שרשרת פולימראז משופר אורך קטע התגובה הגבלת Genotyping פולימורפיזם של נפוחיתיים רעילים ידי נוזלי כרומטוגרפיה / ספקטרומטריית מסה

סיכום

שרשרת פולימראז משופר שיטת פולימורפיזם תגובת הגבלה שבר אורך עבור genotyping מיני נפוחיתיים ידי ספקטרומטריית נוזלי כרומטוגרפיה / מסה מתוארת. טור מונולית סיליקה הפוכה פאזיים מועסק להפרדת amplicons מתעכל. שיטה זו יכולה להבהיר את המוני monoisotopic של oligonucleotides, אשר הוא כלי שימושי לזיהוי רכב בסיס.

תקציר

גרסה משופרת של תגובת שרשרת פולימראז (PCR) -restriction פולימורפיזם אורך קטע (RFLP) שיטה genotyping מינים נפוחיתיים רעילים ידי / כרומטוגרפיה נוזלית יינון electrospray ספקטרומטריית מסה (LC / ESI-MS) מתואר. מיצוי DNA מתבצע באמצעות סיליקה קרום מבוססת ערכת חילוץ DNA. לאחר הגברת PCR באמצעות חיץ PCR חומר ניקוי ללא, אנזימי הגבלה מתווספים הפתרון ללא טיהור פתרון התגובה. טור הפוך פאזיים סיליקה מונולית ו התמרת ספקטרומטר מסה ברזולוציה גבוהה שיש מנתח מלכודת קינגדון שונה מועסקים להפרדה וזיהוי, בהתאמה. השלב הנייד, מורכב 400 מ"מ 1,1,1,3,3,3-hexafluoro-2-propanol, 15 המ"מ triethylamine (pH 7.9), מתנול, מועבר בקצב זרימה של 0.4 mL / min. זמן המחזור לניתוח LC / ESI-MS הוא 8 דקות כולל איזון של הטור. תוכנת Deconvolution שיש o מודל הפצת איזוטופ.ו oligonucleotide משמש לחישוב מסת monoisotopic התואמים מתוך הספקטרום ההמוני. באשר לניתוח oligonucleotides (טווח 26-79 נוקלאוטידים), דיוק המונית היה 0.62 ± 0.74 ppm (n = 280) ודיוק מעולה ודיוק נגרמו עבור 180 שעות ללא שימוש בסטנדרט המוני המנעול.

מבוא

ספקטרומטריית מסה (MS) היא טכנולוגיה המקובלת לזיהוי מהיר ואמין של חומצות גרעין, / desorption לייזר בסיוע מטריקס יינון (MALDI) ו יינון electrospray (ESI) בשימוש עבור יינון ^1,2. טכניקת MALDI בדרך כלל בשילוב עם זמן של טיסת מנתח (TOF); עם זאת, היישום של MALDI-TOF MS מוגבל oligonucleotides קצר (~ 25 נוקלאוטידים (NT)) בשל פיצול עוקב היווצרות adduct ו יינון נמוך היעיל ^1,2. לעומת זאת, ESI ישימה oligonucleotides יותר (> 100 NT), אך מדינות תשלום רבות מרובה טעונות יונים ([M-NH] ^n-) מופקים בו זמנית Biomacromolecules, ולכן המסה של אנליטי יכולה לחרוג העליונה קצה טווח m / z של ספקטרומטר. זה מחייב את הפרשנות של הספקטרום המפותל, כלומר, הטרנספורמציה של סדרת מדינה לגבות לתוך המונית המקבילבאמצעות deconvolution.

במקרה של מדידת מסה של מולקולה קטנה, השיא של מסת monoisotopic, כלומר, המסה של המולקולה המכילה רק האיזוטופ הנפוץ ביותר של כל אלמנט הוא הנפוץ ביותר וצופה ³ טבעי. ככל שעולה משקל המולקולרי, משמרות חלוקת איזוטופי כדי גבוהה מ '/ z ופסגת monoisotopic הופכת מוסתרות על ידי רעש בסיס ^3-5. ברגע שיא monoisotopic כבר לא ניתן לגילוי עבור המונים יותר מ -10 kDa ^3, המסה המולקולרית הממוצע משמשת למדידה ולא מסת monoisotopic ^5. במקרים כאלה, חלוקת איזוטופי שבו כל אחד הפסגות הפרט מופרד על ידי 1 Da ניתן לקיים רק כאשר מסת Analyzer ברזולוציה גבוהה כגון TOF, התמרת מנתח מלכודת קינגדון שונה ^6, או התמרת תהודה הציקלוטרון יון מנתח משמש לניתוח. עם זאת, השיא הנפוץ ביותר הוא שלהראשון לפעמים לא עולה בקנה אחד עם המסה המולקולרית הממוצעת ^5. בעיות אלה יכולים לגרום למצוקה עבור analytes לקביעה מדויקת.

בהתחשב וריאצית השפע הטבעי של איזוטופים יציבים הקשיים בקביעת המסה המולקולרית הממוצעת, מדידת מסת monoisotopic היא אידיאלית עבור אפיון המוני של ביומולקולות ^3,4. בפועל, אם לשיא monoisotopic ניתן לצפות או לא, מסת monoisotopic יכולה להיות מוערכת על ידי השוואת הדפוס של חלוקת איזוטופי ציינה לזו התיאורטית מחושבת מתוך אנליטי מודל ^4,7-10. האלגוריתם ההולם ⁸ מאוגדת החברה לתחום תוכנת קניינית.

בהקשר של ESI-MS, דיסוציאציה של דופלקס DNA, טיהור desalting נדרשים עבור מדידה ישירה להימנע כישלון יינון עקב היווצרות דיכוי יון adduct ^2,10-14. נהלים אלה הם troublesome, לעומת זאת, מערכות אנליטיות אוטומטיות לחלוטין פותחו מסחריות מעורבות תגובת שרשרת פולימראז (PCR), הכנת מדגם ESI-MS לצורך זיהוי של פתוגנים ^15-20. גישה נוספת היא מציגה כרומטוגרפיה נוזלית (LC) להפרדה. LC מספק הפרדת on-line של analytes מחומרים המתקיימות זו בצד זו אינו דורש הכנת מדגם מייגעת לפני יינון ^21,22. עם זאת, הפרדה של חומצות גרעין באמצעות שלב נייד MS-תואם הוא קשה יותר מאשר רוב תרכובות אחרות כגון תרופות, פפטידים וחלבונים בשל כך גם polyanionic של נוקלאוטידים. הדוגמאות המוצלחות ביותר של LC / ESI-MS כרוכות בשימוש-זוג יונים הפוכה שלב LC. שלב הנייד של 1,1,1,3,3,3-hexafluoro-2-propanol (HFIP) -triethylamine (TEA) -methanol בתחילה הוצע על ידי Apffel et al. להפרדת ואיתור oligonucleotides קצר ^23. יישום של LC / ESI-MS genotyping עבור differentiation של מיני הפתוגן, פולימורפיזם נוקלאוטיד יחיד ו חוזר טנדם קצר דווח באמצעות טור הפולימר-מונולית נימים שיכולים להפריד עוד oligonucleotides ^1,21,24-33.

ביפן ובארצות הברית, הרעלת מזון רצינית התרחשה עקב זיהוי שגוי והכנת הולם של נפוחיתיים, וזאת למרות העובדה כי החלוקה והכנת נפוחיתיים נשלטות בקפידה על ידי חקיקת בטיחות מזון ^34,35. יתר על כן, רצח בכוונה תחילה באמצעות תמצית נפוחיתיים התרחש ביפן ^36. לכן, בידול של מינים נפוחיתיים נדרש משני בריאות הציבור ועמדותיו חקירה משפטית. בנוסף, בגלל rubripes Takifugu הוא הרבה יותר יקר מאשר סוגים אחרים של נפוחיתיים, יכולת הבחנה גם יש צורך בהקשר של חקירות הונאה מזון.

כאן, שיטה מפורטת לקביעה מהמוני onoisotopic של מוצר ה- PCR על ידי LC / ESI-MS באמצעות טור סיליקה מונולית הפוכה-פאזה ספקטרומטר מסה ברזולוציה גבוהה מתואר. באופן ספציפי, הגישה פותחה על מנת לאפשר בידול של מינים נפוחיתיים רעילים המבוססים על השימוש של פולימורפיזם אורך קטע הגבלת PCR (RFLP) השיטה ^37, המהווה את הדוגמא הראשונה לבידול מינים של בעלי חיים באמצעות MS.

פרוטוקול

1. DNA הפקה

הערה: השתמש בחדר נפרד לבדיקות מיצוי DNA ופוסט PCR כגון ג'ל אלקטרופורזה ו LC / ESI-MS. הוספת אתנול לשטוף חיץ 1 (המכיל hydrochloride guanidine) לשטוף חיץ 2 (שאינה מכילה hydrochloride guanidine) על פי פרוטוקול ערכת חילוץ DNA. דגימות דגים התקבלו מסיטונאי דגים בשווקים הקמעונאי ביפן.

1. מניחים 30-50 מ"ג של רקמות דג בתוך שפופרת 0.5 מ"ל או 1.5 מ"ל microcentrifuge. למחוץ את הרקמה באמצעות מיקרו-מרית (למעט סנפיר ועור).
   הערה: במקרה של סנפיר, השתמש צינור 0.5 מ"ל להשריית.
2. להוסיף 180 μl של חיץ תמוגה 40 μl של proteinase K ו מערבולת בקצרה. לדגור על 56 מעלות צלזיוס על דוד בלוק עבור שעה 2 או לילה. מערבבים על ידי vortexing כל 15 דקות בקצרה במהלך הדגירה.
   הערה: תמוגה השלמה אינה הכרחית.
3. צנטריפוגה במשך 5 דקות ב g 13,000 x. לאחר צנטריפוגה, אם amo קטןunt נפט מקיים על פני השטח במקרה של מדגם שומן כגון כבד, ושומר אותו. העברת supernatant לצינור 1.5 מ"ל microcentrifuge חדש.
4. הוסף 200 μl של למאגר chaotropic המכיל hydrochloride guanidine ומערבבים ידי vortexing. הוסף 200 μl של אתנול (99.5%) ומערבבים ידי vortexing שוב.
5. מעבירים את התערובת לתוך הטור ספין להציב צינור איסוף 2 מ"ל. צנטריפוגה 1 דקות ב g 13,000 x. מחק את הזרימה דרך.
   זהירות: אל תוסיף אקונומיקה לכמות הפסולת כי guanidine יכול ליצור תרכובות תגובתי עם אקונומיקה.
6. הוסף 500 μl של חיץ לשטוף 1 (המכיל hydrochloride guanidine) ו צנטריפוגות דקות 1 ב g 13,000 x. מחק את הזרימה דרך צינור האיסוף.
7. מניח את טור ספין צינור איסוף חדש 2 מיליליטר מצורף לערכה. הוסף 500 μl של חיץ לשטוף 2 ו צנטריפוגות במשך 3 דקות ב g 20,000 x. מחק את הזרימה דרך צינור האיסוף. מעבירים את הטור ספין כדי חדש1.5 מ"ל צינור microcentrifuge.
8. Pipet 200 μl של חיץ elution למרכז הממברנה טור ספין. לאחר 1 דקות, צנטריפוגה דקות 1 ב -6,000 x ז.
9. Pipet 50 μl של eluate קובט UV פנוי ולמדוד את ספקטרום UV של eluate ב 220-300 ננומטר את הספיגה ב 260 ננומטר באמצעות ספקטרופוטומטר.
10. בדוק את ספקטרום UV של DNA עם השיא ב 260 ננומטר. חשב את ריכוז ה- DNA המשוער באמצעות משוואה פשוטה "ריכוז ה- DNA (ng / μl) = ספיגת ב 260 ננומטר x 50".
    הערה: ריכוז ה- DNA טיפוסי שחולצו מן סנפירי נפוחיתיים הוא 63 ± 30 ng / μl (n = 20).
11. אם ריכוז ה- DNA הוא גבוה מ -10 ng / μl, לדלל את דגימות ה- DNA עם טריס-EDTA (TE) חיץ (pH 8) עד 5 ng / μl.
12. חנות המדגם ב -20 ° C או להמשיך הגברת PCR (סעיף 2).

2. PCR

1. הגדר 25 μl PCR לכל extrDNA פעל מדגם, בקרה חיובית (0.2 מיקרומטר מסונתז oligonucleotide שיש רצף היעד ב pH TE חיץ 8.0) ובקרה שלילית (מי ultrapurified במקום דגימת DNA) על קרח לפי לוחות 1 ו -2 על ספסל נקי כדי למנוע זיהום.
   הערה: הפעלה קלה, להפוך כמות מספקת של קוקטייל המכיל את כל חומרים כימיים ללא תבנית ה- DNA ומוציאים אותו. השתמש פעילות הגהה שיש DNA פולימרז להימנע תוספת של 3 'A המסוכך על המוצר PCR.
2. לבצע הגברה PCR על Cycler תרמית באמצעות תוכנית מחזור שניתן לראות בטבלה 3.

3. עיכול אנזימתי

1. הוסף 2 μl של פתרון המכיל 100 מ"מ טריס- HCl (pH 7.5), 100 מ"מ MgCl _2, 10 מ"מ dithiothreitol ו -500 מ"מ NaCl לפתרון PCR.
2. הוסף 1 μl של כל אנזים הגבלה (Dra אני Msp I) ומערבבים בעדינות. דגירה במשך 30 דקות ב 37 מעלות צלזיוס על הCycler ermal.
3. דגירה במשך 5 דקות ב 72 ° C כדי להפעיל את ה- DNA פולימראז הנותרים, אשר ממלא את הקצה הדביק שנוצר על ידי Msp I.
4. אופציונלי: לנתח כל 2.5 μl של פתרון התגובה על ידי ג'ל אלקטרופורזה polyacrylamide באמצעות יחס הקשר צלב (% C, אחוז bisacrylamide) של 3.33 (% wt) וכן ריכוז ג'ל polyacrylamide (% T) של 15 (% w / v) ^38. הכתם ג'ל באמצעות כתם DNA פלורסנט ולבחון DNA פעמיים גדיל על transilluminator האור הכחול באמצעות מסך ענבר.
5. סנן פתרון התגובה עם מכשיר מסנן צנטריפוגלי 0.2-0.5 מיקרומטר כדי למנוע סתימה, אשר יפגע בעמודת אנליטי.
6. מעביר את תסנין בקבוקון ולאחסן פוליפרופילן מחודד ב -20 ° C עד ניתוח.

4. LC / ESI-MS Analysis

1. לשקול 67.2 גרם (בערך 42 מ"ל) של HFIP ו 1.52 גרם (בערך 2.0 מ"ל) תה בבקבוק L 1. להוסיף 955 מ"ל מים ultrapurified (LC / MS גראדה) ומערבבים בעזרת בוחש מגנטי עד ריאגנטים מתמוססים לחלוטין. קח aliquot של הפתרון ולבדוק את רמת החומציות (בין 7.85 לבין 7.95; מומלץ pH = 7.9) באמצעות מד pH.
   הערה: אל תשלח את aliquot אל הבקבוק כדי למנוע זיהום על ידי יוני מתכת. אם ה- pH הוא לא 7.9, להוסיף כמות קטנה של כל אחד HFIP או תה כדי להתאים את ה- pH ולמדוד את pH שוב.
2. חבר את הבקבוק מרפדים של כרומטוגרף נוזלי עם קירור של הבקבוק באמצעות מקרר נייד קירור ישיר (לשימוש ביתי) כדי למנוע אידוי. חבר עוד בקבוק מלא מתנול קו B.
3. חבר את העמודה השומר והטור אנליטי (2.0 x 50 מ"מ, = גודל mesopore 30 ננומטר) אל כרומטוגרף נוזלי. להתחיל לזרום בשלב הנייד הראשוני (א 95% ו -5% ב) כדי לאזן את העמודות.
4. הכן 0.5 מ"ג / מ"ל נתרן trifluoroacetate (pH 3.5) בתור calibrant ^39.
   1. לשקול 50 מ"ג (בערך 34 μl) של ac trifluoroaceticid בכוס.
   2. הוסף 30 מ"ל מים ultrapurified ו לכיל ל -3.5 pH עם נתרן הידרוקסידי 10 מ"מ בעזרת מד pH.
   3. מלאו עד 50 מ"ל עם מים ultrapurified. הוסף 50 מ"ל של אצטוניטריל (LC / MS כיתה) ומערבבים.
   4. קח חלק מן הפתרון עובד ולאחסן אותו בטמפרטורת החדר. אחסן את שאר הפתרון על 4 מעלות צלזיוס.
5. הפחתת לחץ החנקן של מלכודת C כדלקמן.
   הערה: פורייה אחרונה להפוך ספקטרומטרים המוני, אשר מתאים לניתוח חלבונים שלם, יש תוכנות שליטה לשליטה בלחץ.
   1. הסר את המכסה העליון השמאלי של ספקטרומטר מסה. שסתום C-המלכודת הוא בפינה בחזית השמאל.
   2. בדוק ערך לחץ ואקום גבוה בחלון מצב כלי של תוכנות שליטה.
      הערה: הערך הוא בדרך כלל, 3 x 10 ^-8 בר.
   3. משוך את הידית כדי לפתוח ולהפוך את כיוון שעון הידית לאט מאוד כדי להפחית את עיתונות ואקום הגבוההיור כדי 1/3 (בדרך כלל, 1 x 10 ^-8 בר). הלחץ המצוין צריך לשנות בהדרגה באופן מתעכב. להתעלם מהודעת האזהרה על לחץ נמוך. דחוף את הידית כדי לנעול.
   4. שחזר את המכסה העליון עבור בטיחות.
6. כייל את ספקטרומטר מסה באמצעות נתרן trifluoroacetate ^39.
   הערה: כיול מסה יומי יכול להיות מוחלף על ידי פרוטוקול זה, עם זאת, הכיול המומלץ שהוצע על ידי היצרן צריך הושלם לפני כיול זה.
   1. גדר פרמטרי סריקה ופרמטרי מקור ESI מחוממים בתיבת בקרת מכשיר של תוכנת הכוונון כדלקמן: MS מלא סוג הסריקה; מ טווח סריקה / z 500-4,000; הפיצול (ב-מקור התנגשות המושרה דיסוציאציה (CID) מתח 60 eV; קוטביות שלילית; אוטומטי בקרת שבח (AGC) למקד 1 x 10 ^6, הזמן להזריק מקסימום 50 msec; נדן זרימת הגז בשיעור 5; aux זרימת הגז בשיעור 0; לטאטא גז קצב זרימת 0; לרסס מתח 3 ק; טמפרטורה נימי 320 מעלות צלזיוס; S-העדשה גלי רדיו (RF) ברמת 100; טמפרטורת דוד 30 ° C.
      1. הזן את הרשימה של יונים שליליים כדי להיות במעקב כפי m / z 792.85908, 1064.80870, 1336.75832, 1608.70794, 1880.65755, 2152.60717, 2424.55679, 2696.50640, 2968.45602, 3376.38045.
   2. הזיזו את החללית ESI מחוממת קרוב לממשק של ספקטרומטר מסה (המיקום B). חבר את החללית ומזרק עם צינור.
   3. להשרות את calibrant כל הזמן בקצב זרימה של 10 μl / min באמצעות משאבת מזרק מוטבע. בדקו רק 6 יוני המסה הנמוכים (m / z 792.85908-2152.60717) בטבלת הכיול האישית.
      1. המשך עם כיול לאחר עוצמת האותות הם התייצבו. לאחר הכיול, לבדוק רק ששת יוני המסה הגבוהים יותר (m / z 1880.65755-3376.38045) ולהמשיך עם כיול. הימנע כיול באמצעות כל היונים בבת אחת, כדי למנוע כישלון.
7. הזיזו את החללית אל appropriate עמדה בקצב זרימה של 0.4 mL / min (המיקום D) ולהתחבר כרומטוגרף נוזלי עם צינור מתכת אצילה.
8. הגדר את הפרמטרים חומם מקור ESI בתיבת בקרת מכשיר של תוכנת הכוונון כדלקמן: קצב זרימת גז נדן 50; קצב זרימת הגז aux 15; לטאטא קצב זרימת הגז 1; לרסס מתח 2.5 קילו וולט; טמפרטורה נימי 350 מעלות צלזיוס; S-עדשת RF ברמת 100; טמפרטורת החימום 350 מעלות צלזיוס.
9. הפרמטרים רכישת סט של ספקטרומטר מסה בחלון ההתקנה אינסטרומנטלית כדלקמן: משך שיטת 8 דקות; להסיט שסתום, 3.5-6 דקות כדי ספקטרומטר מסה, 0-3.5 ו 6-8 דקות לבזבז; זמן ריצה 3.5 כדי 6 דקות; קוטביות שלילית; מתח CID מקור 15.0 eV; microscans 3; כוח ברזולוציה נומינלי (ב m / z 200) 140,000; יעד AGC 1 x 10 ^6; זמן יון מקסימום 50 msec; מספר סריקות 1; מ טווח סריקה / z 700-3,500; פרופיל ספקטרום סוג הנתונים.
10. פרמטרי סט כרומטוגרף נוזלי כדלקמן: טמפרטורת תנור עמודה 20 מעלות צלזיוס; samplדואר מגש טמפרטורה 10 ° C; תוכנית שיפוע 0-0.5 דקות 5% B, 0.5-1 דקות 5-30% B, 1-3.5 דקות 30-40% B, 3.5-5 דקות 40-98% B, 5-6 דקות 98% B, 6 6.05 דקות 98-5% B, 6.05-8 דקות 5% ב; קצב הזרימה 0.4 מ"ל / דקה.
11. טהר בועות על ידי הקשה על תחתית של בקבוקונים. גדר בקבוקונים מדגם על הקולב ולהזריק 1.0 מיקרוליטר של מדגם באמצעות autosampler להתחיל ניתוח.
12. פתח קבצי נתונים גולמיים עם תוכנת הדפדפן ולאשר שכל הרכישות הסתיימו בהצלחה, כוללות בקרות החיוביות ושליליות.
    הערה: בדרך כלל, שתיים או שלוש פסגות תהיינה שנצפו הכרומתוגרמה הנוכחי היון הכולל בכל זמן שמירה של 4-5.5 דקות כאשר DNA נפוחיתיים מוגבר בהצלחה ולעכל.

5. Deconvolution ופרשנות

1. הפעל את תוכנת deconvolution. סוג ניסוי בחר "תמצית אוטומטית (isotopically נפתר)".
2. לערוך שיטה באמצעות הפרמטרים הבאים: M המונית פלט; S / N thresholד 3, סף שפע יחסי 0; מטען שלילי כן; לחשב חילוץ יון הכרומתוגרמה הנוכחי (XIC) כן; m / z מגוון 700-3,500; לחייב ⁺ H מוביל; מספר מזערי של תשלום זוהה 3; נוקלאוטיד יחס איזוטופ; גורם 80% לנכון; סף 0% והיתר; לשקול חפיפות כן; לחייב מגוון 3-50; מינימום עוצמת 1; שגיאה עוצמת צפוי 3.
   1. שמור כשיטה חדשה ובחר אותו.
3. בחר את הספרייה שבה קבצי הנתונים הגולמיים קיימים. בחר את קבצי נתונים הגולמיים להיות מנותחים ולחץ על 'הוסף לתור' כפתור.
4. לחץ על לחצן 'הפעלה' על הכרטיסייה 'הפעלה תור' להתחיל deconvolution.
5. לאחר התור הושלם, בחר בשורה ולחץ על 'תוצאה להרחיב' בכיתוב העליון כדי לקבל את תוצאות deconvolution.
6. פענח את התוצאות מהמוני monoisotopic נגזרו פסגות בכל זמן שמירה של 4-5.5 דקות באמצעות טבלה 4.

תוצאות

שלוש זמינים מסחרי עמודות הוערכו להפרדת oligonucleotides הארוך ברמות ספיקה של 100-400 μl / min. שרשרת הפחמן octadecyl רחב נקבוביות (C ₁₈₎ טור סיליקה חלקיקי -bonded (א), פולי-זמינים מסחרית (סטירן divinylbenzene) (PS-DVB) טור מונולית (ב) ו- טור מונולית סיליקה -bonded ₁₈ C ( ג) הושווה (איור 1). שלושה זוגות של דופלקסים DNA (26, 37 ו -53 נ"ב) הופרדו באמצעות כל העמודות, והטור מונולית -bonded סיליקה ₁₈ C שימש במחקרים שלאחר מכן.

נציג תוצאות לניתוח דגימת DNA שחולץ מן השריר של T. rubripes מוצג באיור 2. פסגות נפתרה isotopically, כפי שמוצג באיור 2a, נדרשים לחישוב מסת monoisotopic בהצלחה. בין התיאורטי MEAsured המוני monoisotopic של T. rubripes מוצג איור 2b. מכיוון עיכול עם endonucleases מתבצע רק לאחר הגברה PCR ללא טיהור, סוף 3'-דביק שנוצר על ידי endonuclease Msp לי התמלא פולימראז DNA הנותרים. על פי הניתוח של amplicons הנגזרות תבניות DNA סינתטיים, דיוק המסה נע בין -2.48 עד 2.40 ppm (0.62 ± 0.74 ppm בממוצע, n = 280). לפיכך, סובלנות המונית של 3 עמודים לדקה שימש להבחנה מינים (לוח 4). באמצעות הטבלה, כל הדגימות נפוחיתיים המתקבלות בשווקים ובחנויות הובדלו כראוי כמו מינים ספציפיים ^37.

על פי הניתוח התקופתי של המדגם המתקבל תבנית ה- DNA הסינטטי של T. chrysops, כל ההמונים monoisotopic של analytes נקבעו בהצלחה בתוך ± 3 עמודים לדקה עבור ב"להhr אס 180 ללא כל כיול מסה (איור 3). משמעות הדבר היא כי כיול מסה יידרשו על בסיס שבועי.

איור 1: chromatograms הנוכחי יון הכולל של המוצר PCR-RFLP נגזר תבנית ה- DNA מסונתז של T. pardalis באמצעות טור סיליקה חלקיקי C ₁₈ -bonded (א, 3 × 250 מ"מ, גודל החלקיקים 3 מיקרומטר), פולי (סטירן divinylbenzene) (PS-DVB) טור מונולית (ב, 1.0 × 250 מ"מ) ו- C ₁₈ טור סיליקה מונולית -bonded (ג, השיטה הנוכחית) תנאים (א):. קצב הזרימה 0.2 מ"ל / דקה; יחס של מתנול, 0-2 דקות 5%, 2-5 דקות 5% -25%, 5-20 דקות 25% -40%, 20-35 דק '40% -98%, 35-50 דק' 98%, 50 51 דק '98% -5%, 51-65 דק' 5%. תנאים (ב):לזרום 0.1 מ"ל / דקה שיעור; יחס של מתנול, 0-2 דקות 5%, 2-5 דקות 5% -25%, 5-35 דקות 25% -40%, 35-40 דק '40% -98%, 40-55 דק' 98%, 55- 56 דק '98% -5%, 56-70 דק' 5%. הטמפרטורה עבור שני העמודים הייתה 20 מעלות צלזיוס. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 2: תוצאות נציג לניתוח שריר גלם של T. rubripes. (א) chromatograms וספקטרום המוני הנוכחיים יון כולל אופייניים. (ב) תיאורטית ומדד ההמונים monoisotopic של מוצרי ה- PCR-RFLP נגזר תבנית ה- DNA מסונתז של T. rubripes. אנא לחץ כאן כדי להציג גדול גרסת r של נתון זה.

Amplicons בדיקת יציבות מתעכל נגזרת DNA הסינטטי של ט: איור 3. chrysops נותח כל 10 שעות. כיול Mass לא בוצע במהלך הבדיקה. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

שֵׁם	סדר פעולות
lago86F	5'-CCATGTGGAATGAAAACACC-3'
taki114F	5'-AAAAACAAGAGCCACAGCTCTAA-3'
fugu86-114R	5'-CCCTAGGGTAACTCGGTTCG-3'

ether.within-page = "1"> טבלה 1: פריימרים PCR.

מגיב PCR	נפח בשימוש	ריכוז סופי
מי Ultrapurified	15.75 μl
דטרגנט ללא חיץ 5x	5.0 μl	1x
תמהיל dNTP (10 מ"מ כל אחד)	0.5 μl	0.2 מ"מ
תערובת פריימר (10 מיקרומטר אחד של lago86F, taki114F ו fugu86-114R ב- pH TE חיץ 8.0)	1.0 מיקרוליטר	0.4 מיקרומטר אחד
DNA פולימרז (2.5 יחידה / μl)	0.25 μl	0.1 יחידה / μl
DNA תבנית ב pH TE חיץ 8.0 (5.0-10 ng / μl למדגם חילוץ, 0.2 מיקרומטר עבור רצפי דנ"א מלאכותיים כביקורת חיובית)	2.5 μl	0.5-1.0 ng / μl עבור DNA חילוץ ו -20 ננומטר עבור DNA סינתטי
	סה"כ: 25 μl

טבלה 2: רכיבים של סולם 25 μl PCR.

מחזור	מַצָב	פוּנקצִיָה
1	2 דק 'ב 95 ° C	denaturation הראשונית
2	30 שניות על 95 מעלות צלזיוס	denaturation
3	30 שניות ב 56 מעלות צלזיוס	רִכּוּך
4	30 שניות על 72 מעלות צלזיוס	הַאֲרָכָה
5	חזור על 2-4 (לגמרי 30 מחזורים)
6	7 דק 'ב 72 ° C	התארכות סופית
7	חזק ב -12 ° C עד הסרת המדגם

טבלה 3: תוכנית ה- PCR.

מספר שיא בשלב השמירה של 4.0-5.5 דקות	המוני Monoisotopic של השיא השלישי בטווח (Da)		המוני Monoisotopic של השיא השני בטווח (Da)		מיני נפוחיתיים
	קטן גדיל	Larger גדיל	קטן גדיל	Larger גדיל
2	→	→	15890.707-15890.803	16177.531-16177.629	ל inermis
			15921.702-15921.797	16146.537-16146.634	ל gloveri
			15930.713-15930.809	16137.525-16137.622	Lunaris L.
			15937.697-15937.792	16131.537-16131.634	ל wheeleri
			24173.034-24173.179	24566.905-24567.053	Chrysops ט
3	16295.706-16295.804	16467.610-16467.709	11341.851-11341.919	11466.875-11466.944	ט pardalis ט snyderi ט ocellatus ט xanthopterus ט stictonotus
			11654.908-11654.978	11770.920-11770.991	Niphobles ט
	16296.701-16296.799	16468.605-16468.704	→	→	Rubripes ט
	16311.701-16311.799	16452.610-16452.709	→	→	ט poecilonotus ט exascurus
	16320.713-16320.811	16443.599-16443.697	→	→	ט porphyreus ט obscurus
	16599.751-16599.851	16780.667-16780.767	→	→	ט vermicularis

לוח 4: בידול של נפוחיתיים מן ההמונים monoisotopic נגזר LC / ESI-MS.

לוח 5: Amplified רצף דנ"א (א) רצף זהה.כי המינים נפוחיתיים האחרים כמתואר בטבלה 4. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של השולחן הזה.

דיון

כדי לחלץ DNA, ערכה מסחרית לחילוץ דנ"א מדם והרקמות משמשת בהתאם לפרוטוקול של היצרן עם שינויים קלים (כמות proteinase K ו צנטריפוגה של הפתרון תמוגה). עם זאת, כל ערכת חילוץ יכולה לשמש עוד DNA הסלולר ניתן לחלץ עם התאוששות מתאימה וטוהר עבור PCR. שיטה זו נבדקה באמצעות שרירים, סנפיר, כבד, שחלה, ועור ^37. Fin מתאים במיוחד בגלל שטח הפנים הגדול, המאפשר תמוגה מהירה עם proteinase ק טרי, קפוא, מיובש, מבושלים ודוגמאות נפוחיתיים אפויות נבדקו ³⁷ בהצלחה.

סט פריימר PCR (לוח 1) מיועד נפוחיתיים ומגביר את גן RNA ריבוזומלי 16S המיטוכונדריה של נפוחיתיים. ה- DNA היעד כדי להגביר הוא 114-115 נ"ב (סוג Takifugu) ו -86 נ"ב (סוג Lagocephalus) (לוח 5). כדי להקל developme השיטה NT, oligonucleotides המסונתז שיש את רצפי היעד שמש עבור ההפניה במקום איסוף דגימות נפוחיתיים אותנטיים. סט פריימר יכול להיות מוחלף על ידי פריימר אחר להגדיר בתגובת לצורך, אולם אורך DNA סופי לאחר עיכול אנזימטי צריך להיות פחות מ 100 nt במונחים של שמירה על איכות ספקטרום המסות הנדרש לקיומו deconvolution המוצלח. בנוסף, לחץ חנקן מלכודת C צריך להיות מופחת כאשר oligonucleotide היעד ארוך יותר כ -75 NT ואת איכות הספקטרום ההמוני אינה מספיקה עבור פישוט מוצלח. ניתן לשלוט מגבלות אלו באמצעות ההתפתחויות האחרונות תוכנת המכשיר, אחרת השסתום עבור מלכודת C בתוך המארז חייב להיות מכוון כמתואר בסעיף בפרוטוקול. באשר הכנת מדגם, שימוש ריאגנטים אבקת כביסה ללא היא קריטי עבור LC עוקבת מבחינת צורת שיא מתאימה, עוצמת שיא מספיק זמן שמירה יציב ^31.

ילדה = "jove_content"> טור נימי מונולית PS-DVB ^21,24-33, טור סיליקה חלקיקי הפוכה פאזיים ₁₈ C ^23,40,41 ו כרומטוגרפיה אינטראקציה הידרופובי (HILIC) עמודה ⁴² שימשו עבור LC / ניתוח oligonucleotides ESI-MS. ביניהם, את טור מונולית הנימים עדיף על אחרים מבחינת יכולת הפרדה, לעומת זאת, בעמודת מונולית נימי שימוש במחקרים בעבר נעשתה בתוך הבית ומופעלת בקצב זרימה נמוך (2 μl / min), מחייב מכשור מוקדש LC מיקרו. כדי להקל על הפעלה קלה, עמודות-זמינות מסחרי הוערכו להפרדת oligonucleotides הארוך ברמות ספיקה גבוהה (100-400 μl / min). שלושה זוגות של דופלקסים DNA (26, 37 ו -53 נ"ב) הופרדו באמצעות העמודות הנ"ל, לעומת זאת, זמני המחזור של טור -bonded סיליקה חלקיקי ₁₈ C וטור מונולית PS-DVB היו 65 ו -70 דקות, בהתאמה , ואילו זה של C _{18 טור מונולית סיליקה -bonded היה 8 דקות (איור 1). אם אקח ניתוח מהיר בחשבון, מונולית סיליקה ג 18 -bonded העמודה נבחרה לענייננו למרות יכולת ההפרדה המוגבלת; עם זאת את שתי עמודות הנותרות יכולות להיות מועסקות כאשר הפרדת שיפור נדרשה. באופן תיאורטי, במקרה של טור מונולית, אין נפח ביניים ואת השלב הנייד ייאלץ לזרום דרך הנקבובית של השלב המוצק תוך שמירה על אורך תוואי עקבי, ובכך לאפשר הפרדה יעילה ^27. תהליכים כאלה יבואו לידי ביטוי, במיוחד בניתוח Biomacromolecules כגון oligonucleotide, כמו דיפוזיה האיטי של מולקולות הגדולות. אחד היתרונות המעשיים של טור מונולית הוא שהלחץ בחזרה נמוכה מזו של טור סיליקה חלקיקי ^27. למרות קצב הזרימה הגבוהה (400 μl / min) וטמפרטורת עמודה נמוכה (20 מעלות צלזיוס), לחץ חזרה מרבי שלמערכת הייתה 12.5 מגפ"ס ^37. זוהי ההפגנה הראשונה של היתרון של טור מונולית סיליקה -bonded 18 C לניתוח מהיר של oligonucleotide ארוך. בשל קצב הזרימה גבוהה, מכשיר ייעודי עבור LC מיקרו תיאום מדויק על הממשק אינם נדרשים. במקום זאת, בדיקה ESI מחוממת נדרש לנתק את דופלקס DNA ולסייע יינון של DNA כמתואר בהמשך.}

יון-זוג כרומטוגרפיה הוא נפוץ להפרדה MS-התואמת של oligonucleotides. עם זאת, מגיב-זוג יונים מפריע בדרך כלל עם תהליך ESI וירידה ברגישות של ESI-MS. לכן, HFIP משמש לעתים קרובות עבור השלב הנייד כדי לשפר את הרגישות של oligonucleotide. עם זאת, HFIP (נקודת רתיחה 59 ° C) מאדה במהירות בממשק לפני מתנול (נקודת רתיחה 65 מעלות צלזיוס), ולכן, זה הפסד של ממס מגביר pH ומקדם דיסוציאציה של מגיב-זוג יונים (כלומר, TEA)מן oligonucleotide. בגלל השיטה הנהוגה כיום מעסיקה חללית ESI מחוממת, אשר nebulizes eluate עם גז חנקן חם ב 350 מעלות צלזיוס, אפקט זה עשוי להיות מעל-הדגיש. במקום חיץ HFIP-TEA, ארב ו Oberacher מומלץ אצטט cyclohexyldimethylammonium (CycHDMAA; 8.4 pH) לניתוח גנוטיפ בגלל צמצום היווצרות adduct עם יונים של מתכות קורט ^33. המחברים הסיקו CycHDMAA עצמו מורחק ההיווצרות של adduct המתכת. למרות הספרות, היווצרות adduct משמעותית לא נצפתה בשיטת ההווה. בנוסף, היתרון לציין של מערכת HFIP-TEA-מתנול הוא כי אזור השיא שהושגו עם מערכת HFIP-TEA-מתנול היה 17 פעמים יותר מאשר זה המתקבל במערכת CycHDMAA-אצטוניטריל כאשר לאחר שניתח amplicon 86 נ"ב של T. poecilonotus (מידע לא מוצג). אחד החסרונות של מערכת HFIP-TEA-מתנול, לעומת זאת, הוא יחסית התייקרות למערכת CycHDMAA-אצטוניטריל.

חישוב מסת monoisotopic דורש הפרדת פסגות איזוטופי של יונים טעונים מתרבה. לכן, ההחלטה היא קריטית עבור הניתוח המובא. למרות כוח ברזולוציה הנדרש הוא תלוי באורך בסיס זוג אנליטי, מנתחי TOF קונבנציונליים, שבה יש כוח ברזולוציה של כמה עשרות אלף, עשויים להיות מוגבלים לניתוח oligonucleotides הקצר.

המוני monoisotopic התיאורטי שניתן לראות בטבלה 4 חושבו מתוך יצירות הבסיס המקבילות analytes. לחלופין, Muddiman et al. פתח יישום תוכנה לחישוב רכב הבסיס מן המסה המדויקת ^43. תכנית דומה שולבה במערכת ESI-MS האוטומטית ^16-18. השימוש באלגוריתמים אלה עשויים לשפר את חוסנו של השיטה הנוכחית בגלל מסת monoisotopic נמדדה לא תמיד מתאימה על o רכב בסיס ייחודיכנף אל הסובלנות ההמונית של 3 עמודים לדקה הנובעים טעות מדידה בלתי הנמנעת. למרבה הצער, לא יכולנו להשיג מוצרי תוכנה אלה למחקר הנוכחי.

קביעת מין monoisotopic הנוכחית מבוסס המוני עשויה להיות מתאימה לא רק את הבידול של נפוחיתיים אלא גם לצורך זיהוי של פולימורפיזם DNA האחר כי השיטה הנוכחית מבוססת על ניתוח רכב הבסיס ואינה כרוכים בהליכים שתוכננו במיוחד עבור נפוחיתיים. באשר זיהוי של פולימורפיזם DNA, מערכת ESI-MS הייעודי היא אוטומטית לחלוטין וקלה לתפעול, אשר עשוי להיות מתאים לשימוש אבחון כגון זיהוי של פתוגנים ^{15,17,18,20,30.} לעומת זאת, השיטה הנהוגה כיום אינה ריאלית עם כלי מחקר משותפים ומכשירים, ולכן מתאימים לשימושי מחקר. ESI-MS יושם כבר פולימורפיזם DNA האנושי כגון ^13,28,32 פולימורפיזם נוקלאוטיד בודד, חזרה טנדם קצר ²⁶DNA, המיטוכונדריה analsis ^16,19. גם מיקרו RNA נותח באמצעות נימי LC / ESI-MS ^44. יישומים שפורסמו אלה יכולים להתממש גם על ידי השיטה הנוכחית. בנוסף, שיטה זו עשויה להיות מתאימה ניטור האינטראקציה בין oligonucleotide ותרכובות נמוך משקל מולקולרי, כגון האינטראקציה של אנטיביוטיקה ו- RNA ריבוזומלי ⁴⁵ בשל ההפרדה בטמפרטורה הנמוכה. במקרים כאלה, oligonucleotides ותרכובות נמוך משקל מולקולרי צריך להתגלות בו זמנית, דבר המהווה יתרון של שימוש LC / ESI-MS.

ישן מגבלה כי המכשור אינו מתאים לביצוע ניתוח מקביל כמו טכניקות קונבנציונליות כגון סנגרתי רצף בזמן אמת PCR. בנוסף, השיטה הנוכחית מזהה רכב בסיס בלבד וכל החלפת בסיס בתוך אותה המולקולה לא ניתן להבחין. עם זאת, בניתוח DNA המבוסס MS המתואר כאן ייתכן שעדיין יש כשרון בקדנציהים של דיוק בהשוואה DNA מחייב טכניקות מבוססות לצבוע כגון ג'ל אלקטרופורזה בזמן אמת PCR.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
DNeasy דם & ערכת רקמות (50)	Qiagen	69504	ערכת מיצוי DNA
Proteinase K	Qiagen	19131
אתנול (99.5+ vol%)	Wako	054-07225	לדילול מאגרי כביסה
מאגר TE (pH 8.0)	Wako	310-90023	לדילול דגימת
DNA פריימר PCR	Fasmac	NA	מטוהר עם עמודת מחסנית הפוכה על ידי הספק
תבנית DNA	Eurofins Genomics	NA	מטוהר על ידי HPLC על ידי הספק
מים מטוהרים במיוחד	NA	NA	נוצר עם מערכת טיהור מים ישירה Milli-Q (Merck Millipore), המשמשת להכנת דגימה
ללא חומר ניקוי 5x Phusion HF Buffer	Thermo Fisher	F-520L	השתמש במקום המאגר המסופק של DNA פולימראז
Pfu-X DNA פולימראז	Jena Bioscience	תערובת PCR-207S
dNTP (20 מ"מ כל אחד)	Jena Bioscience	NA	מסופק עם ה-DNA פולימראז
10 פעמים; מאגר אוניברסלי M	Takara Bio	NA	המכיל 100 מ"מ Tris-HCl (pH 7.5), 100 מ"מ MgCl2, 10 מ"מ דיתיותרייטול ו-500 מ"מ NaCl
Dra I	Thermo Fisher	FD0224	אנזים הגבלה
MSP I	Thermo Fisher	FD0544	אנזים הגבלה
1,1,1,3,3,3-hexafluoro-2-propanol (HFIP)	Fluka	42060-50ML	תוסף נוזל לדרגת LC-MS.
טריאתילאמין (TEA)	Fluka	65897-50ML	תוסף נוזל לדרגת LC-MS.
חומצה טריפלואורואצטית	Sigma-Aldrich	T6508	להכנת קליברנט.
נתרן הידרוקסיד (1.0 מ')	Fluka	72082	יש לדלל ל-10 מ"מ במים מטוהרים במיוחד ולהשתמש לטיטרציה של חומצה טריפלואורואצטית.
אצטוניטריל	פלוקה	34967	להכנת קליברנט, דרגת LC/MS.
מתנול	קאנטו	25185-76	לשלב נייד, כיתה LC/MS.
Water	Thermo Fisher	W6-1	לשלב נייד, דרגת LC/MS.
צינור מיקרוצנטריפוגה (0.5 מ"ל)צינור מיקרוצנטריפוגה	Eppendorf	0030123301	PCR בדרגה נקייה
(1.5 מ"ל)	Eppendorf	0030123328	PCR בדרגה נקייה
UVette	Eppendorf	0030106300	קוביית UV חד פעמית.
ג'ל ירוק	ביוטיום	41004	כתם DNA פלואורסצנטי
מסנן קוסמוספין G (0.2 μ m)	Nakalai Tesque	06549-44	עשוי ממברנת פוליטטרפלואורואתילן הידרופילית (PTFE). כל יחידת פילטר צנטריפוגלית (גודל נקבוביות, 0.2– 0.5 μ m) עשוי PTFE הידרופילי או ממברנה אחרת בעלת קשירה נמוכה ישים.
300 μ l בקבוקון בורג PP	אספקת כרומטוגרפיה אמריקאית	V0309P-1232
מכסה בורג מורכב מראש ומחיצה	Finneran	5395-09R
Monobis C18 עמודה אנליטית (2.0& פעמים; 50 מ"מ, גודל מזופור = 30 ננומטר)	Kyoto Monotech	2050H30ODS	מחוץ ליפן, זמין לרכישה מ-GL Sciences דרך המפיצים שלה. (http://www.glsciences.com/distributors/)
עמוד שמירה מונוביס C18	קיוטו מונוטק	GCSET-ODS3210	מחזיק כלול.
קדנזה CW-C18 (3.0 פעמים; 250 מ"מ)	Imtakt	CW036	C18 עמוד סיליקה חלקיקי מלוכד
ProSwift RP-4H (1.0× 250 מ"מ)	תרמו פישר	066640	פולי (סטירן-דיווינילבנזן) עמוד מונוליט
מיקסר תמו C	Eppendorf	5382 000.023	לעיכול רקמות דגים.
ספקטרופוטומטר	Shimadzu	UV-3150	כימות ריכוז ה-DNA.
מקרר תרמי	Bio-Rad	T100
מקרר נייד	Twinbird	D-CUBE	לשלב נייד מימי למניעת אידוי של HFIP. ניתן להחליף את זה בקופסת קרח.
כרומטוגרף נוזלי אולטימטיבי 3000	תרמו פישר	NA
Q ספקטרומטר מסה אקטיבי	תרמו פישר	NA	פורייה טרנספורמציה ספקטרומטר מסה מצויד במנתח המלכודות של קינגדון שונה.
דה-קונבולוציה של חלבון 3.0	Thermo Fisher	NA	השתמש בגרסה 3.0 ומעלה עם מודל פטטר איזוטופי של נוקלאוטיד.