הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

הנדסה גנטית של שמרים לא קונבנציונליים עבור Biofuel מתחדשת והפקה ביוכימיים

14.5K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/54371

⸱

20 בספטמבר 2016

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biochemistry, Yong Loo Lin School of Medicine, National University of Singapore, 2NUS Synthetic Biology for Clinical and Technological Innovation (SynCTI), Life Sciences Institute, National University of Singapore, 3Food Science and Chemical Engineering, Singapore Institute of Technology

במאמר זה

סיכום

אנו מדווחים כאן על שיטות למניפולציה גנטית מולקולרית של זן Yarrowia lipolytica Po1g לשיפור יעילות מחיקת הגנים. לזני Y. lipolytica המהונדסים המתקבלים יש יישומים פוטנציאליים בייצור דלק ביולוגי וביוכימי.

תקציר

Yarrowia lipolytica הוא מין שמרים שאינם פתוגניים, דימורפית ו אירובית בהחלט. בשל התכונות הפיזיולוגיות הייחודיות שלה מאפיינים מטבוליים, שמרים הלא השיגרתי הזה הוא לא רק מודל טוב ללימוד של הטבע הבסיסי של בידול פטרייתי אבל הוא גם פלטפורמה מיקרוביאלי מבטיחה לייצור ביוכימיים יישומים ביוטכנולוגיים שונים, הדורשים מניפולציות גנטיות נרחבות. עם זאת, מניפולציות גנטיות של י ' lipolytica היה מוגבל בשל העדר מערכת טרנספורמציה גנטית יעילה ויציבה כמו גם שיעור גבוה מאוד של רקומבינציה שאינו הומולוגי שניתן לייחס בעיקר גן KU70. כאן אנו מדווחים פרוטוקול קל ומהיר עבור השינוי הגנטי היעיל למחיקת גני י lipolytica Po1g. פרוטוקול ראשית, עבור השינוי היעיל של ה- DNA אקסוגני לתוך י ' lipolytica Po1g הוקמה. SecoND, כדי להשיג את השיעור ההומולוגי פעמים המוצלבות המשופר למחיקה נוספת של גני המטרה, גן KU70 נמחק על ידי הפיכת קלטת שיבוש נושאת 1 נשק הומולוגית kb. שלישית, כדי להדגים את יעילות מחיקת גן המשופרת לאחר המחיקה של גן KU70 מחקנו בנפרד 11 גני מטרת קידוד dehydrogenase אלכוהול מונואמין אלכוהול באמצעות אותם ההליכים על זן הפלטפורמה בנוקאאוט KU70. היה נראה כי השיעור הומולוגי מדויק גדילה בצורה ניכרת מפחות מ -0.5% למחיקה של גן KU70 ב Po1g ל -33% -71% עבור מחיקת הגן היחידה של 11 גני יעד Po1g KU70 Δ. פלסמיד בשכפול הדנ"א נושא את סמן התנגדות B hygromycin ומערכת Cre / LoxP נבנה, ואת גן סמן בחירה זני בנוקאאוט שמרים בסופו של דבר הוסר על ידי ביטוי של recombinase Cre כדי להקל סבבים רבים של targeמניפולציות גנטיות טד. מוטציות מחיקת גן יחיד וכתוצאה מכך יש יישומים פוטנציאליים דלק ביולוגי וייצור ביוכימיים.

מבוא

בניגוד שמר אפייה, Yarrowia lipolytica, גידול שמרים בלתי שיגרתי, יכול לגדול בצורה של שמרים או תפטיר בתגובה לשינויי 1,2 תנאים סביבתיים. לפיכך, שמרים דימורפית זה יכול לשמש כמודל טוב ללימוד של בידול פטרייתי, morphogenesis ו 3,4,5 הטקסונומיה. זה נחשב בדרך כלל כמין שמרים בטוח (GRAS), שנמצא בשימוש נרחב כדי לייצר מגוון רחב של תוספי מזון כגון חומצות אורגניות, polyalcohols, תרכובות הארומה, מתחלבים פעילי שטח 6,7,8,9. זהו aerobe מחייבים וכן שמרים oleaginous ידועים מסוגל צבירת שומנים באופן טבעי לסכומים גבוהים, כלומר, עד 70% של תא יבש משקל 10. זה גם יכול לנצל קשת רחבה של מקורות פחמן לצמיחה, כולל סוגים שונים של שאריות לבזבז משאבים כיסודות הזנה 11,12,13. כל תכונות ייחודיות אלה הופכים י lipolytica מאוד אטרקטיבי עבוריישומים ביוטכנולוגיים שונים.

למרות רצף הגנום כולו של י ' lipolytica כבר פורסם 14,15, מניפולציה גנטית של השמרים הלא השיגרתי הזה היא יותר מורכבת מאשר מיני שמרים אחרים. ראשית, טרנספורמציה של מינים שמרים זה הוא הרבה פחות יעיל בשל העדר של 16,17 מערכת טרנספורמציה גנטית יציב ויעיל. שנית, אינטגרציה הגנומי מייגעת של קלטות ביטוי ליניארי משמשת בדרך כלל את הביטוי של גנים של עניין כמו אין מערכת פלסמיד episomal הטבעי כבר נמצאה שמרים זה 18. שלישית, דור-outs הדפיקה הגנטי ולהפיל-ins מוגבל בגלל ההתמקדות בגנים יעילה באמצעות רקומבינציה הומולוגי מדויק בשמרים זה הנו נמוכים ביותר אירועי האינטגרציה להתרחש באמצעות הצטרפותו קצה שאינו הומולוגי (NHEJ) 19.

במחקר זה, אנו מדווחים על פרוטוקול טרנספורמציה אופטימיזציה עבור י lipolytica זן Po1g, אשר קל, מהיר, יעיל לשחזור. כדי לשפר את התדירות הומולוגית מדויק, מחקנו את גן KU70, אשר מקודד אנזים מפתח בנתיב NHEJ. באמצעות פרוטוקול טרנספורמציה אופטימיזציה והפיכת קלטת בנוקאאוט ליניארי המכילה איגוף אזורי הומולוגיה של 1 קילו, גן KU70 של י ' lipolytica Po1g נמחק בהצלחה. חוסנו של המתודולוגיה המחיקה הגן הזה אז הודגם על ידי מיקוד dehydrogenase אלכוהול וגנים מונואמין אלכוהול זן Δ KU70 Po1g. היה נראה כי זן מחיקת KU70 הציג יעילות גבוהה באופן משמעותי של גן בתיווך הומולוגי מיקוד מזו של זן Po1g wild-type. בנוסף, פלסמיד ביטוי בשכפול הדנ"א Cre נושא את סמן התנגדות B hygromycin נבנה לבצע הצלת סמן. הצלת הסמן מקלה סבבים רבים של גן המיקוד ב הדואר המתקבל מוטנטים מחיקת גן. מלבד מחיקת גן, הפרוטוקול שלנו לטרנספורמציה הגנטי מחיקת גן המתואר כאן ניתן ליישם להכניס גני לוקוסים ספציפיים, וכדי להציג מוטציות ספציפיות לאתר לתוך י ' הגנום lipolytica.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

דור 1. של י ' זנים מחיקים KU70 lipolytica

  1. בנייה של הקלטת שיבוש
    הערה: ראה טבלה 1 עבור כל פריימרים המשמשים תגובת שרשרת פולימראז הרחבות (PCR).
    1. פריימרים עיצוב 20 עד PCR להגביר את קלטת ביטוי LEU2 (ראו טבלה 1) מתוך י ' וקטור ביטוי lipolytica ולהציג אתרי LoxP לתוך 5 'ו 3' מסתיים של הקלטת LEU2 עם פריימר קדימה ארוך (# 1; טבלה 1) פריימר הפוכה ארוך (# 2; טבלה 1), בהתאמה. כדי להציג את אתר מגבלה נוסף על הצעדים הבאים של תהליך השיבוט, להוסיף את אתר מגבלה בם HI ב פריימר # 1.
    2. בצע PCR באמצעות DNA פולימרז באיכות גבוהה כמפורט בטבלה 2.
    3. לטהר את קלטת PCR המוצר LoxP-האמרגן-LEU2-terminator-LoxP באמצעות purificatio PCRערכת n על פי הוראות היצרן. להוסיף 3'-A המסוכך על מוצר PCR מטוהר פי הוראות היצרן 21. השתמש T4 DNA האנזים ולקשור המוצר PCR זנב a ל וקטור שיבוט ת"א להניב הפלסמיד T-LEU2 לפי טבלה 3.
    4. PCR להגביר את רצף הזרם 5 '1 kb של הגן KU70 באמצעות פריימרים # 3 / # 4 מן י lipolytica Po1g הדנ"א הגנומי 22 לפי טבלה 2. לטהר את מוצר ה- PCR באמצעות ערכת טיהור PCR פי הוראות היצרן.
      1. Double לעכל הוא מוצר PCR מטוהר פלסמיד T-LEU2 עם Sac השנייה בם HI אנזימים לפי טבלת 4. לטהר את תערובת העיכול באמצעות ערכת טיהור PCR לפי הוראות יצרן. השתמש האנזים T4 DNA ולקשור מטוהרים מתעכל המוצר PCR אל Sac II / Bam HI האתרים של T-LEU2 להניבפלסמיד T-LEU2-5E לפי טבלה 3.
    5. PCR להגביר את רצף במורד 3 '1 kb של הגן KU70 באמצעות פריימרים # 5 / # 6 מן י lipolytica Po1g הדנ"א הגנומי 22 לפי טבלה 2. לטהר את מוצר ה- PCR באמצעות ערכת טיהור PCR פי הוראות היצרן. Double לעכל הוא מוצר PCR מטוהר פלסמיד T-LEU2-5E עם לא אני חס"ם אני אנזימים לפי טבלת 4.
      1. לטהר את תערובת העיכול באמצעות ערכת טיהור PCR לפי הוראות יצרן. לאחר מכן, ולקשור את מטוהרים מתעכל המוצר PCR אל לא אני / חס"ם אני האתרים של T-LEU2-5E להניב הפלסמיד T-KO באמצעות האנזים T4 DNA על פי טבלה 3.
    6. לעכל את הפלסמיד T-KO עם Sac השנייה חס"ם אני אנזימים לפי טבלה 4 כדי לייצר את הקלטת הפרעה (איור 1 ). לטהר את שברי DNA מתעכל באמצעות ערכת טיהור PCR לפי הוראות היצרן.
  2. הכנת תא מוסמכת וטרנספורמציה של י ' זן lipolytica Po1g
    1. הכנת תא מוסמכת
      1. לחסן מושבה של י ' lipolytica Po1g זן מהצלחת תמצית-peptone דקסטרוז שמרים טריים (YPD) ב 10 מ"ל של מדיום YPD (1% תמצית שמרים, 2% peptone, 2% דקסטרוז ו -50 מ"מ pH חיץ ציטראט 4.0) בבקבוק 100 מ"ל. דגירה באינקובטור רועד 30 מעלות צלזיוס ב 225 סל"ד במשך 20 שעות עד הרוויה (OD של 600 על 15, נמדד באמצעות ספקטרופוטומטר).
      2. גלולת התאים על ידי צנטריפוגה במשך 5 דקות ב 5000 XG בטמפרטורת חדר. שוטפים את התאים עם 20 מ"ל טריס-EDTA (TE) חיץ (10 מ"מ טריס, 1 mM EDTA, pH 7.5), ו גלולה התאים כמתואר בשלב 1.2.1.2. Resuspend התאים 1 מ"ל של 0.1 מ 'אצטט ליתיום (pH 6.0, מותאם עם חומצה אצטית), דגירה במשך 10 דקות ב בטמפה בחדרrature.
      3. Aliquot התאים המוסמכים (100 μl) לתוך צינורות 1.5 מיליליטר סטרילי. והמשך לביצוע הפעולות טרנספורמציה מתחת מיד, או להוסיף גליצרול לריכוז סופי של 25% (v / v) ולאחסן ב -80 ° C עבור אחסון לטווח ארוך.
    2. טרנספורמציה
      1. בעדינות מערבבת 10 μl של ה- DNA זרע סלמון המפוגל (10 מ"ג / מיליליטר) ו 1-5 מיקרוגרם של הקלטת השיבוש מטוהרת יחד עם 100 μl של תאים מוסמכים, לדגור על 30 מעלות צלזיוס במשך 15 דקות.
      2. הוסף 700 μl של פוליאתילן גליקול 40% (PEG) -4000 (מומס pH אצטט 0.1 M ליתיום 6.0), מערבבים היטב דגירה באינקובטור רועד 30 מעלות צלזיוס ב 225 סל"ד במשך 60 דקות.
        הערה: חשוב להשתמש PEG עם משקל מולקולרי ממוצע של 4000, במקום-3350 PEG (משמש בדרך כלל את הטרנספורמציה של שמרים קונבנציונאלי).
      3. מחממים לזעזע את תערובת הטרנספורמציה על ידי הנחת הצינור באמבט מים C ° 39 במשך 60 דקות.
      4. הוסף 1 מ"ל בינוני YPD ולהתאושש במשך שעה 2 ב 30 מעלות צלזיוס, 225 סל"ד. צנטריפוגה ב 9,000 XG עבור 1 דקות בטמפרטורת החדר, להסיר את supernatant ו resuspend גלולה ב 1 מ"ל של חיץ TE.
      5. Repellet את התאים על ידי צנטריפוגה ב 9000 XG במשך 1 דקות בטמפרטורת החדר וזורקים supernatant. Resuspend גלולה ב 100 μl של חיץ TE צלחת לצלחות סלקטיבית (למשל, צלחות לאוצין מחסר), לדגור על 30 מעלות צלזיוס במשך 2-3 ימים.
      6. פיק 4 עד 10 מושבות אחת לחסן בנפרד לתוך 2 מ"ל של מדיום YPD. דגירת לילה חממה רועדת 30 מעלות צלזיוס ב 225 סל"ד. זיהוי מושבות חיוביות על ידי ניתוח PCR של הדנ"א הגנומי מן transformants 22 לפי לוח 5 באמצעות שתי קבוצות של פריימרים 55 # / # 56 ו- # 56 / # 57, בהתאמה.
        הערה: לא אני לינארית וקטור pYLEX1 הופך י lipolytica Po1g תאים מוסמכים כדי לקבוע את יעילות השינוי על ידי ספירת המספרשל הקמת יחידות המושבה (CFU) לכל פלסמיד מיקרוגרם DNA בשימוש 23.

2. מרקר הצלה

  1. בנייה של פלסמיד ביטוי Cre
    1. בניית pYLEX1-CRE ו pYLEX1-השרוולים
      1. פריימרים עיצוב 20 עד PCR להגביר את מסגרות קריאה פתוחה של cre ואת שרוולי. הוסף נוקלאוטיד אדנין נוסף במעלה הזרם של קודונים התחלה של פריימרים קדימה 82 # ו # 84, והכנס אתרי הגבלה Kpn לי במורד הזרם של קודונים עצירה פריימרים הפוכה # 83 ו # 85. PCR להגביר את מסגרות קריאה פתוחה של cre ו שרוולים מ pSH69 (HQ412578 מספר הצטרפות) 24 לפי טבלה 2.
      2. לטהר הן cre ושברי שרוולים באמצעות ערכת טיהור PCR פי הוראות היצרן. תקציר הן שברי cre ואת שרוולי מטוהרים עם Kpn שאני האנזים לפי Tablדואר 4. להכפיל לעכל את הפלסמיד pYLEX1 עם PML אני Kpn שאני אנזימים לפי טבלה 4. לטהר את התערובת העיכול באמצעות ערכת טיהור PCR לפי הוראות היצרן.
      3. השתמש אנזים T4 DNA על פי טבלה 3 ולקשור את שברי המטוהרים מתעכלים cre ואת השרוולים לאתרי PML I / Kpn א 'של י' וקטור ביטוי lipolytica, מניב pYLEX1-CRE ו pYLEX1-שרוולים, בהתאמה.
    2. בניית pSL16-CRE-השרוולים
      1. PCR להגביר את הקלטת גן-terminator האמרגן של cre מ pYLEX1-CRE באמצעות פריימרים 86 # / # 87 איגוף באתרי הגבלה סאל I / Pst לי לפי טבלה 2. לטהר את מוצר ה- PCR באמצעות ערכת טיהור PCR פי הוראות היצרן .
        1. Double לעכל הן המוצר PCR מטוהרים pSL16-CEN1-1 (227) פלסמיד 25 עם סאל אניPst שאני אנזימים לפי טבלה 4. לטהר את התערובת העיכול באמצעות ערכת טיהור PCR לפי הוראות היצרן. לאחר מכן, ולקשור את מוצר ה- PCR המטוהר מעוכל אל pSL16-CEN1-1 (227) באתרים המתאימים ליצור pSL16-CRE באמצעות אנזים T4 DNA על פי טבלה 3.
      2. PCR להגביר את הקלטת הגן-terminator האמרגן של שרוולים מ pYLEX1-שרוולים באמצעות פריימרים # 88 / # 89 איגוף באתרי ההגבלה Xho I / BGL השנייה לפי טבלה 2. לטהר את מוצר ה- PCR באמצעות ערכת טיהור PCR פי הוראות היצרן .
        1. Double לעכל הוא מוצר PCR מטוהר פלסמיד pSL16-CRE עם Xho I ו- II BGL אנזימים לפי טבלת 4. לטהר את תערובת העיכול באמצעות ערכת טיהור PCR לפי הוראות יצרן. לאחר מכן, ולקשור את המוצר המטוהר מתעכל PCR לתוך pSL16-CRE בבית המקבילאתרים ליצור pSL16-CRE-שרוולים באמצעות אנזים T4 DNA על פי טבלה 3.
          הערה: פלסמיד הביטוי Cre וכתוצאה מכך, pSL16-CRE-השרוולים, מטפח סמן לבחירת hygromycin B ו- הוא וקטור centromeric ו episomally המשכפל (איור 2).
      3. אמת את כל המבנים על ידי עיכול עם אנזימי הגבלה המתאים (למשל, סאל I / Pst לי, שיחתוך את הכנס מפני וקטור) לפי טבלה 4.
  2. הצלת סמן recombinase בתיווך Cre
    1. Transform pSL16-CRE-שרוולים לתאי מוסמכות של הזן בנוקאאוט KU70 בעקבות פרוטוקול השינוי בסעיף 1.2 לעיל. פלייט טרנספורמציה תאים על YPD בתוספת hygromycin B (YPDH) צלחות (המכיל 400 מיקרוגרם / מ"ל ​​ב hygromycin), לדגור על 30 מעלות צלזיוס במשך 2-3 ימים.
    2. בצע המושבה PCR לפי טבלה 5 פריימרים באמצעות # 84 / # 85 לזהות חיוביתמושבות המכילות pSL16-CRE-שרוולי פלסמיד לאחר שינוי.
      הערה: קדימה פריימר 84 # ואת ממוקמי פריימר ההפוך 85 # שבתחומי אזור הקידוד של גני שרוולים (טבלה 1). רק שיבוטים חיוביים ליצור מוצר PCR ספציפי תגובת PCR.
    3. בחר שיבוט חיובי לחסן לתוך 2 מיליליטר של מדיום YPDH, דגירה באינקובטור רועד 30 מעלות צלזיוס ב 225 סל"ד לילה לרוויה. מדוד את התא OD 600 עם ספקטרופוטומטר. קציר התאים ב OD של 600 ~ 15. צנטריפוגה ב 5000 XG במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר, ולשטוף פעם עם 2 מ"ל של מים סטריליים.
    4. Re-לחסן תאים לתוך 2 מ"ל של מדיום YPD עם OD הראשונית 600 של 0.1 ולאפשר לתאים לגדול חממה רועד 30 מעלות צלזיוס ב 225 סל"ד לילה. Streak התרבות התא לילה לצלחות YPD לבודד מושבות אחת 23. מושבות צלחת Replica על YPD, YPDH, וצלחות לאוצין מחסר 23 .
      הערה: מושבות שאבדו הן סמן LEU2 ו פלסמיד pSL16-CRE-השרוולים יכול לגדול רק על צלחות YPD (איור 3).

מחיקת 3. dehydrogenase אלכוהול אלכוהול מונואמין גנים

  1. בצע חיפוש על י ' מסד נתוני הגנום lipolytica באמצעות כלי חיפוש יישור המקומיים הבסיסיים (יפציץ) לזהות מועמדי הגן למחיקה 26. קלט את רצף החלבון של ס dehydrogenase אלכוהול cerevisiae לי לתוך כלי חיפוש תפציץ (http://www.genome.jp/tools-bin/search_sequence?prog=blast&db=yli&seqid=aa).
    הערה: כלי החיפוש יפציץ מחזיר את רצפי חלבונים הדומים ביותר י מסד נתוני הגנום lipolytica.
  2. לבנות את הקלטות המחיקות על ידי PCR עם פריימרים מספר 7 56 # (טבלה 1), ולבצע עיכול אנזים הגבלה ותגובות קשירה באמצעות אותן השיטות כמתוארות בסעיף 1.1 לעיל.
  3. Prepהם תאים מוסמכים של הזן בנוקאאוט KU70, לבצע טרנספורמציות ולבצע PCR לזהות מושבות חיוביות עם פריימרים # 55, # 58 כדי # 81 (טבלה 1) על ידי ביצוע הפרוטוקול המתואר בסעיף 1.2 לעיל.
    הערה: כדוגמא, את הליך מחיקת גן YALI0E17787g מתואר איורי 4 ו -5. ההשפעות של 1 קילו ו 2 קילו ארוך באזור ההומולוגי על שיעור הומולוגי מדווחות.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

י 'לינארית וקטור ביטוי lipolytica הוכנס לתוך פלטפורמת עגינה PBR בגנום של י ' lipolytica Po1g זן על ידי ביצוע רקומבינציה מוצלב יחיד 27. באמצעות הליך השינוי הכימי המהיר הוקם בשינה במחקר זה, י 'לינארית וקטור ביטוי lipolytica הפך בהצלחה לתוך זן Po1g wild-type בכל יעילות השינוי של> 100 CFU / מיקרוגרם DNA. קלטת בנוקאאוט המוקפת רצפים הומולוגיים 1 kb הפכה לזן Po1g ואת גן KU70 נ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

המטרה שלנו עבור מחקר זה היא לאפשר לדור מהיר ויעיל של נוקאאוט גנטי ממוקד י lipolytica Po1g זן. מספר שיקולים צורך לטפל כדי להשיג זאת. ראשית, יעילות שינוי גבוה נדרשת. לפיכך, פרוטוקול טרנספורמציה כימית יעיל ונוח עבור י lipolytica Po1g זן תואר במחקר זה. השימוש-4000 PEG מהווה גורם קריטי עבור טרנספורמציה המוצלחת של זן זה. אין transformants התקבלו לטרנספורמציה פלסמיד בעת שימוש PEG-3350 (עבור הטרנספורמציה של cerevisiae ס) במקום PEG-4000. בנוסף, הכנת תאים...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

למחברים אין מה לחשוף.

תודות

אנו בתודה להכיר תמיכת המימון מהסוכנות להגנת הסביבה הלאומית של סינגפור (ETRP 1,201,102), תכנית המחקר התחרותית של הקרן הלאומית למחקר של סינגפור (NRF-CRP5-2009-03), הסוכנות למדע, טכנולוגיה ומחקר של סינגפור ( 1324004108), גלובל מו"פ פרויקט תכנית, משרד כלכלת ידע, הרפובליקה של קוריאה (N0000677), סוכנות הפחתת איום הביטחון (DTRA, HDTRA1-13-1-0037) ואת הביולוגיה הסינטתית היוזמת של האוניברסיטה הלאומית של סינגפור ( DPRT / 943/09/14).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
<חזק>ריאגנט/חומר
פריימרים אוליגונוקלאוטידיםטכנולוגיות DNA משולבות25 nmole DNA oligos
Y. lipolytica זן Po1gYeast Biotechלאוצין נגזרת אוקסוטרופית של הזן הפראי W29 (ATCC 20460)
וקטור pYLEX1Yeastern BiotechFYY203-5MGY. lipolytica וקטור ביטוי
E. coli TOP10Invitrogenלשיבוט והתפשטות של פלסמידים
וקטור pGEM-T PromegaA3600TA וקטור שיבוט
QIAprep Spin Miniprep KitQiagen27106לבידוד פלסמיד
אשף SV ג'ל ו
מערכת ניקוי PCR		PromegaA9282חלץ שברי DNA מג'ל אגרוז
וטהר מוצרי PCR מתגובת
הגברה iProof high-fidelity
DNA פולימראז		Bio-Rad172-5302DNA פולימראז
BamHI ניו אינגלנד BiolabsR0136Sאנזים הגבלה
BglII ניו אינגלנד BiolabsR0144Lאנזים הגבלה
KpnIניו אינגלנד BiolabsR0142Sאנזים הגבלה
NdeI ניו אינגלנד BiolabsR0111Sאנזים הגבלה
NotIניו אינגלנד BiolabsR0189Lאנזים הגבלה
PmlIניו אינגלנד BiolabsR0532Sאנזים הגבלה
PstI ניו אינגלנד BiolabsR0140Sאנזים הגבלה
SacIIניו אינגלנד BiolabsR0157Sאנזים הגבלה
SalIניו אינגלנד BiolabsR0138Sאנזים הגבלה
XhoIניו אינגלנד BiolabsR0146Lאנזים הגבלה
T4 DNA ligaseניו אינגלנד BiolabsM0202L
Taq DNA פולימראז& נ.ב.פ;Bio-RadM0267L
AmpicillinGibco-Life Technologies11593-027אנטיביוטיקה
Hygromycin BPAAP21-014אנטיביוטיקה
GeneRuler סולם DNA 1 kb ThermoScientificSM0312סולם DNA 1 kb
PEG4000Sigma95904-F
TrisPromegaH5135
EDTABio-Rad161-0729
זרע סלמון DNAInvitrogen15-632-011
ליתיום אצטטסיגמא
חומצה אצטיתחרוזי זכוכית סיגמא
(425-600 ומיקרו; m)SigmaG8772
RNAse AThermo ScientificEN0531
DNA טעינת צבעThermo ScientificR0611
תמצית שמרים בקטוBD212750
בקטו פפטוןBD211677
D-גלוקוזבסיס ראשוןBIO-1101
YNB ללא חומצות אמינוסיגמאY0626
DO תוסף-LeuClontech630414
גליצרולSigmaG5516
Difco LB מרקBD244620
Difco LB אגרBD244520
בקטו אגרBD214010
<חזק>ציוד
מכונת PCRBioradT100 אמבט מים תרמי Cycler
MemmertWNB 14
חממה נייחת/טלטולYihderLM-570RD
שייקר תרמוAllshengMS-100
מיקרו צנטריפוגהEppendorf5424R
צנטריפוגהEppendorf5810R
ספקטרופוטומטראפנדורף ביופוטומטר פלוס
מצלמת ג'לGEAmersham Imager 600

מקורות

  1. Jiménez-Bremont, J. F., Rodrìguez-Hernández, A. A., Rodrìguez-Kessler, M. Development and dimorphism of the yeast Yarrowia lipolytica. Dimorphic fungi: Their importance as models for differentiation and fungal pathogenesis. J, R. uiz-H. errera , 58-66 (2012).
  2. Coelho, M., Amaral, P., Belo, I. Yarrowia lipolytica: an industrial workhorse. Current research, technology and education topics in applied microbiology and microbial biotechnology. Méndez-Vilas, A. , 930-940 (2010).
  3. Martinez-Vazquez, A., et al. Identification of the transcription factor Znc1p, which regulates the yeast-to-hypha transition in the dimorphic yeast Yarrowia lipolytica. Plos One. 8 (6), e66790(2013).
  4. Richard, M., Quijano, R. R., Bezzate, S., Bordon-Pallier, F., Gaillardin, C. Tagging morphogenetic genes by insertional mutagenesis in the yeast Yarrowia lipolytica. J. Bacteriol. 183 (10), 3098-3107 (2001).
  5. Flores, C. L., Martìnez-Costa, O. H., Sánchez, V., Gancedo, C., Aragòn, J. J. The dimorphic yeast Yarrowia lipolytica possesses an atypical phosphofructokinase: characterization of the enzyme and its encoding gene. Microbiology. 151 (5), 1465-1474 (2005).
  6. Domìnguez, Á, et al. Non-conventional yeasts as hosts for heterologous protein production. Int. Microbiol. 1 (2), 131-142 (1998).
  7. Zinjarde, S. S. Food-related applications of Yarrowia lipolytica. Food Chem. 152, 1-10 (2014).
  8. Finogenova, T., Morgunov, I., Kamzolova, S., Chernyavskaya, O. Organic acid production by the yeast Yarrowia lipolytica: a review of prospects. Appl. Biochem. Micro+. 41 (5), 418-425 (2005).
  9. Groguenin, A., et al. Genetic engineering of the β-oxidation pathway in the yeast Yarrowia lipolytica to increase the production of aroma compounds. J. Mol. Catal. B-Enzym. 28 (2), 75-79 (2004).
  10. Meng, X., et al. Biodiesel production from oleaginous microorganisms. Renew. Energ. 34 (1), 1-5 (2009).
  11. Papanikolaou, S., Aggelis, G. Lipid production by Yarrowia lipolytica growing on industrial glycerol in a single-stage continuous culture. Bioresource Technol. 82 (1), 43-49 (2002).
  12. Tai, M., Stephanopoulos, G. Engineering the push and pull of lipid biosynthesis in oleaginous yeast Yarrowia lipolytica for biofuel production. Metab. Eng. 15, 1-9 (2013).
  13. Liu, H. H., Ji, X. J., Huang, H. Biotechnological applications of Yarrowia lipolytica: Past, present and future. Biotechnol. Adv. 33 (8), 1522-1546 (2015).
  14. Liu, L., Alper, H. S. Draft genome sequence of the oleaginous yeast Yarrowia lipolytica PO1f, a commonly used metabolic engineering host. Genome Announc. 2 (4), e00652-e00614 (2014).
  15. Dujon, B., et al. Genome evolution in yeasts. Nature. 430 (6995), 35-44 (2004).
  16. Chen, D. C., Beckerich, J. M., Gaillardin, C. One-step transformation of the dimorphic yeast Yarrowia lipolytica. Appl. Microbial. Biotechnol. 48 (2), 232-235 (1997).
  17. Wang, J. H., Hung, W., Tsai, S. H. High efficiency transformation by electroporation of Yarrowia lipolytica. J. Microbiol. 49 (3), 469-472 (2011).
  18. Matsuoka, M., et al. Analysis of regions essential for the function of chromosomal replicator sequences from Yarrowia lipolytica. Mol. Gen. Genet. 237 (3), 327-333 (1993).
  19. Kretzschmar, A., et al. Increased homologous integration frequency in Yarrowia lipolytica strains defective in non-homologous end-joining. Curr. Genet. 59 (1-2), 63-72 (2013).
  20. Lorenz, T. C. Polymerase Chain Reaction: Basic Protocol Plus Troubleshooting and Optimization Strategies. J. Vis. Exp. (63), e3998(2012).
  21. Kobs, G. Cloning blunt-end DNA fragments into the pGEM-T Vector Systems. Promega Notes. 62, 15-18 (1997).
  22. JoVE Science Education Database. Isolating Nucleic Acids from Yeast. Essentials of Biology 1: yeast, Drosophila and C. elegans. , JoVE. Cambridge, MA. Available from: http://www.jove.com/science-education/5096/isolating-nucleic-acids-from-yeast (2016).
  23. Sanders, E. R. Aseptic laboratory techniques: plating methods. J. Vis. Exp. (63), e3064(2012).
  24. Hegemann, J. H., Heick, S. B. Delete and repeat: a comprehensive toolkit for sequential gene knockout in the budding yeast Saccharomyces cerevisiae. Methods Mol. Biol. 765, 189-206 (2011).
  25. Yamane, T., Sakai, H., Nagahama, K., Ogawa, T., Matsuoka, M. Dissection of centromeric DNA from yeast Yarrowia lipolytica and identification of protein-binding site required for plasmid transmission. J. Biosci. Bioeng. 105 (6), 571-578 (2008).
  26. McGinnis, S., Madden, T. L. BLAST: at the core of a powerful and diverse set of sequence analysis tools. Nucleic Acids Res. 32 ((Web Server issue)), W20-W25 (2004).
  27. Madzak, C., Tréton, B., Blanchin-Roland, S. Strong hybrid promoters and integrative expression/secretion vectors for quasi-constitutive expression of heterologous proteins in the yeast Yarrowia lipolytica. J. Mol. Microbiol. Biotechnol. 2 (2), 207-216 (2000).
  28. Nicaud, J. M., Le Clainche, A., Le Dall, M. T., Wang, H., Gaillardin, C. Yarrowia lipolytica, a yeast model for the genetic studies of hydroxy fatty acids biotransformation into lactones. J. Mol. Catal. B-Enzym. 5 (1), 175-181 (1998).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

Yarrowia lipolyticaKU70DNACre LoxP
הנדסה גנטית של שמרים לא קונבנציונליים עבור Biofuel מתחדשת והפקה ביוכימיים
צור קשר
המלצה לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

2026 © זכויות יוצרים MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.