בנוסף, אישרנו את הפנוטיפשל NeuN-חיובי תאים ממוינים NeuN שליליים על ידי סמני ביטוי גנים בהערכת סעיף עצבי (NeuN), astrocytic (GFAP), oligodendrocytic (Oligo2) ו microgial (Iba1), אשר מציין כי רקמה קפוא יכולה לשמש גם לבידוד FACS של סוגי תאי גליה. בסך הכל, אפשר לאסוף, לנתח ולהקפיא רקמת מוח הפעלות FACS המרובה. זה ממקסם את כמות נתונים המתקבלים בנושאי בעלי חיים יקרים, כי לעתים קרובות עברו נהלי התנהגות ארוכים ומורכבים.

מבוא

במהלך למידה, חיות להתאגד בין מכלולי גירויים מאוד ספציפיים. מידע ברזולוציה גבוהה זה הוא חשב להיות מקודד על ידי שינויים בתוך דפוסים מסוימים של נוירונים בדלילות שנקראים רכבים עצביים. רכבים עצביים זוהו לאחרונה על ידי האינדוקציה של גנים מוקדם מייד (IEGs) כגון Fos, Arc, ואת Zif268 ומוצרי החלבון שלהם בנוירונים אשר הופעלו בתוקף במהלך התנהגות או חשיפת קיו. Fos-להביע עצב בפרט הוכח לשחק תפקידים סיבתי בהקשר ו קיו ספציפי למדו התנהגויות ^1-4. לפיכך, neuroadaptations המולקולרי הייחודי בתוך המופעל אלה נוירונים Fos להביע הם מועמדים מובילים עבור המנגנונים העצביים מקודדים למדו עמותות נוצרו במהלך למידה רגילה ולמידה נורמלית הפרעות, כגון התמכרות והפרעת דחק פוסט-טראומטית (PTSD) ^5.

FluoreCell Scence המיון המופעל (FACS) אפשר ניתוח לאחרונה neuroadaptations המולקולרי הייחודי בתוך הנוירונים להביע Fos. Cytometry זרימה מיון תאים שפותחו בשנות ה -1960 ^6,7 לאפיין ולבודד תאים לפי מאפייני פיזור האור ואת immunofluorescent שלהם, ואת כבר זמן רב בשימוש באימונולוגיה וחקר הסרטן. עם זאת cytometry זרימת FACS דורש תאים בודדים ניתקים שקשה להשיג מרקמות מוח מבוגרות. FACS שימש לראשונה לבודד ולנתח חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) -expressing נוירונים striatal מעכברים מהונדס כי לא דורשים תיוג נוגדן ^8,9. פתחנו שיטת FACS מבוסס נוגדנים ¹⁰ לבודד ולהעריך שינויים מולקולריים Fos-להביע עצב מופעל על ידי סמים ו / או רמזים בחי סוג בר ^11-15. בשיטה זו, נוירונים מסומנים עם נוגדן כנגד הסמן עצבי הכללי NeuN, בעוד מופעל בחום נוירוניםמסומנים עם נוגדן כנגד Fos. אמנם השיטה הראשונית שלנו נדרשת איגום של עד 10 חולדות לדגימה עבור רקמה טריה, שינויים מאוחרים יותר של הפרוטוקול מותר בידוד FACS של נוירונים Fos-הבעת תגובת שרשרת פולימראז כמותיים (qPCR) ניתוח של אזורים במוח הבדידים של חולדה אחת ^13-15 . בסך הכל, שינויים מולקולריים ייחודיים נמצאו Fos-להביע עצב המופעל במהלך מגוון של התנהגויות להיקשר ו קיו המופעל במחקר התמכרות ^12,14,15.

בעיה לוגיסטית גדולה עם ביצוע FACS על רקמה טריה היא שזה לוקח יום שלם כדי לנתק את הרקמה ותהליך ידי FACS. בנוסף, רק כארבע דגימות יכולות להיות מעובד ליום. בדרך כלל זה אומר כי רק באזור מוח אחד ניתן להעריך מכל מוח ואת אזורי המוח הנותרים צריכים להיות מושלכים. זוהי אחת בעיות עיקריות עבור נהלי התנהגות תפוקה נמוכה כגון מנהל עצמי ואת trai ההכחדהנינג הדורש ניתוח ושבועות רבים של אימונים אינטנסיביים. יתר על כן, ארוכים ומורכבים נהלי התנהגות ביום בדיקה מקשה לבצע FACS באותו היום. זה יהיה יתרון משמעותי על מנת להיות מסוגל להקפיא את המוח מן הבהמה מיד לאחר בדיקות התנהגותיות, ולאחר מכן לבודד נוירונים Fos להביע מאזורים במוח אחד או יותר בזמנים שונים לפי בחירת החוקרים.

כאן אנו מראים כי פרוטוקול FACS שלנו יכול לשמש כדי לבודד נוירונים Fos להביע (סוגי תאים אחרים) משתי רקמת מוח טריה וקפואה. כדוגמא, אנחנו מבודדים Fos-להביע עצב מן בסטריאטום עכברוש לאחר זריקות מתאמפטמין אקוטיות של חולדות נאיביות ללא זריקות (מצב מלא). עם זאת, פרוטוקול FACS זה יכול לשמש לאחר כל טיפול התנהגותי או תרופתי. ניתוח qPCR העוקבת של דגימות שלנו עולה כי ביטוי גנים סוגי תאים אלה ניתן להעריך עם סימייעילות Lar משתי רקמות טריות וקפואות.

פרוטוקול

כל הניסויים בוצעו בהתאם ועדת טיפול בבעלי חיים מוסדיים השתמש (IACUC) של ה- National Institutes of Health מדריך לטיפול ושימוש בחיות מעבדה ^16.

הערה: כל השלבים הבאים צינורות צנטריפוגה שימוש מחייב נמוכים כי הוחזקו על קרח אלא אם צוין אחר.

1. הכנה לפני אוסף רקמות

1. הגדר את צנטריפוגות עד 4 ^מעלות צלסיוס
2. אש פולנית סט של שלוש פיפטות פסטר זכוכית עם בקטרים ​​הולכים ויורדים של 1.3 כ, 0.8, ו -0.4 מ"מ עבור כל דגימה.
3. הכן שכותרתו 1.7 מ"ל-צינורות המכיל 1 מ"ל קר הצפת ולשמור את הצינורות על הקרח.
4. הכין מגש קרח המכיל את מוח חיתוך מטריקס, שפכטלים וצלחות זכוכית (או בכלי זכוכית פטרי הפוכים) שעליו לבצע את הנתיחה. צמרמורת קדם סכיני גילוח שתיים או יותר על נייר לוחות זכוכית ושימוש ברקמות לייבוש כל המכשירים כי לגעת tנושא.
5. להפשיר את הפתרון אנזים בטמפרטורת החדר (RT) למשך 30 דקות לפני איסוף רקמות.

רקמות 2. איסוף Dissection

1. ליזום את 90 דקות טיפול התנהגותי או תרופתי לפני איסוף רקמות.
   הערה: לקבלת התוצאות המוצגות כאן, זריקות intraperitoneal חריפות של 5 מ"ג / קילו מתאמפטמין על חולדות בסביבת רומן (תנאי בדיקה) וחולדות נאיביות בכלובים בביתם (מצב מלא) בוצעו.
2. להרדים את העכברוש על ידי הצבתו בתוך צנצנת ייבוש זכוכית עם isoflurane רווי לערוף את 30 עכברוש - שניות 60 מאוחר יותר באמצעות גיליוטינה.
   השתמש במספריים כדי להסיר את העור והשרירים מהראש ולחשוף את הגולגולת. השתמש rongeurs לחתוך את הגולגולת ולפתוח מגנום foramen ולהסיר את החלק האחורי של הגולגולת. השתמש rongeurs לחתוך לאורך השוליים העליונים של הגולגולת כדי לחשוף את המוח. היזהר שלא להזיק למוח. השתמש מרית קטנה כדי לגרוף בעדינות תחתd לרומם את המוח. הרם את המוח לחתוך את העצבים עד למוח ללא תשלום ^17.
3. לנתח רקמות באמצעות סכיני גילוח.
   הערה: קבל דגימות רקמה באמצעות אחת מהשיטות הבאות: (2.3.1) רקמת גזור טרי; (2.3.2) רקמה קפוא לאחר דיסקציה; או (2.3.3) רקמה קפוא גזור מן המוח כולו קפוא. שמור המטריצה ​​חיתוך המוח, סכיני גילוח ויבש זכוכית צלחת ברחבי לנתיחה וקוצצים תהליכים כמים מרוכז יכול להוביל lysing hypotonic של תאים. השתמש בזכוכית מגדלת על מנת להבטיח לנתיחה מדויקת.
   1. עבור רקמות גזורות טרי, למקם את המוח הטרי חילוץ לתוך מטריצת חיתוך המוח (תבנית מתכת עכברוש בצורת מוח עם חריצים עבור סכיני הגילוח ב 1 במרווחי מ"מ) כי כבר מקוררת על קרח. הכנס שני או יותר סכיני גילוח מראש צונן לתוך החריצים לחתוך פרוסות עטרה המכילות את האזור במוח (ים) של עניין. מניח את הפרוסה לגזור על צלחת זכוכית הצוננת.
      הערה: לנתח את Regio המוחNS של ריבית על צלחת זכוכית צוננת.
   2. עבור רקמה קפוא לאחר דיסקציה, לנתח את האזור במוח (ים) של עניין מן פרוסות מוח חילוץ טרי, דומה לזה שתואר לעיל 2.3.1. הנח את הרקמה גזורה לתוך microtube במהירות להקפיא את הרקמות על ידי השריית microtube ב איזופנטאן -40 ºC במשך 20 שניות. שמור גזור הרקמה הקפואה בכל עת במקפיא -80 ºC עד לעיבוד נוסף.
   3. עבור הרקמה הקפואה, מיד להקפיא את המוח חילוץ טרי ב -40 ºC איזופנטאן ולאחסן בשקית אטומה ב -80 ºC עד 6 חודשים.
      1. ביום לנתיחה, למקם את המוח הקפוא בתוך cryostat נקבע על כ -20 ºC (לא חם יותר מאשר -18 ºC) למשך כ 2 שעות כדי לאזן את הטמפרטורה.
         הערה: Brains ניתן לחתוך בקלות בטמפרטורה זו, בעוד הרבה בטמפרטורות קרירות להפוך את המוח שביר מדי להיחתך בבטחה.
      2. השתמש סכיני גילוח לחתוך 1 - 2 מ"מ פרוסות עטרה שלבמוחם הקפוא cryostat. שימוש במחט 12 עד 16-מד קהה להשיג אגרופי רקמה פרוסות אלה בתנאי הקפאה. שמור גזור הרקמה הקפואה בכל עת עד לעיבוד נוסף.
4. להוסיף 1 - 2 טיפות של הצפה כדי לכסות את הרקמה הגזורה לפני מיותר. הסר ביותר של החומר הלבן מהרקמה באמצעות שני סכיני גילוח כדי למנוע אובדן של נוירונים במהלך שאר תהליך הטחינה הדק. אם מתחיל עם רקמה קפוא, ואז לאפשר לרקמות להפשיר על צלחת הזכוכית הקרה למשך לא יותר מ 1 דקות לפני מריחת הצפת פתרון.
5. לרכך את הרקמה 100 פעמים בכל כיוון מאונך עם סכין גילוח על צלחת זכוכית צוננת. החזק את סכין הגילוח אנכי לצלחת הזכוכית כאשר מיותר.
   הערה: מתייפייפים יסודי הוא קריטי עבור כל צעדי הפרוטוקול.
6. השתמש סכיני גילוח להעביר את רקמות טחון לתוך צינורות microcentrifuge המכיל 1 מ"ל של חיץ א קר להפוך את הצינור 3 - 5 פעמים כדי KEEP כל הרקמות הטחונות בתמיסה.

3. תא דיסוציאציה

הערה: בסוף עדין השתמש מעל סוף הערבוב עבור כל השלבים הבאים. אין להשתמש במערבל מערבולת ולהימנע בועות אוויר הגורמות נזק לתאים.

1. צנטריפוגה דוגמיות ב 110 XG במשך 2 דקות ב 4 ºC. supernatant מחק. לאט לאט להוסיף 1 מ"ל של תמיסת אנזים קר טרי מופשר (המכיל תערובת של אנזימים מפרקי חלבונים) במורד הדופן הפנימית של microtube. מייד להתחנף הגלולה כולו פיפטה בעדינות מעלה ומטה רק 4 פעמים עם טפטף בקוטר טיפ גדול בינוני לפזר את גלולת רקמות הטחונה.
2. הפוך את microtubes מייד כדי למנוע הגלולה יידבק לתחתית דגירת הדגימות עם ערבוב קצה מעל לקצה עבור 30 דקות ב 4 ^מעלות צלסיוס
3. לאחר עיכול רקמות האנזימטית, צנטריפוגה צינורות ב 960 XG במשך 2 דקות ב 4 ºC. הסר את supernatant ולהוסיף 0.6 מ"ל של קר הצפת א Immediately לאחר הוספת החיץ, להשתמש באותו קצה פיפטה לפזר את הכדור על ידי מתחנף הגלולה כולו פיפטה בעדינות מעלה ומטה 5 פעמים.
4. מבחינה מכאנית triturate הרקמה מתעכלת ונאסף 15 מיליליטר צינורות באמצעות השלבים הבאים. עבור כל דגימה, השתמש קבוצה נפרדת של 3 פיפטות פסטר זכוכית אש מלוטש עם יורד בקטרים ​​של כ 1.3, 0.8 ו -0.4 מ"מ מחוברת נורות לטקס.
   1. בעדינות triturate כל דגימה 10 פעמים עם פיפטה זכוכית 1.3 מ"מ. בואו המדגם להסתפק 2 דקות על הקרח (פסולת ותאי undissociated יהיה ליישב לתחתית). אסוף את supernatant (~ 0.6 מ"ל) ולהעביר צינור חרוטי 15 מ"ל (צינור # 1).
   2. להוסיף 0.6 מ"ל הצפת פתרון גלולה הנותרים. Triturate מדגם 10 פעמים עם פיפטה זכוכית 0.8 מ"מ. בואו המדגם להסתפק 2 דקות על הקרח. אסוף את supernatant (~ 0.6 מ"ל) ולהעביר אותו 15 מ"ל # צינור חרוטי 1.
   3. להוסיף 0.6 מ"ל הצפת פתרון Pelle הנותריםt. Triturate מדגם 10 פעמים עם פיפטה זכוכית 0.4 מ"מ. בואו המדגם להסתפק 2 דקות על הקרח. אסוף את supernatant (~ 0.6 מ"ל; בלי לגעת גלולה עם תאים שאינם ניתק) ולהעביר לאותו 15 מ"ל # צינור חרוטי 1.
      הערה: שמור על פיפטה בקוטר 0.4 מ"מ בצינור # 1 עבור צעדי הטחינה הדקים הבאות.
   4. 3.4.3 חזור על שלב שלוש פעמים יותר בעזרת פיפטה זכוכית הקטנה (~ 0.4 מ"מ קוטר), לאסוף את supernatant לתוך צינור חרוטי 15 מיליליטר נפרד (צינור # 2).
   5. Triturate השעיות התא נאספים צינורות # 1 ו # 2 עבור 10 פעמים יותר בעזרת פיפטה זכוכית 0.4 מ"מ ולשמור על הקרח.

Cell 4. קיבוע Permeabilization

1. כן 4 microtubes לדגימה (שני microtubes עבור תאים מצינור # 1 ושני תאים מצינור # 2) על ידי הוספת 800 μl של אתנול קר 100% (מאוחסן ב -20 ^מעלות צלסיוס לפני השימוש) לתוך צינור אחד ולשמור אותם על קרח . הערה: אתנול הסופיריכוז יהיה 50%.
2. פיפטה ~ 800 μl של מתלי התא (מצינור # 1 צינור # 2) לתוך כל אחת מ -4 הצינורות המכילים אתנול קר להפוך את הצינורות כדי לערבב את הדגימות.
3. דגירת צינורות על קרח במשך 15 דקות תוך היפוך הצינורות כל 5 דקות.
4. לאחר קיבוע / permeabilization, צנטריפוגות צינורות ב 1700 XG במשך 4 דקות ב 4 ºC וזורקים supernatant. השאירו 50 μl של פתרון כדי למנוע אובדן התא.
   הערה: הכדורים בשלב הזה לבנים, מקל פחות לקיר של הצינורות מבעבר permeabilization. לכן, להסיר את supernatant בקפידה על ידי נוגע בקיר של microtube שבו אין גלולה ולצייר את supernatant לאט באמצעות micropipette.

סינון נייד 5.

1. Re- להשעות את כדורי משלב 4.4 עם PBS קר כדלקמן:
   1. להוסיף 550 μl של PBS קר אל אחד משני microtubes מגיע צינור # 1, ולהשתמש pi בקוטר גדול בינוניטיפ pette כדי פיפטה עד ההשעיה תא בעדינות מעלה ומטה 5 פעמים. חזור על אותו הדבר עבור microtube אחד מגיע צינור # 2.
   2. עבור תאים מצינור # 1, באמצעות פיפטה אותו, להעביר את השעית התא הראשונה של הגלולה השנייה. Resuspend גלולה השני על ידי pipetting למעלה ההשעיה תא משולב בעדינות מעלה ומטה 5 פעמים.
   3. עבור תאים מצינור # 2, resuspend ולשלב את הכדורים (כלומר, microtubes השלישי והרביעי) כמתואר 5.1.2.
2. סנן את שני מתלי התא מפני צעדים 5.1.2 ו 5.1.3 בנפרד באמצעות שני זוגות שונים של מסננות תא (100 מיקרומטר ו 40 מיקרומטר גודל נקבובי) כדלקמן:
   1. טרום רטוב כל מסננת תא על ידי הוספת PBS על החלק הפנימי של המסננת. השתמש פיפטה להסיר את PBS העודף מהחלק החיצוני של המסננת.
   2. פיפטה השעית תא משלב 5.1.2 באופן אחיד על מסננת התא הראשונה עם גודל נקבובי 100 מיקרומטר. אסוף את הזרימה דרך צינור 50 מ"ל על הקרח. השתמש pipette כדי לאסוף את הזרימה דרך מצורף בתחתית הצד החיצונית של מסננת התא.
   3. השתמש פיפטה אותו להעביר את הזרימה דרך מן מסננת תא 100 מיקרומטר מסננת תא 40 מיקרומטר. אסוף זרימה דרך זו עוד צינור 50 מ"ל על הקרח. בעת העביר את הזרימה דרך מ- 40 מיקרומטר מסננת תא, לשנות טיפים פיפטה חדשים כדי למנוע זיהום בין 100 מיקרומטר תא מסנן.
   4. חזור על שלבים אלה עבור השעית התא משלב 5.1.3 באמצעות סט חדש של מסננים.
3. מערבבים את הזרימה דרך שתי מכל מדגם עבור נפח סופי של כ 1 מ"ל לדגימה.

6. דגירה עם נוגדנים

הערה: משתמש aliquots הקטן של מתלי תא המוח להכין דגימות שליטה מרובות עבור הגדרת הזרימה מתאימה cytometer הגדרות לפני הפעלת המדגם העיקרי. עבור כל תיוג נוגדן, להכין דגימות בקרה כוללות לא נוגדנים, רק seנוגדן condary (או תווית ניאון אחרת), ולאחר מכן הוא נוגדנים ראשוניים ומשניים (או תווית ניאון אחרת). השתמש בבקרות אלה כדי להגדיר את השערים מפרידים ספציפי לעומת התיוג הלא ספציפי של cytometer הזרימה. במידת האפשר, להשתמש fluorochromes שאינם דורשים פיצוי. הגבר את עוצמת הקול הסופית של דגימות בקרת gating לנפח סופי של 700 μl ידי הוספת PBS לפני הוספת הנוגדנים הראשוניים.

1. הכן-פיזור אור מדגם מלא DAPI ידי העברת מדגם 100 μl של התאים המסוננים על microtube 1.7 מיליליטר. להוסיף 600 μl של PBS קר עם 1 מיקרוגרם / מ"ל ​​DAPI מכתים גרעינים. דגירה במשך 10 דקות עם ערבוב הקצה על הקצה, ולשטוף (כמצוין צעדים 6.4.2 ל 6.4.5) לפני שהיא עוברת דרך cytometer זרימה.
   הערה: דגימה זו משמשת רק כדי להגדיר את שער התא / גרעינים לפני מיון התאים הנותרים במכונת FACS.
2. הכן דגימות בקרת immunolabeled יחידות על ידי העברת 100 & #181; l של תאים מסוננים על 1.7 מ"ל microtube. להוסיף 600 μl של PBS קר עם נוגדן אחד (למשל, נוגדן NeuN). להוסיף 600 μl של PBS קר אל microtube עם נוגדן אחר (למשל, נוגדן Fos). מוסיף את הנוגדנים משני המתאימים אם זה לא נוגדן ראשוני ישיר מצומדות.
   הערה: דגימות אלה משמשים כדי לקבוע את צינור מכפיל המתאים (PMT) מתח, ועל מנת להעריך את החפיפה של שני אותות ניאון במידת הצורך. ריכוזי נוגדנים צריכים להיות טיטרציה כדי להשיג את יחסי אות לרעש הטובים ביותר בכל הערוצים. אותות ניאון חופפים ניתן לפצות גם על ידי כיול פנימי של ערוצי ניאון שונים בתוך הזרימה cytometer.
3. הכן מדגם שליטה שלילי ניאון שכותרתו כפול על ידי העברת 100 μl של תאים מסוננים על microtube 1.7 מ"ל. להוסיף 600 μl של PBS הקר עם נוגדנים משני לבד או נוגדנים ראשוניים ישירים מצומדות IgG.
   הערה: תימדגם מלא של ניתן להשתמש בכל פעם לפני המיון כדי לקבוע את קרינת הרקע עבור כל fluorophore.
4. כן מדגם עיקרי להיות מסודר.
   1. העבר 700 μl של תאים מסוננים לתוך 1.7 מ"ל microtube. להוסיף 7 μl (1: 100) של נוגדן Fos העיקרי מצומדות ישירות אלקסה פלואוריד 647 (אנטי-Fos-AF647) ו -1.4 μl (1: 500) של נוגדן NeuN העיקרי מצומדות ישירות Phycoerythrin (אנטי-NeuN-PE). דגירה צינורות במשך 30 דקות ב 4 מעלות צלזיוס עם ערבוב הקצה על הקצה.
   2. בסוף הדגירה, מוסיפים 800 μl של קר PBS על כל microtube, כולל המדגם העיקרי דגימות בקרה, ומערבבים על ידי היפוך.
   3. microtubes צנטריפוגה ב 1,300 XG 3 דקות ב 4 ºC. בטל supernatant, עוזב 50 supernatant μl כדי למנוע אובדן התא.
   4. הוסף 1 מיליליטר של PBS הקר לתאים הגלולים ו resuspend בעזרת פיפטה בקוטר טיפ די רב.
   5. צנטריפוגה ב 1300 XG 3 דקות ב 4 ºC. Discard supernatant.
   6. Re- להשעות גלולה ב 500 μl PBS קר (להתאים את עוצמת הקול הסופי תלוי בגודל של גלולה).
   7. העברה ולסנן את ההשעיה לתוך צינור מדגם מסביב לתחתית FACS עם כובע מסננת תא (40 מיקרומטר). שמור את התאים immunolabeled על הקרח ומיד לבצע FACS. הערה: סינון, לגעת קצה פיפטה אנכית על הכובע המסנן ולדחוף את השעית תא דרך זה.
5. זרימת גדר cytometer שערים באמצעות דגימות בקרה.
   1. השתמש פיזור אור המדגם מלא DAPI לזהות את אוכלוסיית תאים העצבית מאירועי הכולל ופסולת הסלולר.
      הערה: גופי תא בהכנה זו הם רק 1 - 2% של סך כל אירועים (השאר הוא פסולת תהליכים תאיים שבורים). בהתבסס על אות ניאון DAPI (גרעינים מציינים) ואת פיזור קדימה (גודל של התא) אפשר לאתר גופי תא שער לאחור מבוססים על קדימה וצד אור פיזור נכסים שלהתאים (כפי שמוצג באיור 1 א ', ב).
   2. השתמש בדגימות שליטה immunolabeled אחת כדי לקבוע את הגדרות מתח PMT, ולנתח גלישת פליטה מן fluorochrome אחד מסוים לתוך מסנן אחר / ערוץ (למשל, Alexa פלואוריד 488 / FITC או Phycoerythrine). אם אותות ניאון חופפים, לתקן את החפיפה באמצעות התאמת רמות פיצוי ידנית.
   3. השתמש בשלט השלילי הניאון שכותרתו הכפול להגדיר את הסף עבור האוכלוסייה החיובית.
      הערה: האות מגיע מדגם זה נחשב בשל קרינה אוטומטית ותאי המדגם העיקרי הנמצא מעל סף זה יכול להיחשב חיובי. בדרך כלל, פרמטרי הסף למיון הם מחמירים יותר וכ העליון 2/3 התאים שכותרתו מעל הביקורת השלילית הם למעשה מסודרות.
6. מיין הנוירונים מן המדגם העיקרי ידי FACS לתוך 1.7 microtubes מ"ל. אוספים את התאים לתוך 50 μl של רנ"אחיץ החילוץ. לאחר מיון, מערבולת ו צנטריפוגות הצינור ומערבב את ההשעיה על ידי pipetting למעלה ולמטה 10 פעמים כדי לשחזר את כל התאים הממוינים מן הקירות של הצינור.
7. לדגור על השעיית התא מיון ב -42 ºC למשך 30 דקות על מנת להבטיח כי כל התאים lysed לפני מיצוי RNA, ולאחר מכן צנטריפוגות ב 2,800 XG במשך 2 דקות ב 4 ºC.
8. מעבירים את supernatant צינור RNase ללא עבור אחסון לטווח ארוך ב -80 ºC או מיד לעבד את המדגם עבור בידוד RNA, סינתזה cDNA, הגברה-מראש הגן היעד qPCR, כפי שתואר לעיל ^13-15.

תוצאות

מיון נוירונים Fos-חיובי Fos-שלילי מרקמות בסטריאטום הגבה טריות וקפואות מן החולדות יחידות לאחר זריקות מתאמפטמין חריפות.

הפרוטוקול המתואר לעיל היה רגיל לסוג Fos-חיובי Fos-שלילי נוירונים מתוך 90 דקות בסטריאטום הגבי יחיד חולדה לאחר זריקה intraperitoneal של מתאמפטמין (5 מ"ג / ק"ג). חולדות נאיביות בכלובים בביתם שמשו שולטים. הגב רקמות בסטריאטום היה מעובד א...

דיון

ניתן להשתמש FACS למיין נוירונים סוגי תאים אחרים מרקמות המוח המבוגר טרי או קפוא. כפי שהוזכר במבוא, את היכולת להשתמש רקמה קפוא מאפשרת ניצול אופטימלי של דגימות מבעלי החיים שעברו הליכי התנהגותי מורכבים וממושך, כגון לימודי מנהל עצמי ו להרע במחקר התמכרות. נהלי התנהגות אלה בדרך כלל לוקחים 1 - 2 שעות או יותר, ודורשים כל בעלי החיים (10 - 20 בסך הכל) להיבדק באותו היום ^13,18. זה לוקח ~ 4 שעות לעבד דגימות רקמת מוח 4 טריים גזורות, הכוללת לנתיחת מוח, תא דיסוציאציה, permeabilization ו...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
מטריצת מוח	CellPoint Scientific	69-2160-1	להשגת פרוסות מוח קורונליות
תרדמת שינה פלואורסצנטית נמוכה	סיביות מוח	HA-lf	Buffer A בפרוטוקול משמשת לעיבוד רקמות ותאים משלבי דיסוציאציה לשלבי קיבוע
Accutase	Millipore	SCR005	בפרוטוקול משמשת לעיכול אנזימטי של רקמות לפני טריטורציה
שפופרת חלבון LoBind 1.5 מ"ל,	22431081 אפנדורף		PCR למניעת אובדן תאים במהלך הפרוטוקול
מסננת תאים, 40 ומיקרו; m	BD Falcon	352340	לסינון מתלה תאים
מסננת תאים, 100 ומיקרו; m	BD Falcon	352360	לסינון מתלה תאים
Falcon 5 מ"ל מבחנה פוליסטירן תחתון עגול עם מכסה הצמד מסננת תאים	BD Bioscience	352235	לסינון תרחיף תאים לפני שהוא עובר דרך ציטומטר הזרימה
פסטר פיפט,	זכוכית NIH אספקת	6640-00-782-6008	לביצוע טריטורציה של רקמות
Milli-Mark Anti-NeuN-PE, שיבוט A60 (חד שבטי עכבר) נוגדן	EMD Millipore	FCMAB317PE	נוגדן לזיהוי נוירונים
Phospho-c-Fos (Ser32) (D82C12) XP Rabbit (Alexa Fluor 647 Conjugate)	טכנולוגיית איתות סלולרי	8677	נוגדן לזיהוי תאים המבטאים Fos
DAPI	Sigma	D8417	לסימון גרעינים
PicoPure RNA Isolation Kit	Applied Biosystems.	KIT0204	הערכה כוללת את מאגר מיצוי ה-RNA לשלב 6.14. הוא משמש לאיסוף תאים ממוינים
Superscript III מערכת סינתזת cDNA גדיל ראשון	Invitrogen	18080-051	לסינתזה של cDNA מ-RNA
TaqMan PreAmp Master Mix	Applied Biosystems.	4391128	לעשות קדם-הגברה ממוקדת מ-cDNA
TaqMan Advance Fast Master	יישומי ביוסיסטמס.	4444963	לבצע PCR באמצעות בדיקות TaqMan
Fos TaqMan בדיקה	Applied Biosystems.	Rn00487426_g1	בדיקה TaqMan/פריימרים
NeuN בדיקה TaqMan	Applied Biosystems.	רצף נוקלאוטידים	CACTCCAACAGCGTGAC
NeuN פריימר קדימה	יישומי ביוסיסטמס.	רצף נוקלאוטידים GGCCCCTGGCAGAAAGTAG	לסמן גנים עצביים
NeuN פריימר הפוך	ביו-מערכות יישומיות.	TTCCCCCTGGTCCTTGA	עבור סמן גנים עצביים
Gfap בדיקת TaqMan	Applied Biosystems.	Rn00566603_m1	בדיקת TaqMan/פריימרים לסמן גן אסטרוסיטיק
iba-1 בדיקת TaqMan	Applied Biosystems.	Rn00574125_g1	בדיקה / פריימרים של TaqMan לסמן גן microglya
Gapdh בדיקה TaqMan	Applied Biosystems.	CTCATGACCACAGTCCA	להתייחסות/משק בית gene
Gapdh פריימר קדימה	יישומי ביוסיסטמס.	GACAACTTTGGCATCGTGGAA	להתייחסות/משק בית gene
Gapdh פריימר הפוך	Applied Biosystems.	CACAGTCTTCTGAGTGGCAGTGA	רצף נוקלאוטידים לעיון / משק בית gene
Oligo2 בדיקת TaqMan	Applied Biosystems.	Rn01767116_m1	בדיקה / פריימרים של TaqMan לסמן גן אוליגודנדרוציטי
פיפטור P1000	Rainin	17014382	הוא מכונה פיפטה עם קוטר קצה גדול בשלבים 3.1 ו-3.3 לטריטורציה קלה של רקמות ושלב 6.7 להשעיית תאים
7500 מערכת PCR מהירה בזמן אמת	Applied Biosystems.	446985	ל-PCR כמותי
FACSAria I Cell Sorter	BD Biosciences		למיון FACS