זיהוי תפוקה גבוהה של חיידקים פולימרים דוחה עבור אביזרים ומכשור רפואי

סיכום

מתוארת שיטת מיקרו-מערך בעלת תפוקה גבוהה לזיהוי פולימרים המפחיתים את קשירת פני השטח של חיידקים במכשירים רפואיים.

תקציר

מכשירים רפואיים קשורים לעתים קרובות לזיהומים שנרכשו בבתי חולים, המפעילים עומס עצום על החולים ועל מערכת הבריאות וכן תורמים לעמידות לאנטיביוטיקה. דרך אפשרית אחת להפחתת זיהומים הקשורים למכשיר היא זיהוי ציפויים פולימריים דוחי חיידקים עבור מכשירים אלה, אשר ימנעו קשירת חיידקים בשלב ההצמדה הראשוני. מתוארת כאן שיטה לזיהוי פולימרים דוחים כאלה, המבוססת על הקרנה מקבילה של מאות פולימרים באמצעות מיקרו-מערך. שיטה זו בעלת תפוקה גבוהה הביאה לזיהוי מגוון של פולימרים מבטיחים שהתנגדו לקשירה של מיני חיידקים שונים רלוונטיים מבחינה קלינית בנפרד וגם כקהילות מרובות מינים. פולימר אחד, PA13 (פולי (methylmethacrylate-co-dimethylacrylamide)), הראה ירידה משמעותית בהתקשרות של מספר מבודדים בבתי חולים כאשר הוא מצופה על שני צנתרים ורידיים מרכזיים זמינים מסחרית. ניתן ליישם את השיטה המתוארת לזיהוי פולימרים למגוון רחב של יישומים שבהם שינוי התקשרות חיידקים חשוב.

מבוא

Microarrays פולימרים הם מיניאטורי פלטפורמות תפוקה גבוהה שבה עד 7,000 פולימרים ¹ מודפסים על גבי שקופיות זכוכית עבור ניתוח מקביל עם תאים פרוקריוטים או איקריוטיים ^2. השיטה המוצגת כאן בונה על מזו שתוארה לראשונה בשנת 2010 ^3. מערכת סינון זה הוחל על סוגי תאים רבים, כולל hepatocytes אדם ^4, תאי גזע ^5, לתאי האפיתל צינורי כליות ^2, חיידקים ^3,6 ופתוגנים protozoan ^7. בכל מקרה, פולימרים מקדמים או להתנגד המחייב של התאים נחקרים זוהו ^8. קומפלקסים של DNA עם פולימרים סינתטיים polycationic גם שימשו במתכונת microarray להקרנה תפוקה גבוהה של מועמדים transfection גן ^9. וכן בדיקות סקר לאיתור אינטראקציות תא-מצע, microarrays הפולימר גם שמש להערכת תכונות חומר ^10.

"> היכולת של פולימרים סינתטיים לווסת מצורף של חיידקים על משטח מעוגנת היטב ^3,6,11. גורמים רבים כולל תשלום, הידרופוביות חספוס פני השטח של משטח פולימר ידועים בהשפעתם מחייב בקטריאלי. הגישות המקובלות של biomaterials גילוי אשר עמיד מחייב של חיידקים באמצעות ברצף או בעיצוב אמפירי ובדיקת חומר אחד בכל פעם הם עתירים עבודה, יקר ותהליכים זמן רב. microarrays הפולימר להציע חלופה אטרקטיבית עקיף מגבלות כאלה.

משטח הקשורים החיידקים לגדול כאוכלוסייה מורכבת כינה ביופילם - biofilms כגון עמידות מאוד בפני לחצים ואנטיביוטיקה סביבתיים רבים. מדובר בין שאר בשל מטריקס הדחוסה (המורכבת של חלבונים, סוכרים וחומצות גרעין) ¹² ובחלקה בשל הנוכחות המוגברת של חזקים "persistor" תאי biofilms ^13. Althoאיכס המנגנון המדויק של עמותת משטח היווצרות ביופילם עוקבת קשה לאפיין, המקובל לחשוב כי ישנם שלושה שלבים שונים של התפתחות שטח ^{14 - 16.} מצורף ראשונית, הפיך ואחריו הידבקות חזקה של תאים, הקמת biofilm ידי ייצור של חלבון תאי מטריקס פוליסכריד ובחלוקה של תאים. לבסוף, משחרר ביופילם בוגר ללא תאים חיים פלנקטוניים, אשר יכול ליזום זיהומים חדשים במקום אחר. חיידקים-בהדיפת פולימרים המונעים את הקובץ המצורף הראשונית של חיידקים, ולכן למנוע בשלבים המוקדמים של היווצרות ביופילם, פוטנציאל לייצג פתרון מעולה עבור צמצום זיהומים. נוכח העלייה של עמידות לאנטיביוטיקה (וגם ההתנגדות באופן מהותי יותר של חיידקים משטח הקשורים ^12), אמצעי ללא אנטיביוטיקה של הפחתת זיהומים הם בעלי עניין מיוחד. בבית חולים, חיידקים בהדיפת פולימרציפוי יכול להיות יישום רפואי ישירות להפחתת זיהומים הנרכשים בבית חולים, המהווים בדרך כלל סביב התקנים מושתלים ^17.

כאן, שיטת תפוקה גבוהה להקרנה של 381 פולימרים לפעילות דוחה נגד מגוון רחב של חיידקים פתוגניים הקשורים זיהומים הנרכשים בבית חולים, ואחריו אימות להיט וציפוי עתידי assay של חומרים קטטר מרכזיים ורידים, מתוארת (איור 1). בקצרה, פולימרים נראו על גבי שקופיות זכוכית מצופה agarose ידי הדפסה קשר, לאחר ייבוש ועיקור, מערכי מיניאטורי הודגרו עם תרבויות חיידקים חשיבות קלינית. לאחר הדגירה, microarrays נשטפו בעדינות תאי חיידקיים חסידים הוכתמו ו מדמיינים ידי קרינה. בהמשך לכך, פולימרים אשר עכבות חיידקי מחייב נחקרו בקנה מידה גדול יותר על ידי ציפוי על מכסה זכוכית תלוש ו מדמיינים ידי מיקרוסקופי אלקטרונים. להדוף נבחרפולימרים השאילו היו מצופים אז על צנתרים מסחריים כמפחיתים מצורפים של חיידקים על ידי כמעט 100 לקפל.

פרוטוקול

1. הכנת שקופיות מצופות Agarose

הערה: לפני בודה את microarrays פולימר, שקופיות זכוכית מצופה aminoalkylsilane מצופות agarose IB למזער שאינם ספציפיים רקע מחייב ולאפשר הערכה של פולימרים אשר נקלטות או להדוף חיידקים ^6. ציפוי Silane מקל עקידת agarose על השקופיות.

1. להמציא 2% (w / v) של IB agarose במים מזוקקים בבקבוק 250 מ"ל.
2. לאחר תקרת הבקבוק רופפת, לחמם את ההשעיה במיקרוגל ב -30 תקופות שניות עד שהיא נמסה. ודא כי השווי אינו סגור היטב כדי למנוע הצטברות לחץ פוטנציאלית. הסר את הבקבוק באופן קבוע ו מערבולת בעדינות.
3. ודא כי מוצק נמס והפתרון ברור. יוצקים פתרון agarose זה לתוך מבחנה 100 מ"ל, ומניחים באמבט מים C 65 ° לשמור בתמיסה נוזלית.
4. טובל את השקופיות מצופות silane לתוך תמיסת agarose, הבטחת ציפוי אחיד, ואינטרנטpe האחורי של השקופית עם נייר טישו.
5. לייבש את השקופיות, עם למעלה בצד מצופה, בסביבה ללא אבק (למשל, בתוך ארון או קטר מכסה המנוע) למשך תקופה מינימלית של 24 שעות.
6. אשר ציפוי אחיד על ידי בדיקה ויזואלית. ציפוי ניתן להעריך בקלות על ידי נשימה לשקופית - עיבוי יהוו על אזורים ללא ציפוי. מגלשות רק מצופות לחלוטין ובאופן שווה אמורות לשמש להדפסת microarray.

2. הכנת תמיסות פולימר עבור הדפסה

1. הכינו פתרונות (1% w / v) של מבחר של פולימרים מתבצעות המורכב polyacrylates, polyacrylamides ו פוליאוריתן ב -methylpyrrolidone N (NMP) צלוחיות זכוכית. (להכין 1 מ"ל של כל פולימר). וורטקס עד הפולימר נמס לגמרי. סינתזה של פולימרים מתואר במקומות אחרים ^6.
2. באמצעות מיקרו-פיפטה, למלא היטב בכל צלחת microwell 384 עם פתרון פולימר 25 μl, להבטיח כי אין conta צלבmination וכל טוב מכיל פולימר ייחודי. השתמש NMP כביקורת שלילית 2 בארות לפחות. רשום את זהותו של פתרון פולימר בכל טוב על קובץ תבנית או גיליון אלקטרוני הצלחת היטב.

3. Microarrays פולימר הדפסה באמצעות מדפסת לתקשר

הערה: הדפסה של microarrays בוצעה באמצעות מדפסת קשר. הנחיות ספציפיות בנוגע להדפסת microarray הפולימר הן כדלקמן. לקבלת הנחיות כלליות לגבי שימוש המלצות המדפסת ובטיחות, בצע את המשתמש מהיצרן. למרות שאנו משתמשים מדפסת קשר, מכשיר הטבעה ידני מתאים גם יכול לשמש.

1. בהתאם להמלצה במדריך למשתמש של המדפסת, ליצור שגרה (ראה שלב 3.3) המאפשר ההדפסה של 384 נוזלים (פתרונות הפולימר או NMP) ב quadruplicates, באמצעות ראש microarraying 32 פינים (מסודר כמו 8 שורות ו -4 עמודות).
2. דפס 1,536 נקודות מסודרות כמו 48 שורות ו -32 עמודות. לתכנת את השגרה להדפיס 12 סעיףs, כלומר., 32 פתרונות בכל פעם, כך שהמדפסת יכולה להיפסק לאחר הדפסת כל מקטע כדי לאפשר ניקוי של סיכות.
3. כדי ליצור שגרת הדפסה:
   1. פתח את התוכנה ומבין האפשרויות הזמינות לבחור 'צור שגרה חדשה'. בחר את הכרטיסייה 'תיאור' להזין פרטים של הניסוי. בחר את הכרטיסייה 'ראש' ולבחור '32 ראש microarraying -pin '.
   2. בחר את הכרטיסייה 'המקור' ובחר בעל צלחת (בעל צלחת המקור (1x5)), סוג צלחת (צלחת 384 x 6000), צלחות כוללות (1) ומקור סדר (לפי עמודות).
   3. בשנות ה עיצוב שקופית 'לכרטיסייה, בחר' 3x1 '' שקופיות 'ובחר עֲרִיכָה ידי' מספר שדה '. לאחר מכן בחר 'עֲרִיכָה דפוס'. Input 'נוף ספוט' כמו 'פריסה' ו 'ממדי תבנית' כמו 'שורת ספירה' (6), "ספירת טור '(8)," מגרש שורה' (750) ו 'מגרש טור' (560). בחר קטע אחד להדפיס עצי אשוחt.
   4. בקלט הכרטיסייה 'שקופיות פריסת מספר השקופיות המשמש להדפסה. בחר בכרטיסייה 'הדפסה' כדי להזין את הפרמטרים הדפסה (מספר חותמות לכל דיות: 1, מספר חותמות לכל נקודה: 5, הטבעה זמן: 200 msec, דיות זמן: 100 msec).
      הערה: שגרה כעת נוצר להדפסת 384 נוזלים (פתרונות הפולימר או NMP) ב quadruplicates, באמצעות ראש microarraying 32 פינים (מסודר כמו 8 שורות ו -4 עמודות). בסך הכל את השגרה צריכה להדפיס 1,536 נקודות מסודרות כמו 48 שורות ו -32 עמודות עם מגרש בשורה של 750 מיקרומטר ו מגרש טור של 560 מיקרומטר.
4. מניח את השקופיות מצופות agarose על הרציף להבטיח חותם ואקום טוב להחזיק את השקופיות בעמדה.
5. התאם את ראש ההדפסה כך שכל הפינים הם באותו הגובה. לבדוק זאת על ידי הרכנת הראש באופן ידני על לשקופית זכוכית המאשר כי הפינים לעלות בעת ובעונה אחת. אם יש אי התאמה עם הגובה, להתאים באמצעות sleevדואר על עד סיכה או למטה.
6. מניח את הצלחת היטב על בעל הצלחת בכיוון הנכון, כלומר., גם A1 היא בפינה הימנית העליונה של הבעל ולהבטיח את הצלחת היטב קבועה בחוזקה.
7. באמצעות שמאי הגובה, להבטיח כי הגובה של בעל הצלחת הוא כזה כאשר אתם בוחרים פתרונות הפולימר, הפינים לא נוגעים בתחתית הבארות.
   הערה: זוהי נקודה חשובה עבור תצפית פולימר אחידה וגם כדי למנוע הטחת פתרונות פולימר לתוך בארות סמוכות, ובכך לגרום זיהום צולב.
8. בחר את הכרטיסייה 'התחל' ובחר את 'סוג הפעלה' כמו 'רגילה'. לחץ על 'הפעלה', ולאשר כי שקופיות, גם צלחת, וכו ', נמצאים בעמדה כאשר תתבקש לעשות זאת.
9. הדפס 1 סעיף בכל פעם (32 פתרונות בכל פעם; 12 סעיפים), המאפשר ניקוי של סיכות בין הסעיפים. נקה את הסיכות ביסודיות עם מגבת נייר טבולה אצטון, ואחריו נייר טישו יבש כדי להבטיח את הסיכות יבשות לחלוטין.
10. עם השלמת הדפסה של microarrays, למקם אותם מחזיקים שקופיות ולייבש אותם לילה שלם ואקום להגדיר בתנור ב 45 ° C כדי להסיר את NMP את נקודות הפולימר. לאחר עיקור עם אור UV במשך 30 דקות, microarrays מוכן חיסון של חיידקים.
11. לפני ייחס שקופיות עם חיידקים, לקחת מדידת קרינת רקע (כמפורט בסעיף 5). השתמש מדידה זו בחישוב חיידקי מחייב.

4. הרכבה של Microarrays פולימר עם חיידקים

הערה: ודא טכניקה מזוהמת טובה. כל טיפול של תרבויות צריכה להתבצע בסביבה סטרילית: או באמצעות מבער בונזן או במנדף זרימה. תרבויות צריכות להיות מבוגרות עם זמינויות חמצן, מדיום גידול, וטמפרטורה מותאמות לדרישות של כל מין.

1. הכן תרבויות לילה על ידי יחסנו 5 מ"ל מרק לוריא- Bertani (LB: 10 גרם ל ^-1 bacto-tryptone, 5 גרם ל ^-1 NaCl, ו -10 גרם L ^{-1 תמצית שמרים) עם מושבה מצלחת. דגירה לילה בשעה 37 ° C, רועד ב 200 סל"ד.}
2. הכן מניות במקפיא של תרבויות לילה על ידי תוספת של גליצרול (הכוללת ריכוז 10%) ולאחסן את המניה ב -80 מעלות צלזיוס.
3. על מנת לקבוע את מספרי תא ממדגמים של מניות חיידקי מופשר, לבצע דילולים סידוריים של כל מניות לגדל את החיידקים לילה על תקשורת מוצקה. קביעה מדויקת של מספרים סלולריים במניות מבטיחה חיסון מתאים של כל מין ^6.
4. כן inocula עבור microarray. תרבויות מין יחידות גדלות כמו לעיל להחיל ישירות על microarrays. BacMix-1 הוא תערובת חיידקים של Klebsiella pneumoniae (ק pneumoniae), סטפילוקוקוס saprophyticus (ס saprophyticus), ו Staphylococcus aureus (S. aureus). BacMix-2 הוא תערובת חיידקים המורכב mutans סטרפטוקוקוס (mutans ס), ס aureus , ק pneumoniae ו אנטרוקוקוס faecalis (E. faecalis).
5. כדי לייצר גם תרבות מעורבת, לערבב לינות בכמויות שוות (3 מ"ל כל אחד) ו לדלל ארבע פעמים עם LB טרי (סביב 50 מ"ל נפח סופי).
6. מניח microarrays פולימר מעוקרות UV צלחות 4-היטב מלבנות דגירה אותם עם 6 מיליליטר של תרבויות חיידקים מעורבות על 37 מעלות צלזיוס עם תסיסה עדינה (30 סל"ד) במשך 5 ימים.
7. לאחר דגירה, לשטוף בעדינות את microarrays פעמיים עם בופר פוספט (PBS: 137 mM NaCl, 2.7 מ"מ KCl, 10 מ"מ Na _{2 4} HPO, 1.8 מ"מ KH ₂ PO ₄₎ ו דגירה עם תמיסה של 1 מיקרוגרם מ"ל ^-1 של 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) כתם ב- PBS למשך 30 דקות.
8. שטוף את שקופיות microarray מוכתמות בצלחת גם טריה על ידי כיסוי עם PBS מתערבלים בעדינות, שינוי PBS פעם. ניקוי תחת זרם של אוויר. החל להחליק כיסוי זכוכית לשקופית microarray חותם במקום עם דבק. ברגע דר"י, לעקר את המשטח החיצוני עם 70% (V / V) אתנול.
9. בבטחה להשליך תרבויות על פי רמת הבלימה שלהם.

5. הדמיה microarray ו ניתוח

1. צלמו תמונות אחת על כל מקום פולימר brightfield ו DAPI (Ex / Em = 358 ננומטר / 361 ננומטר) ערוצים. בצע זאת באופן ידני באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי או באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי אוטומטי (עם שלב XYZ בשליטת תוכנת רכישת תמונה) מצויד אובייקטיבי 20X.
   הערה: עיין ¹⁸ במדריך להפעלת התוכנה והתאמת מיקרוסקופ כדי להשיג תמונות באמצעות ערוצי brightfield ו DAPI. להבטיח שבפעם הרווח והחשיפה עבור לכידת תמונה עבור כל microarrays זהה.
2. השג את עוצמת הקרינה הממוצעת של כל נקודה ונקודה בערוץ DAPI על ידי בחירת אזור ספוט לכימות הקרינה עם תוכנת עיבוד תמונה.
3. עבור קרינת הרקע של כל נקודה ונקודה, obtaבתמונות של כתמי פולימר על microarray לשכפל וטופח רק עם תקשורת ללא חיידקים. לנכות את קרינת רקע מעוצמת המקום להשיג קרינה מחיידקים.
4. חישוב ערך מנורמל ממוצע מהארבע הנקודות, המייצג כל פולימר, המשמש להשוואת חיידקים המחייבים של פולימרים שונים ^6.
5. זהה את הפולימרים כי התערוכה (הנמוכה ביותר הקרינה) מחייבת בקטריאלי לפחות כמו פולימרים 'מכה' ^6.

ציפוי 6. של תלושי לכסות עבור אימות 'מכה'

1. מעיל Coverslips עם פולימרים:
   1. הכינו פתרונות של פולימרים 'מכה' (~ 2% w / v) tetrahydrofuran (THF), או ממס מתאים אחר.
   2. coverslips ספין מעייל זכוכית עגולה בגודל מתאים עם פתרונות הפולימר באמצעות coater ספין ב -2,000 סל"ד במשך 10 שניות.
      הערה: בהיעדרו של coater ספין, coverslips או חומרים אחרים עשויים להיות מצופה מטבל, למרות הספיןציפוי מייצר משטח אחיד יותר.
   3. יבש coverslips מצופה בתנור הסעה ב 40 מעלות צלזיוס למשך הלילה לעקר באמצעות אור UV למשך 30 דקות לפני חיידקים ייחסו.
2. מעיל Coverslips עם Agarose עבור בקרות שליליות:
   1. coverslips נקי או על ידי טיפול פלזמה למשך 10 דקות או טבילה 1 M NaOH עבור 4 שעות.
   2. לטבול את coverslips ב אצטוניטריל המכיל 1% (3-aminopropyl) triethoxysilane לילה. נקו את coverslips עם אצטון 3 פעמים והכניסו לתנור (100 מעלות צלזיוס) במשך שעה 1.
   3. מעייל טובל את coverslips היבש עם 1% פתרון agarose מימי שמר באמבט מים ב 60 ° C. מניח את coverslips מצופה agarose על משטח שטוח בתנאי סביבה ללא אבק למשך 24 שעות ו לעקר באמצעות אור UV למשך 30 דקות לפני חיידקים ייחסו.

7. מצורף וניתוח של סליפ כיסוי באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים סורק (SEM)

1. לאחרעיקור עם אור UV למשך 30 דקות, מניחים את מכסה מחליק (פולימר / agarose זכוכית מצופה או לא מצופה) בצלחת 12-היטב רגיל או 24 גם צלחת (תלוי בגודל של coverslips) ו דגירה עם חיידקים כמתואר בסעיף 4.
2. לאחר דגירה עם חיידקים, לשטוף את coverslips ציפוי ומצופה פעמיים עם 0.1 M חיץ cacodylate (pH 7.4) ולאחר מכן לתקן עם 2.5% (w / v) glutaraldehyde ב 0.1 M cacodylate חיץ (pH 7.4) עבור 2 שעות.
3. דגימות פוסט לתקן עם 1% (w / v) tetroxide אוסמיום עבור שעה 1 בטמפרטורת החדר מייבשים עם שטיפות אתנול ברצף של 50, 70, 90 ו -100% (v / v) במשך 30 דקות כל אחד.
4. דגימות יבשות ב- CO ₂ על פי פרוטוקולים סטנדרטיים ^19. זמן ייבוש יהיה תלוי באופי של המדגם.
5. דגימות מעיילות סגסוגת זהב / פלדיום (60/40%) באמצעות coater גמגום עם נוכחי 30 mA ואקום ב 0.75 Torr. בדוק תחת מיקרוסקופ אלקטרונים לפי פרוטוקולים סטנדרטיים ^20.
   הערה: ENSאמצעי זהירות יור בטיחות נאותה לניהול סיכונים הנובעים אחסון, טיפול וסילוק של tetroxide אוסמיום, כפי שהוא רעיל מאוד.
6. ראייה להשוות תמונות של coverslips הציפוי ואלה מצופים agarose או הפולימרים 'מכה' כדי לאשר את יכולות חייב / בהדיפת חיידקים של הפולימרים.
   הערה: ההתנגדות של קובץ מצורף צריכה להיות גלויה בקלות כהקטנת תאים הנמצאים.
7. בחר את המבטיחים ביותר 'מכה' פולימרים בלתי מחייבים עבור מחקרי ציפוי עם מכשירים רפואיים (כגון, צנתרי ורידי מרכזי) ^6.

בחירת 8. של מרכך עבור קטטרים ציפוי

1. להעריך ממסים שונים עבור התאימות שלהם עם חלק שכינת קטטר, כמו גם יכולתי לפזר הפולימר 'מכה'. חותכים חלקים של קת 'ו -1 לחתיכות גלילי 5 מ"מ אורך, ולמדוד עם calliper Vernier דיגיטלי.
2. להעריך ממיסים שונים כגון acetic חומצה, אמוניה, אצטון, אצטוניטריל, diethyl האתר, tetrahydrofuran (THF), dimethylformamide (DMF), N -methyl-2-pyrrolidone (NMP), אתנול, מתנול, אתילן גליקול, טולואן קסילן. לטבול חתיכות הקטטר ממס למשך 12 שעות ולהעריך חזותי עבור שלמות קטטר והבהירות של ממס.
   הערה: בחר ממס שאינו לגרום צנתרים להתנפח או להתפורר או לגרום ממס עכור. הממס חייב לפזר את הפולימרים 'מכה'.

9. ניתוח של קובץ מצורף חיידקים על קטטרים ידי מיקרוסקופי Confocal

1. הכן 2.5% (w / v) פתרונות פולימר אצטון, או ממס מתאימה אחרת כפי שנקבע בסעיף 8. חתיכות קטטר מ"מ מקום 5 לתוך צלוחיות זכוכית קטנות (5 מ"ל) ו לטבול אותם 1 מ"ל של פתרון פולימר עבור 2 דקות . הסר את פתרון הפולימר העודף ולייבש את החתיכות קטטר לילה בתנור ואקום ב 40 מעלות צלזיוס.
2. כן בידוד על ידי ערבוב מופשר חיידקי stocks לתת כ 10 ⁶ תאים של כל מין ב 50 מ"ל LB ^6.
3. לעקר חתיכות קטטר ובלי ציפויים עם אור UV למשך 30 דקות ו דגירה עם 1 מ"ל מחוסן LB בצלחת 24-טוב, ב 37 מעלות צלזיוס במשך 3 ימים, עם תסיסה עדינה ^6.
4. לאחר דגירה, לשטוף את צנתרים עם PBS (2x, 2 מ"ל), לתקן את החיידקים עם paraformaldehyde 10% ב PBS למשך 30 דקות, לשטוף עם PBS (1 מ"ל). הכתם חיידקים על פיסות קטטר עם DAPI (1 מ"ל מיקרוגרם ^{- 1)} במשך 20 דקות ולשטוף עם PBS (1 מ"ל).
5. להשיג תמונות confocal של חתיכות קטטר באמצעות ההגדרות הבאות: לייזר דיודה כחול 405nm, מגוון גלאי 414 כדי 502 ננומטר, חור סיכה - Airy1, גודל התמונה - 1,024 × 1,024 פיקסלים, רוחב voxel - 105.2 nm, ערימות-Z ריווח 0.5μ מ הגדלה, - 40X 1.25.
6. השלם את הדמית confocal ידי הערמה-Z 50 תמונות על פני 100 אורך מיקרומטר של הקטטר.
7. לנתח את התמונות באמצעות suitable תוכנת ניתוח: לשטח את התמונות מוערמים Z במישור Z, באמצעות הפונקציה להאריך עומק השדה, כדי ליצור תמונה אחת של יצירה קטטר.
   הערה: תמונה זו אמורה להיות מנותחת כדי להשיג באזור של הקטטר מכוסה על ידי חיידקים, לאחר תיקון רקע באמצעות 'לשטח רקע' הפונקציה.

ניתוח 10. של Attachment בקטריאלי על קטטרים ידי SEM

1. כן 10% פתרון פולימר (w / v) אצטון.
2. קש על קצה פיפטה (עבור 200 μl micropipette) אל החלק באמצע של יצירת החתך של קטטר להחזיק אותו וטובל את יצירת פתרון הפולימר עבור כ -30 שניות. ייבש את חתיכת מצופה בתנאי סביבה למשך 30 דקות. למרוח ציפוי שני על ידי טבילה שוב לתוך תמיסת פולימר הלילה יבש בתנאי סביבה.
3. לאחר טיפול UV ו הדגירה עם חיידקים לשטוף את חתיכות (n = 3) עם PBS (2x, 1 מ"ל) ולהעביר אותם לתוך צלחות 48-היטב המכיל 10% פורמלדהיד ב PBS למשך 30 דקות. לאחר תיקון, לשטוף את חתיכות עם PBS (1 מ"ל), לילה יבש בטמפרטורת החדר, הר של הספחים עם דיסקים פחמן מוליך, ומעיל זהב באמצעות coater גמגום (ראה שלב 7.5).
4. להשיג תמונות באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים סורק ^6.

תוצאות

איור 2 מציג מצורף חיידקים (עוצמת קרינה מנורמלת) למספר הפולימרים כפי שנקבע על ידי ניתוח microarray. הכתמים המודפסים ללא פולימר (NMP בלבד) הביקורת השלילית, כמו agarose מאוד מתנגד חיידקי מחייב ⁶ - קרינת רשם היא נמוכה מאוד. הפולימרים המוצגים הם כל נמוכים מחייבים למרות שברוב המקרים, המאפיינים הדוחים של פולימר משתנים באופן משמעותי בין סוגי חיידקים שנבדקו. זה משקף את ההבדלים הרחבים בין מנגנוני התקשרות בין זנים שונים. הבחירה של פולימר מתאים לכן תלוי ביישום, אבל הפולימרים הנמוכים מחייב מזוהים בקלות על ידי השוואה עם agarose. ביצועים מחייבים פולימרים צפויים להיות מזוהה מערך, והוא יכול לשמש בקרות חיוביות לניסויים באים. עבור פולימרים שאינו להראות קרינה אוטומטית בערוץ DAPI, שיתוף איכותיmparison של תמונות הנקודה יכול להתבצע בצורה ויזואלית (כפי שמוצג באיור 3, הדגשת פולימר אחד נציג גבוה מחייב ודוגמא שלוש פולימרים נמוכים מחייבים). השוואה כזו, תוך מתן מידע פחות מאשר הניתוח הסטטיסטי, יכולה להיות אימות ויזואלי שימושית של ערכי העצמה חושב.

עם 22 פולימרים מתאימים, המזוהה באמצעות microarray, ניסויים בקנה מידה-אפ נעשים כדי לאשר נכס חיידקים הדוחה שלהם בעת שימוש לציפוי משטחים גדולים. המוצגים הם הדוגמאות בעלות הביצועים הטובים ביותר, נהג מכסה זכוכית תלושי מעיל (ונותחו על ידי SEM (איורים 4 ו -5)) ופרוסות קטטר (ונותחו על ידי מיקרוסקופיה confocal (איור 6) ו SEM (איור 7)). שני שיטות מיקרוסקופיות יש את היתרון של מה שמאפשר ספירת תאי ישירה על פני השטח, מתן נתונים חד משמעיים; צמצום מצורף תא הוא בקלות visiblדואר. ציפויים אלו אשר טובים ביותר שומרים על תכונותיהם הדוחות שלהם על-אפ בקנה המידה, כמו גם להיות מקובל טכניקות ציפוי בקנה מידה גדולה, נחקרו עוד. התוצאות הראו להמחיש את פולימרים בעלות הביצועים הטובים ביותר של כל שלב.

איור 1:. השלבים הכרוכים בזיהוי של פולימרים דוחה חיידקים באמצעות microarrays פולימר עבור יישומים ביו SEM = במיקרוסקופ אלקטרונים סורק.

איור 2:. בקטריאלי מחייב על שורה של פולימרים, שנקבעה על ידי ניתוח microarray נמוך חיידקי מחייב נתפס על מספר polyacrylates / אקרילאמיד (PA) פוליאוריתן (פו). תוצאות מ microarrays פולימר ומישש עם מספר של חיידקים pecies (ג jejuni, C. difficile, perfringens ג, mutans ס, ושני קונסורציומים; BacMix-1 ו BacMix-2) מוצגים. חיידקי כריכת מבוטא רקע התיקן הממוצע DAPI קרינה בעצמה (מנורמלת). ברי שגיאה מייצגים סטיית התקן. מעובד מתוך התייחסות ^6. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 3:. תמונות דוגמא של כתמי פולימר קרינה (DAPI) ו מיקרוסקופיה brightfield תמונות של BacMix-2 מראה מצורף חיידקים על פולימרי נציג. פולימר בתוקף מחייב נכלל להשוואה לכמה פולימרים בלתי מחייב (PU-20, PA-336 ו PU-179). סרגל קנה מידה = 100 מיקרומטר. מעובד מתוך התייחסות ^6.: //www.jove.com/files/ftp_upload/54382/54382fig3large.jpg "Target =" _ blank "> לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 4: ניסויים למעלה סולם עם מכסה זכוכית תלוש תמונות SEM מראים מצורף חיידקים על זכוכית ציפוי זכוכית מצופית פולימרים 'מכה' (דוגמאות שנבחרו מתוך טבלת 1).. ברי סולם = 20 מיקרומטר.

איור 5:. בקטריאלי כריכת לכמת ידי ספירת תאים מתמונות SEM השוואת התאים המצורפים ליחידת שטח של משטחים מצופים עם הפולימרים 'מכה' הטובים ביותר. Agarose שימש כמשטח 'מחייב הלא השליטה, עם זכוכית כמשטח מחייב שליטה. ברי שגיאה מייצגיםסטיית תקן.

איור 6: השוואה בין חיידקים מחייבים על פרוסות קטטר ובלי ציפויי תמונות Confocal השוואת קטטר מטופל (קת-1) (א) ו קטטר מצופה PA13 (B) לאחר דגירה עם BacMix-2.. תמונות שצולמו עם מטרה 40X (סרגל קנה מידה = 20 מיקרומטר). מעובד מתוך התייחסות ^6.

איור 7:. השוואה בין חיידקים מחייבים על פרוסות קטטר ובלי ציפויי SEM תמונות להראות השוואה של קטטר מטופל (קת-1) (א) ו קטטר מצופה PA13 (B) לאחר דגירה עם קוקטייל חיידקי מורכב BacMix-2 סולם. ברים = 101; מ '. מעובד מתוך התייחסות ^6.

פּוֹלִימֵר	מונומר 1	מונומר 2	מונומר 3	יחס של מונומרים
PA465	MEMA	DEAEMA	HEA	8	1	1
PA475	MEMA	DEAEA	המה	6	1	3
PA513	MEMA	DEAEMA	MMA	8	1	1
PA515	MEMA	DEAEA	MMA	6	1	3
PA13	DMAA	-	9	1	-
PU1	PEG2000	HDI	-	4.9	5.2	-
PU16	PEG2000	MDI	-	4.9	5.2	-
PU161	PEG2000	MDI	BD	2.5	5.2	2.3
PU7	PEG900	Bich	-	4.9	5.2	-
PU83	PEG900	HMDI	BD	2.5	5.2	2.3
PU227	PPG-PEG-1900	HDI	-	4.9	5.2	-
PU129	PPG425	Bich	DMAPD	2.5	5.2	2.3
PU10	PTMG2000	Bich	-	4.9	5.2	-
PU179	PTMG2000	HDI	NMAPD	2.5	5.2	2.3
PU20	PTMG2000	MDI	-	4.9	5.2	-
PU5	PTMG2000	HDI	-	4.9	5.2	-

טבלה 1: הרכב של חיידקים בלתי מחייב "מכה" פולימרים באיור 2.

דיון

קובץ מצורף של חיידקים על משטח הוא תהליך מורכב נקבע על ידי מגוון רחב של גורמים תלויים המינים של חיידקים, את המאפיינים של פני השטח, סביב המדיום ואת הסביבה הפיסית. למרות קבוצות כימיות מסוימות ידועות בהשפעתם חיידקי מחייב (polyglycols, למשל, בדרך כלל להתנגד מצורף ^11), שיוך ההשפעה הביולוגית של פולימרים עם המבנים הכימיים שלהם קשה, מה שהופך תכנון רציונלים של פולימרים עבור פונקציות ספציפיות מאתגרות. בהעדר מנגנונים מצורפים מפורטים, מחקרים אחרים ניסו לחקות משטחים דוחים טבעית המתחוללים, עם אופטימיזציה ממושך ונרחב מעבד ^21. שיטת התפוקה גבוהה מיניאטורי שהוצגה כאן מתגברת על אתגרים אלה על ידי הקלת הקרנה מקבילה של מאה פולימרים לזהות מובילים למחקר נוסף.

תוצאות משיטת microarray לשרת בעיקר IDEntify המועמדים להוביל סביר. איור 2 מדגים 22 מועמדים עם נמוך מחייב של לפחות מין אחד, בעוד איור 3 מדגים את צמצום ברור מחייב יכולת. כל 22 הפולימרים הנמוכים מחייב שמוצגים באיור 2 נלקחו קדימה לתוך ניסויים מדרוגים כלפי מעלה, שבמהלכה את הטוב ביותר (מבחינת תכונות repellence וציפוי) נקבעו PU83, PA13, ו PA515 (איורים 4 ו -5). Polyacrylates מציע גמישות רבה יותר מבחינת שיטות פילמור ולכן polyacrylate הנמוך מחייב, PA13, נבחר ללימודי ציפוי קטטר (איורים 6 ו -7). עוד מפורטת עבודה נוספת על מועמדים אחרים בוצעה דווחה במקום אחר ^6.

דרך מספר חזרות ניסיוני מצאנו מספר צעדים קלים היו מפתח להצלחה ואת השחזור. כמו גם להקל על ההידבקות שלפולימרים כדי שקופיות הזכוכית, באמצעות agarose תחת ציפוי מספק רקע נקי, כמו agarose הוא עמיד מאוד קולוניזציה חיידקית. כמו כן עקבי בפולימר כתם עצמם, הם בתוך אותו המערך בין מערכים, הוא חיוני ולכן בהדפסת המערכים חייבת להיות מבוקרת בקפידה. התאמה קפדנית של הפינים שבתוך-ראש ההדפסה וגם המילוי אחיד של הצלחת 384 גם נדרשת על מנת להבטיח תצפית אחידה. כפי שחלקכם של הפולימרים השתמשנו הציגה מידת autofluorescence, לקיחת נתוני קרינת רקע לכל שקופית לפני הדגירה עם חיידקים הייתה חיונית. כדי להסביר וריאציות להשיג משכפל נתונים חזקים של microarrays מומלץ.

הכתם מועסק כאן (DAPI) אין סלקטיביות עבור מינים של חיידקים, מחייב הלא ספציפית ל- DNA. לכן, טכניקה מזוהמת טובה חיונית פעם תרביות חיידקים הם הציגו כמזהמים עלולים נעלמו מעיניו, מבלבלות את interpretation של תוצאות. אותו הדבר נכון של ניסויים מאוחר באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים סורק, ושזה רק ניתן להבחין מוטות Cocci אבל לא הסוג או המין.

לאחר סינון microarray, צריכים להיבחר פולימרים מבטיחים לתיקוף נוסף. בדוגמא המוצגת כאן, שבעה פולימרי עניין זוהו על ידי הירידה הברורה שלהם הקרינו על microarray והעיכוב של זיקתם אושר על ידי ציפוי אותם על שטחים גדולים יותר. איורי 4 ו -5 להראות הפחתת כריכת מושגת על coverslips זכוכית, אמצעים מעשיים כדי לבחון את התנהגותו של פולימרים ציפויים בתפזורת ולא כמו כתמים microarray. בהמשך לכך, פולימרים אלו צפים על מכשירים רפואיים לכמת הפחתה מלאה מצורף חיידקים. חשוב כי הממס נבחר (ראה פרוטוקול סעיף 8) ללימודי ציפוי אלה הוא שפיר למצע הרצוי (כאן, קטטר) תוך לשמרing יכולת לפזר את הפולימר של עניין, על מנת לאפשר ציפוי. הנה, השתמשנו אצטון אשר, כמו גם את המאפיינים שהוזכרו, יש נקודת רתיחה נמוכה מתאדה במהירות להשאיר ציפוי אחיד.

אמצעי אימות נבחר יהיה תלוי ביישום הספציפי הנלמד. כפי תצפית של תאים על ידי מיקרוסקופי אלקטרוני קרינה מאפשרת כימות ישירה של קובץ מצורף תא יחיד, בחרנו טכניקות אלה כהשלמה אל assay microarray מכתים בתפזורת. תוצאות מוצגים איורים 6 ו -7, שיש בהם כדי להעיד על החשיבות של שיטות אימות חינם. תמונות confocal באיור 6 לספק תמונות ברורות מאוד של תאים בודדים, בעוד SEM יש ערך המוסף של מאפשר הערכה של פני השטח של הפולימר, אשר הוא כאן חלק ואחידה. שיטות אלו מוגבלים על ידי שדה הראייה של מיקרוסקופים בשימוש, ולכן הוא importaNT לנקוט בשורה של תמונות כדי להיות בטוח בתוצאות. השיטה המתוארת לעיל לא יכול לכמת דבקות בקטריאלי על פני כל השטח, רק להסיק כיסוי ממספר אזורים קטנים. אנו מאמינים כי זה די בבקשה מתואר. צמצום בקטריאלי מחייב יכול להיות מוערך על ידי ספירת חיידקים דבק משטח על חתיכות קטטר כולו ובלי ציפויים בשיטות כמתואר במקום אחר ^22. עם זאת שיטות כאלה דורשים המשטחים הביולוגיים הוקרנו יש שטח פנים אחיד, אשר קשה לשמור כאשר מבחנים מבוצעים עם מכשירים רפואיים, אשר לעתים קרובות יש גיאומטריה מורכבת.

ברור, כל תקן המיועד לשימוש קליני חייב לעבור בדיקות נוספות משמעותיות על מנת להבטיח בטיחות ויעילות בבני אדם. השיטה המוצגת כאן מייצגת את תחילת תהליך עבודה ובהמשך זה חייב לכלול אישור של פעילות in vivo. במקרה זה, לומד ג ורידיםatheters, עבודה ראשונית יכולה לחקור את הכריכה של מרכיבי דם ותאיים כולו הפולימר. השפעת מרכיבי דם על חיידקי מחייב צריך להיות גם נחשבת, ככל הנראה על ידי חזרה על המבחנים מחייבים בנוכחות סרום מומת או דה-fibrinated דם ^23. המבחן האולטימטיבי של אותו הטכנולוגיה יהיה במודל in vivo כגון מודל זיהום תת עורי שתל ^24.

אנו מדגימים את הפוטנציאל של שיטת microarray הפולימר להקרנה של פולימרי משטח-שינוי. פולימרים שכאלה (הן ההתנגדות וקידום חיידקי מחייב) יש מספר רב של יישומים ברפואה, בתעשיית המזון והביוטכנולוגיה, כלומר שיטה זו עשויה להיות שימושי בתחומים רבים של מחקר. למרות העבודה כאן משתמשת חיידקים, השיטה יכולה להיות מותאמת סוגי תאים אחרים וכמובן microarrays כימי אחר.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
אגרוז	סיגמא	05066
שקופיות הכנה לסילאן	סיגמא	S4651
פולימרים	מסונתזים בבית	לא ישים
NMP	סיגמא	494496
LB מרק	אוקסואיד	CM1018
DAPI	תרמו פישר	D1306
טטרהידרופוראן	סיגמא	401757
(3- אמינופרופיל) שקופיות זכוכית מצופות טריאתוקסיסילאן	סיגמא	סילאן-פרפ
קקודילאט	מאגר סיגמא	97068
קטטר 1	חץ בינלאומי
קטטר 2	בקסטר הלת'קר	ECS1320
אוסמיום טטרוקסיד	סיגמא	201030
<חזק>ציוד
מדפסת מגע	Genetix	Qarraymini
מיקרוסקופ מיקרו-מערך	IMSTAR	Pathfinder
ספין ציפוי	Speedline טכנולוגיות	6708D
מיקרוסקופ קונפוקלי	Leica	SP5
תוכנת ניתוח תמונה	מדיה קיברנטיקה	Image-Pro Plus
מיקרוסקופ אלקטרונים סורק	פיליפס	XL30CP
ציפוי מקרטע	Bal-Tec	SCD050