הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

Assay העדפות טעם למבוגרים

9.5K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/54403

⸱

8 בספטמבר 2016

 , 
1Department of Medical and Molecular Genetics, Indiana University School of Medicine-South Bend

במאמר זה

סיכום

טעם הוא תהליך חושי חשוב המאפשר משיכה לחומרים מועילים והימנעות מחומרים רעילים. פרוטוקול זה מתאר מבחן בליעה פשוט לקביעת העדפת טעם של דרוזופילה לתרכובת כימית נתונה.

תקציר

תפיסת הריח והטעם של הסביבה חיונית להישרדות בעלי חיים. היישום הברור ביותר של כימותרפיה זו הוא היכולת להבחין בין מקורות מזון טובים למקורות מזון שעלולים להיות מסוכנים. גוסטיישן דורש מגע פיזי עם תרכובת כימית המסוגלת לאותת באמצעות קולטני טעם המתבטאים על פני השטח של נוירונים. אצל חרקים, תאי העצב הטעמיים האלה יכולים להיות ממוקמים על פני גוף החיה, מה שמאפשר לטעם למלא תפקיד חשוב בהתנהגויות רבות ושונות. חרקים מעדיפים בדרך כלל תרכובות המכילות סוכרים, בעוד שתרכובות הנחשבות בעלות טעם מר נמנעות. בהתחשב בחשיבותו הביולוגית הבסיסית של הטעם, יש עניין רב בהבנת המנגנונים המולקולריים העומדים בבסיס אופן חושי זה. אנו מתארים בדיקת טעם של דרוזופילה בוגרת המשקפת את העדפת בעלי החיים לתרכובת טסטנט נתונה. ניתן ליישם בדיקה זו על בעלי חיים מכל רקע גנטי כדי לבחון את העדפת הטעם לתרכובת מסיסה רצויה.

מבוא

בעלי חיים להשתמש chemosensation להבחין תנאי יתרון מלבד תנאים נחותים. תפיסה זו יכולה להיות קריטית עבור דברים כגון קביעת מקור המזון הטוב ביותר, הימנעות חומרים רעילים או קביעת שותף הזדווגות מיטב 1. Chemosensation מחולקת לעתים קרובות לשני מרכיבים חושיים: חושי חוש ריח וחושים התעוררו אצלם. מאפיין מבדיל עיקרי של חושים אלה הוא כי חוש ריח (ריח) משמש כדי לדגום את הסביבה הכימית גזים שמסביב בעוד gustation (טעם) דורש מגע פיזי עם מצע בלתי נדיף. שני אופנים חושיים לעורר תגובות נוירולוגיות שעוברים עיבוד מפוענח במוח כדי לגרום לפעולת 2 דוחה או המושך המתאים. חושים אלה הם אפוא קריטיים להישרדות חיה.

זבוב הפירות תסיסנית הוא אורגניזם מודל אשר ממשיכה לצבור פופולריות לשימוש להביןing איך חרקים תופסים ריח וטעם. זבובי פירות להציע יתרונות עצומים על פני מערכות מודל אחר בשל שפע של כלים גנטיים זמין לנתיחה של מסלולים מולקולריים, הסלולר, והתנהגותיים. עבודה במשך 15 השנים האחרונות כבר סייע במיוחד באפיון הזהויות התאיות הספציפיות, קולטנים עצביים, ואיתות מנגנונים מעורבים בשני ריח וטעם. עכשיו, את הכוח של גנטיקה תסיסנית נמצא בשימוש כדי להבהיר עוד כמה תהליכים אלה מסומלים על המעגל נוירון בודד יחיד ברמה 3-6. לכן, מבחנים המספקים בקלות הבקיע מונה המציין שינויי מסלולים חושיים חיוניים מראש המתמשך של שדות אלה.

בעוד הרבה ידוע על איך אותות הריח מסומלים ומעובד במוח, הרבה פחות מובן על מנגנונים דומים במסלול התעורר אצלם. אנו מתארים כאן פרוטוקול אשר ניתן להשתמש בהם כדי לברר preferen טעםce תסיסנית. תסיסנית, כמו יונקים, בדרך כלל מעדיף תרכובות טעימות מתוקות בניגוד תרכובות טעימות מרות. כל שילוב של מקורות מזון אלה יכול להיות מנוצל בעיצוב ניסיוני זה כדי לקבוע כיצד שינויים גנטיים ידועים להשפיע על בחירת טעם. בנוסף, אסטרטגיות התערבות פרמקולוגית ניתן להעריך באופן דומה השפיעו על העדפת הטעם של חיות. הקלות והגמישות של assay זה עושה את זה פרדיגמה שימושי להבנת אופי בחוש הטעם תסיסנית.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

1. רעב

  1. הכן לטוס בקבוקונים רעבים על ידי להרוות כדור צמר גפן עם 18.2 MΩ מים בתחתית בקבוקון זבוב סטנדרטי. לחלופין, בדומה להרוות רצועה קטנה של נייר סינון עם 18.2 MΩ מים ומקום בזווית בתוך הבקבוקון.
  2. אסוף זבובים לתוך סטים של ~ 100 בעלי חיים על כרית CO 2 ולאחר מכן להוסיף את הזבובים כדי בקבוקון מוכן.
    הערה: התוצאות הטובות ביותר מושגות עם חיות כי הם פחות מ 5 ימים. עם זאת, את הגיל המדויק של החיות ניתן לשלוט כמשתנה ניסיוני לקבוע לשינויים בהעדפות הטעם לאורך זמן.
  3. השתמש פקק כדור או קצף כותנה להבטחת הבקבוקונים סגורים. מניחים צלוחיות לצידם באינקובטור נשלט לסביבה. לשמור על טמפרטורה של 25 מעלות צלזיוס, ואת לחות מעל 70%. השאירו בקבוקונים כפי שהיא למשך 24 שעות.

2. Assay העדפות טעם

  1. הכן את כל tastants עבור assay באותו יוםבדיקות s.
    הערה: tastants המדויק לשמש ישתנה בהתאם שאלת ניסוי שהתבקש. להלן tastants למשל בשימוש בפרוטוקול זה. ראו סעיף 4 עבור אופטימיזציות.
    1. הכן מלאה tastant (1 מ"מ סוכרוז) על ידי שילוב 10 μl של פתרון סוכרוז 100 מ"מ, 13 μl של צבע מאכל אדום, ו 977 μl של 18.2 MΩ מים.
    2. הכן tastant ניסיוני (סוכרוז 5 מ"מ) על ידי שילוב 50 μl של 100 מ"מ תמיסת סוכרוז, 10 μl של צבע מאכל כחול, 940 μl של 18.2 MΩ מים.
  2. הפוך תאי assay באמצעות צלחת פטרי פלסטיק רגיל 100 מ"מ x 15 מ"מ ערוכים באופן הבא:
    1. מניחים שלושה 10 טיפות μl שליטה tastant הקרוב שולי הצלחת בשעה 12 ועוד 3 טיפות בשעה 6. ודא כי המרווח בין טיפות דומה.
    2. מניחים שלושה 10 טיפות μl של tastant ניסיוני הקרוב שולי הצלחת ב -3 בבוקר,3 אחרים טיפות בשעה 9. ודא כי המרווח בין טיפות דומה.
    3. חזור על שלבים 2.2.1 ו 2.2.2 עבור רבים משכפל כרצונכם.
  3. בקבוקון 1 ריק זבובים ~ 100 מורעבים על כרית CO 2 רק מספיק זמן כדי להרדים את כל החיות (כ -10 שניות). מבריש את החיות לאמצע בתא assay מוכן וכסו מכסת הצלחת.
    הערה: ארוכה יותר בתקופות של חשיפת CO 2 יש להימנע כדי לשפר את זמן התאוששות והפרעת גבול עם התנהגות האכילה. חשיפת הקרח (~ 5 דקות) ניתן להשתמש הרדמה כדי למנוע תופעות התנהגותיות CO 2 שיכולים לנבוע גם חשיפה מוגבלת.
  4. מניחים את החדר assay בקופסת קרטון אטום. הקפד לתייג את מחוץ לקופסא עם המצב ואת הגנוטיפ נבדקת.
  5. מניח את ההתקנה כולה (קאמרי assay בתוך ארגז קרטון של שלב 2.4) לתוך C חממת 25 ° עם לחות של 70% לפחות 2 שעות.
  6. חזור על שלבים 2.3 דרך 2.5 לכל משכפל.
  7. לאחר 2 שעות, במקום לתאי assay, עדיין בתוך קופסאות קרטון, ישירות לתוך המקפיא -20 ° C עד מוכן לכמת.

כימות Assay 3. טעם העדפות

  1. אפשר בתא assay יחיד להתחמם לטמפרטורת החדר (כ 5 דקות).
  2. תחת מיקרוסקופ לנתיחה, בעזרת מברשת או זוג מלקחיים, חיות קבוצה המבוססת על צבע של הבטן שלהם: אדום, כחול, סגול או ברורה (איור 1).
  3. רשמו את מספר בעלי החיים בכל קיבוץ. שקול חיות ברורות שלא השתתפו assay ולכן אינו כולל אותם בכל חישובים.
  4. חשב את מדד העדפה על פי אחת המשוואות הבאות:
    1. אם tastant עניין ניסיוני מתווסף צבע אדום, ולאחר מכן להשתמש (אדום N + 0.5N סגול) / (אדום N + N purpl כחול + Nה).
    2. אם tastant ניסיוני מתווסף צבע כחול, ולאחר מכן להתאים את המשוואה (N כחול + 0.5N סגול) / (N כחול + N אדום + N סגול).
  5. חזור על החישובים עבור כל תנאי הניסוי ו המשכפלת.

4. אופטימיזציה של Assay העדפות טעם

  1. באופן אמפירי לקבוע את הריכוז של אינדיקטורים צבעי מאכל לשמש כך צבעי מאכל אינו משפיעים על התוצאה של assay הטעם, כדלקמן:
    1. כן 4 tastants באמצעות באותו מתחם הבסיס (למשל 5 סוכרוז מ"מ) כמצוין בשלב 2.1, אך השמט את צבעי מאכל.
    2. להוסיף צבע מאכל אדום 1.3% לאחת tastants. הפוך את 3 tastants הנותרים עם צבע מאכל כחול של ריכוזים שונים בצינור אחד (למשל 0.6%, 1%, ו -1.3%).
    3. פרוטוקול מלא צעדי 2.2 דרך 3.4 עבור כל זוג tastant: מול אדום 1.3% 0.6% כחולים; 1.3% אדום לעומת 1% כחול1.3% אדומים לעומת 1.3% כחולים.
    4. חזור על שלב 4.1.1-4.1.3 עם אחוזים שונים של צבע מאכל הכחול עד ממוצעי מדד העדפת ערך של 0 (איור 2).
      הערה: כנקודת מוצא, צבע מאכל אדום 1.3% בשילוב עם צבעי מאכל כחול 1% בדרך כלל מניב תוצאות טובות. אם אין ריכוז משביע רצון של צבע מאכל הכחול ניתן להתאים צבע 1.3%, ולאחר מכן צעד 4.1.1 דרך 4.1.3 ניתן לחזור עם ריכוזים שונים של צבע אדום וריכוז מתמיד של צבע מאכל הכחול.
    5. לנתח את כל התנאים כדי להיבדק עם ריכוזי הצבעים מאכלים אותו מותאמים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

כמה תוצאות אופייניות מבחני העדפה לטעם מוצגות להלן. ברוב הניסויים שונים כלשהי עוצמת צביעת בטן יהיה לראות (איור 1). כל צביעה בבטן אם אינטנסיבי או חלש נחשבת בליעה חיובית. לכן מומלץ לחוקרים להבקיע בעלי חיים תוך עיוור תנאי הניסוי כדי להגביל כל הטיות פוטנציאליות.

כמו כן, חשוב לבחור ריכוזי צבע מאכל אשר אינו משפיע על התוצאה של assay ההעדפה...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

תארנו פרוטוקול פשוט אך יעיל לקביעת העדפה לטעם תסיסנית. גרסאות של assay זה משמשים באופן שגרתי ניסויים כדי לקבוע את תרומתם של קולטנים התעורר אצלם (GRS) כדי לתפוס את איכויות שונות (מר, מתוק, חמוץ, מלוח, umami) של תרכובות טעם. הגנום תסיסנית מכיל כ 60 גנים המקודדים 68 קולטנים gustatory מזוהה על ידי שחבור חלופי 8,9. עם זאת, חלבונים אחרים כגון קולטני גלוטמט ionotropic וערוצי TRP גם הוכחו לשחק תפקיד בטעם 10-13. לכן, יש מגוון נרחב בכח המפלה של טעם חר...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

המחברים מצהירים שאין להם אינטרסים פיננסיים מתחרים.

תודות

ברצוננו להודות לחברי מעבדת טסייה על הקריאה הביקורתית של כתב היד הזה ועל הצעות מועילות במהלך הכנת פרוטוקול זה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
צבע מאכל כחול (מים, פרופילן גליקול, FD& C כחול 1 ואדום 40, פרופילפרבן)מקורמיקN/A
קופסאות קריו/מקפיא ללא חוצציםפישר03-395-455
Dumont #5 מלקחייםכלים מדעיים עדינים11251-20
חומצה אצטית קרחוניתפישרBP2401-500
Leica S6 E Stereozoom 0.63X-4.0X מיקרוסקופW. Nuhsbaum, Inc.צלחת
פטרי 10446294 (100 מ"מ x 15 מ"מ)BD Falcon351029לשימוש חוזר אם נשטף ומיובש היטב
Quick-Snap MicrotubesAlkali Scientific Inc.C3017
צבע מאכל אדום (מים, פרופילן גליקול, FD& C Reds 40 and 3, Propylparaben)McCormickN/A
SucroseIBI ScientificIB37160

מקורות

  1. Herrero, P. Fruit fly behavior in response to chemosensory signals. Peptides. 38 (2), 228-237 (2012).
  2. Vosshall, L. B., Stocker, R. F. Molecular architecture of smell and taste in Drosophila. Annu Rev Neurosci. 30, 505-533 (2007).
  3. Harris, D. T., Kallman, B. R., Mullaney, B. C., Scott, K. Representations of Taste Modality in the Drosophila Brain. Neuron. 86 (6), 1449-1460 (2015).
  4. Hong, E. J., Wilson, R. I. Simultaneous encoding of odors by channels with diverse sensitivity to inhibition. Neuron. 85 (3), 573-589 (2015).
  5. Kain, P., Dahanukar, A. Secondary taste neurons that convey sweet taste and starvation in the Drosophila brain. Neuron. 85 (4), 819-832 (2015).
  6. Masek, P., Worden, K., Aso, Y., Rubin, G. M., Keene, A. C. A dopamine-modulated neural circuit regulating aversive taste memory in Drosophila. Curr Biol. 25 (11), 1535-1541 (2015).
  7. Charlu, S., Wisotsky, Z., Medina, A., Dahanukar, A. Acid sensing by sweet and bitter taste neurons in Drosophila melanogaster. Nat Commun. 4, 2042(2013).
  8. Clyne, P. J., Warr, C. G., Carlson, J. R. Candidate taste receptors in Drosophila. Science. 287 (5459), 1830-1834 (2000).
  9. Scott, K., et al. A chemosensory gene family encoding candidate gustatory and olfactory receptors in Drosophila. Cell. 104 (5), 661-673 (2001).
  10. Kim, S. H., et al. Drosophila TRPA1 channel mediates chemical avoidance in gustatory receptor neurons. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (18), 8440-8445 (2010).
  11. Koh, T. W., et al. The Drosophila IR20a clade of ionotropic receptors are candidate taste and pheromone receptors. Neuron. 83 (4), 850-865 (2014).
  12. Zhang, Y. V., Ni, J., Montell, C. The molecular basis for attractive salt-taste coding in Drosophila. Science. 340 (6138), 1334-1338 (2013).
  13. Zhang, Y. V., Raghuwanshi, R. P., Shen, W. L., Montell, C. Food experience-induced taste desensitization modulated by the Drosophila TRPL channel. Nat Neurosci. 16 (10), 1468-1476 (2013).
  14. Liman, E. R., Zhang, Y. V., Montell, C. Peripheral coding of taste. Neuron. 81 (5), 984-1000 (2014).
  15. Rodrigues, V., Cheah, P. Y., Ray, K., Chia, W. malvolio, the Drosophila homologue of mouse NRAMP-1 (Bcg), is expressed in macrophages and in the nervous system and is required for normal taste behaviour. EMBO J. 14 (13), 3007-3020 (1995).
  16. Tanimura, T., Isono, K., Yamamoto, M. T. Taste sensitivity to trehalose and its alteration by gene dosage in Drosophila melanogaster. Genetics. 119 (2), 399-406 (1988).
  17. Weiss, L. A., Dahanukar, A., Kwon, J. Y., Banerjee, D., Carlson, J. R. The molecular and cellular basis of bitter taste in Drosophila. Neuron. 69 (2), 258-272 (2011).
  18. French, A. S., et al. Dual mechanism for bitter avoidance in Drosophila. J Neurosci. 35 (9), 3990-4004 (2015).
  19. Deshpande, S. A., et al. Quantifying Drosophila food intake: comparative analysis of current methodology. Nat Methods. 11 (5), 535-540 (2014).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

בדיקת טעם ב-Drosophilaמבחן העדפת טעםניתוח ריכוז סוכרוזכימות צבע מאכלשיטת הרדמה ב-CO2הכנת פטריבקרת סביבה באינקובטורטכניקת אחסון במקפיאתצפית במיקרוסקופ דיסקציהקיבוץ לפי צבע הבטן
Assay העדפות טעם למבוגרים
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.