בדיקות התנהגותיות מספקות כלים רבי עוצמה להבנת תפקוד עצבי. כאן אנו מציגים מספר פרוטוקולים לכימות התנהגות האכלה טורפת שנמצאו בנמטודת המודל Pristionchus pacificus וקרובי משפחתה. בנוסף, אנו מספקים שיטות לניתוח התאמות האכלה טורפות כולל מבני פה ושיניים.
מאמר שיטה
Assaying הרגלי התזונה הם טורפים ב
* These authors contributed equally
במאמר זה
סיכום
תקציר
פרוטוקול זה מספק שיטות מרובות לניתוח וכימות של התנהגויות האכלה טורפות בנמטודות. מינים רבים של נמטודות כולל Pristionchus pacificus מציגים התנהגויות מורכבות, שהבולטת שבהן היא טריפה של זחלי נמטודות אחרות. עם זאת, מכיוון שהתנהגויות אלה נעדרות באורגניזם המודל Caenorhabditis elegans, הן תוארו עד כה בפירוט רק לאחרונה יחד עם פיתוח מבחנים התנהגותיים אמינים 1. התנהגויות טורפות אלה תלויות בצורות פה פלסטיות אך קבועות פנוטיפיות, מה שהופך את הזיהוי והסיווג הנכונים של בעלי חיים אלה לחיוניים. ב-P. pacificus ישנם שני סוגי פה, ה-stenostomatous וה-eurystomatous morphs 2, כאשר רק ה-eurystomatous בעל הפה הרחב מכיל שן נוספת ומסוגל להרוג זחלי נמטודות אחרים. באמצעות בידוד של שפע של זחלי טרף תואמים בגודל וחשיפה לאחר מכן לנמטודות טורפות, בדיקות הכוללות הן "מבחני גופה" והן "מבחני נשיכה" על נמטודות שינוי פה שזוהו כהלכה אפשריות. בדיקות אלו מספקות אמצעי לכימות מהיר של שיעורי הצלחת הטריפה ומספקות ניתוח התנהגותי מפורט של נמטודות בודדות העוסקות בפעילויות האכלה טורפות. בנוסף, באמצעות מצלמה מהירה מתאפשרת גם הדמיה של שינויים בפעילות הלוע כולל דינמיקת שיניים ושאיבה.
מבוא
נמטודות עם מערכות העצבים הקטנות אך מורכבות שלהם הוכיחה כלים רבים עצמה להבנת היבטים רבים של לנוירוביולוגיה כולל התנהגות. הרבה של מחקר זה התמקד אורגניזם המודל Caenorhabditis elegans שבו שפע של התנהגויות שונות כבר גזור בהצלחה ונותח. אלה כוללים mechanosensory 3, 4 chemotactic, thermotactic 5,6 ו magnetotactic 7 משפיעי הזדווגות 8,9, למידת 10 והאכלת התנהגויות 11. עם זאת, אחרים יותר מינים נמטודות קרובים רחוקים להציג התנהגויות שאינן שנצפתה rhabditid ג elegans או לחילופין להראות רמות נוספות של מורכבות, מה שמעלה שאלות ענייניות לגבי האבולוציה והרגולציה שלהם. מקרה אחד כזה זה יכול להיות שנצפה נמטודות diplogastrid קרוב רחוק Pristionchus פקיפיקוס, המציג הרבה יותר מורכב האכלה להיותhaviors ומקצבים מאשר הם נצפו ב C. elegans 1. זאת למרות שני המינים שיתוף נוירונים בלוע הומולוגי 12. בד בבד עם הרגלי תזונה נוספים הללו, פ פקיפיקוס מציג גם מגוון תזונתי מורחב, כפי שהם טורפים נלהבים, מסוגלים להשלים דיאטת החיידקים שלהם על ידי ההאכלה גם על הזחלים של נמטודות אחרות. למרבה המזל, פ פקיפיקוס פותח כמודל ביולוגיה האבולוציונית השוואתית ואינטגרטיבית ולכן הרבה כלים מולקולריים וגנטיים זמינים כעת. אלה כוללים הגנום רצף ובהערות מלאים 13, כלים מולקולריים וגנטיים כולל transgenes 14 ו CRISPR / Cas9 15,16 וכן תולדות גזע מפורטות המבואר גם 17 עם מעל 25 מינים קרובים כולל מיני האחות שהתגלו שלה. בנוסף, האקולוגיה של מינים רבים Pristionchus כולל פ פקיפיקוס היא שאנחנוll מוגדר עם מינים רבים ועכשיו לאחר תואר שיתוף עמותה necromenic עם חיפושיות חיפושית, שורה הם חולקים לעתים קרובות עם מינים אחרים נמטודות 18. פ פקיפיקוס ולכן מספק מערכת מודל מצוינת כדי לנתח את ההתפתחות של התנהגויות רומן והמשמעות האקולוגית שלהם.
על מנת לנתח את הרגלי התזונה הם טורפים במינים נמטודות כגון פ פקיפיקוס פתחו מספר מבחני התנהגות חדשניים התבוננות קלה וכימות של פעולות טורפים. כפי P. פקיפיקוס מציג מבנה פה דימורפית, המשפיע התנהגות טורפים מאוד, זיהוי של morphotype הנכונה הוא 1,2 חיונית. מורף stenostomatous פה הצר מכיל שן גב בוטה יחיד ואינו לעסוק בכל האכלה טורפת. לחלופין, מורף eurystomatous הרחב פה כולל שן גב הרבה יותר גדול בצורת טפר נוסף מנוגדותשן תת-גחון, אשר מפעיל יחדיו כדי לפתוח את לציפורן של טרפם ביעילות. היחס בין eurystomatous טורף לטופס stenostomatous שאינו הטורפים משתנה בין מיני Pristionchus וגם בתוך פ פקיפיקוס, לעומת זאת, אחוז מהפה eurystomatous מורף ב פ סוג זן פראי פקיפיקוס (PS312) הוא בדרך כלל 70 - 90% 2. בנוסף, יחסי טופס פה עשויים להשתנות בהתאם שונה והשפעות סביבתיות (הן ידועות, כוללים הרעבה וכמה מולקולה קטנה איתות כמו גם גורמים לא ידועים), ובכך זיהוי נכון ובידוד של טופס פי eurystomatous טורפים חיוני מבחני טורפים מוצלחים.
לצד התיאור של טופס הפה הטורף פתחנו "assay ביס" להתבוננות ישירה וכימות של התנהגויות טורפים כולל נושך, הרג האכלת אירועים. הנה נמטודות טרף מבודדת באמצעות מסנןing של תרבויות מורעבות חדש נחשף פ מבוגר טורפים פקיפיקוס, אשר הם נצפו יחד במהלך פרק זמן קצר. בנוסף, אנו גם פתחנו "assay גופה" גבוהה תפוקה כדי להקל לסינון מהיר של התנהגות טורפים באמצעות תצפית עקיפה של אירועים טורפים. זו מנצלת את הנוכחות של גופות זחל ככלי למסך הטריפה. מבחני שניהם מספקים שיטות קלות דיר ביותר עבור צפייה למדידת התנהגות טורפים במינים נמטודות כגון פ פקיפיקוס.
פרוטוקול
1. טופס הפה phenotyping
- זיהוי טופס פה על רפידות Agarose
הערה: כדי להמחיש את morphs הפה נמטודות, לשתק את התולעים עם טיפול הרדמה קלה על כריות agarose ולבחון כדלקמן.- לצמוח ולשמור על תרבויות נמטודות כגון פ פקיפיקוס ב -6 ס"מ התקשורת צמיחה נמטודות סטנדרטי (NGM) צלחות ניזונים מדשאה בקטריאלי של E. coli OP50 19.
- הפוך רפידות agarose ידי הוספת הראשונה agarose 0.06 גרם עד 3 מ"ל H 2 O בתוך שפופרת 15 מ"ל לעשות 3 מ"ל 2% פתרון agarose. זה יכול להיות מאוחסן במשך עד שנה ב 4 ° C.
- מערבבים וממיסים את agarose ביסודיות במיקרוגל או לחילופין להשתמש גוש חום מוגדר> 88 ° C.
- לאחר נמס לגמרי, מוסיפים 10 μl של פתרון אזיד הנתרן 10% אל agarose ומערבבים היטב. זהירות: אזיד הנתרן יבש הוא מגיב כל הטפסים הם רעילים.
- באמצעות 1 מ"לmicropipette, במקום ירידה של לא פחות מ -300 μl של תמהיל אזיד agarose נוזלי על באמצע שקופיות מיקרוסקופ זכוכית רגילה.
- לפני אגר מתקרר, במהירות למקום המיקרוסקופ שקופית שנייה על גבי הירידה כדי לשטח את agarose המהווה כרית בקירור. חזור על פעולה עבור רפידות רבות ככל הנדרש.
- רק לפני השימוש, קליפת לגזרים את שקופיות מיקרוסקופ זכוכית על ידי הזזה אותם אחד אחר. הערה: אם כריות agarose מוכנים מדי זמן רב מראש הם יכולים להיות יבש יתר על המידה עלול לגרום נזק נמטודות.
- כדי להעביר תולעי רפידות agarose ההרדמה, במקום ירידה של חיץ M9 (2 - 3 μl) על גבי במרכז הכרית. פיק 2 - 3 צעיר פ מבוגרי פקיפיקוס לתוך הירידה של M9 לפני הצבת לכסות להחליק בזהירות מעל הכרית. פ נמטודות פקיפיקוס יהיה משותק ב agarose ומוכן לדמיין.
- מעביר את שקופית מיקרוסקופ המכילה את התולעת הרדימה אל מיקרוסקופ המתאיםnd להתבונן תחת אופטיקה Nomarski 63X. לסווג זהויות מורף מבוסס על התכונות הבאות: הנוכחות של שן תת-גחון נוסף, שן גב מוגדל ופתיחת פה רחבה מעידה על חית מורף הפה eurystomatous, בעוד שנוכחות שן גב יחיד ופתיחת פה צרה מצביעה על stenostomatous בעלי חיים (איור 1).
הערה: על מנת לשמור על בריאות החיה, יש לשמור על תולעים על הכרית אגרה לא יותר מ -5 דקות. - לאחר זיהוי מורף הפה, לשחזר או נמטודות eurystomatous או stenostomatous כנדרש על ידי הסרת להחליק את המכסה על ידי הזזה בעדינות אותה כרית agarose. בזהירות להרים את החיות שנבחרו מפנקס agarose (E. coli OP50 ניתן להשתמש על הבחירה על מנת להבטיח את stickier) לצלחות NGM טריות. אפשר התאוששות מההרדמה עד התנהגות ניע נורמלית חדשה שעליו חיות מוכנות מבחני טורפים נוספים.
- ראפיד הפה phenotyping
הערה: לחילופין, עם יותר ניסיון, סוג טופס הפה ניתן assayed ללא צורך בכל טיפול הרדמה באמצעות סטראו עם הגדלה גבוהה (150X).- נמטודות מקום על צלחות תקן NGM עם דשא בקטריאלי של E. coli OP50 על אזור צפיית מיקרוסקופ.
- זיהוי הבדלים בגודל ורוחב פה. הערה: בהגדלה זו לא שן כמו מבנים ניתנים לצפייה ולכן זיהוי מורף פה מבוסס על פה רחב מול פה צר.
Assay תנשך 2.
הערה: מבחני כסיסה להתיר ניתוח התנהגות טורפים מפורט.
- לצמוח ולשמור על תרבויות נמטודות על צלחות תקן NGM (6 ס"מ) ולהאכיל על הדשא בקטריאלי של E. coli OP50 19.
- הפוך צלחות assay ידי גידול כמות גדולה של זחלים נמטודות טרף נבחר כגון ג elegans או אלternatively טרף מתאים אקולוגי רלוונטי. הערה: מבוגר ג elegans הם גדולים מדי כדי להיות טרף מתאים ולכן חשוב להשתמש בשלב הזחל.
- לשמור על ג elegans או מיני טרף פוטנציאליים אחרים על צלחות תקן NGM ולהאכיל על דשא בקטריאלי של E. coli OP50 עד האוכלוסייה רעב טרי, והתוצאה היא שפע של הזחלים L1 צעירים.
הערה: הזמן רעב תלוי רבים גורמים סביבתיים הניסיונות, כוללים מספר נמטודות להשתמש כדי להפעיל את התרבות, את כמות E. coli OP50 הוסיף, ואת טמפרטורת הסביבה.
- לשמור על ג elegans או מיני טרף פוטנציאליים אחרים על צלחות תקן NGM ולהאכיל על דשא בקטריאלי של E. coli OP50 עד האוכלוסייה רעב טרי, והתוצאה היא שפע של הזחלים L1 צעירים.
- לשטוף טרי מורעבות ארבע או יותר צלחות טרף עם M9 ולהעביר פתרון תולעת דרך שני מסננים 20 מיקרומטר להסיר את כל בעלי החיים הגדולים וכל ביצים הנותרות לפני האיסוף בתוך שפופרת 15 מיליליטר. רק זחלים קטנים צריכים להישאר הפתרון.
- כדי צורה כדורית זחל בצנטריפוגה הטרף המסונן ב 377 XG דקות 1.
- פיפטה 3 μl של גלולת תולעת טהורה לצלחת 6 סנטימטרים NGM ללא E. coli OP50 בהווה לחכות לפחות 30 דקות עבור הזחלים להתפזר מספיק כדי ליצור צלחת assay.
הערה: 3 μl של גלולת תולעת טהורה על צלחות assay תקן מכיל> זחלים טרפים 3,000. זה מספיק כדי ליצור קשר תכוף בין טורפים ונטרפים. - נמטודות טורפות מסך עבור מורף הפה הנדרש (פרוטוקול 1).
- שימוש בטכניקות לקטוף תולעת סטנדרטית סטראו אור 19, להעביר טורפים מסווגים כראוי על צלחת assay. תשמור על עצמך כדי להעביר חיידקי OP50 כמה שפחות לצלחת assay בעת העברת טורפים כדי למזער זיהום חיידקים. חכה 15 דקות כדי לאפשר את התולעת להתאושש מן הלחץ של מועברים ולבדוק להתנהגות ניע wild-type כדי להבטיח תולעים לא ניזוקו מההעברה.
הערה: אין צורך להרעיב פ pacificus, כפי שהם מאוד טורפים יעילים של זחלים נמטודות אחרים גם כאשר מוזן היטב על חיידקים. - לאחר התאוששות, להתבונן הטורף באמצעות סטראו אור במשך 10 דקות. עם ציוד זה, מלאו אחר ולאפיין אירועי האכלה ברורים, כגון נושך, מאופיין טורף הגבלת התנועה של הטרף; להרוג, שבו על ידי פתיחה לציפורן הטרף מזוהה; והאכלה, מסווג על ידי צריכת נצפה של הקרביים טרף (איור 2 א, ב 'ו-סרט 1).
- חזור על assay ידי הקרנת והתבוננות מינימום של 10 נמטודות טורפות הפרט כדי להבטיח דיוק.
Assay Corpse 3.
הערה: מבחני Corpse להקל על כימות מהיר יותר של התנהגות טורפים.
- לצמוח ולשמור על תרבויות נמטודות על צלחות תקן NGM ולהאכיל על l בקטריאלימלען של E. coli OP50 19. צור triplicates של צלחות assay כאמור (פרוטוקול 2.1 - 2.5).
- נמטודות טורפות מסך עבור מורף הפה נדרש כמתואר בפרוטוקול 1. שימוש לקטוף טכניקות תולעת רגילה וגם נמטודות טורפות אור סטראו העברת 5 עם מורף הפה נדרש כל צלחת assay. השאר טורפים יחד עם הטרף עבור שעה 2.
- לאחר 2 מסך hr הצלחת assay עבור נוכחות של גופות רוקן (תרשים 2B ו- C). זיהוי גופות מהיעדרם של תנועתיות יחד עם פגמים מורפולוגיים ברורים כולל דולף קרבי או חסר שברי תולעת.
4. ניתוח של בלוע ותנועת Tooth
- לצמוח ולשמור על תרבויות נמטודות על צלחות תקן NGM ולהאכיל על הדשא בקטריאלי של E. coli OP50 19. צור צלחות assay כאמור (פרוטוקול 2.1 - 2.5). אם 6 ס"מ סטנדרטיצלחות NGM לא מתאימים בין המטרה לבין הבמה מיקרוסקופ, השתמש במכסה של בצלחות פטרי קטן 35 מ"מ המכיל 2 מ"ל NGM כחלופה מתאימה.
- נמטודות טורפות מסך עבור מורף הפה נדרש כמתואר בפרוטוקול 1. באמצעות תולעת תקן לקטוף טכניקות סטראו אור, להעביר טורף יחיד מסווג בצורה נכונה על צלחת assay. חכה 15 דקות כדי לאפשר את התולעת להתאושש מן הלחץ של העברה.
- תצפיות על בעלי חיים טורפים על מיקרוסקופ ב 40 - 63X Normaski, עם מצלמה במהירות גבוהה (סרטים 2 ו -3). שאיבה בלוע להקליט השן תנועה למעלה מ -15 שניות, בתדר 50 הרץ ב 20 חיות לפחות על מנת להבטיח כימות מדויק. Replay רשמה סרטים במהירות הרצויה כדי לספור משאבות בודדות ואירועי שן.
הערה: שאיבה הוא ציינה הקורפוס, הממוקם באמצע של הלוע, בעוד תנועת שן ניתן לזהות בפתיחת הפה והוא ob רקמוגש בין השן הגבה.
תוצאות
בעקבות זיהוי מוצלח של מורף הפה המתאים פ פקיפיקוס, הבדלים ברורים בין חיות eurystomatous ו stenostomatous ניתן לאתר (איור 3) עם חי eurystomatous רק העוסקות בהעברת התנהגות. אצל בעלי חיים stenostomatous שההתנהגות הזאת להיות מורחק לחלוטין. יתר על כן, הבדלי שאיבת פעילות בלוע שן של חיות eurystomatous על חיידקי טרף (איור 4 וסרטים 2 ו -3) ניכרים גם. בעוד האכלה טורפת, את קצב השאיבה מצטמצם מתחת לזה שנצפה במהלך האכלת חיידקים ותנועת שן הוא זוהה אחד יחס אחד עם שאיבת הבלוע. זה מעיד באופן פוטנציאלי של מנגנוני ויסות מפתח ויסות תגובה התנהגותית כדי שונות דיאטה.
s / ftp_upload / 54,404 / 54404fig1.jpg "/>
איור 1. פ יש פקיפיקוס פה dimorphism המשפיע האכלה התנהגות. (א) טופס הפה eurystomatous מסוגל טריפה ויש לו פתיחת פה רחבה עם שן הגבי גדול בצורת טפר (שקר בצבע אדום) ו- (ב) שן תת-גחון בצורת וו יריב גדול (שקר בצבע כחול). (ג) טופס הפה stenostomatous הוא מסוגל רק כדי להאכיל על חיידקים ויש לו פתיחת פה צרה עם שן גב בצורת צור (שווא בצבע אדום) ו- (ד) לא שן תת-גחון (*). תמונות Normaski הן 63X וברי מידה מייצגת 10 מיקרומטר. לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 2. מבחני טריפה. (א) פ פקיפיקוס נושך והורג את הזחלים של נמטודות אחרות כגון ג elegans. (ב) מבחני נושך, מספר bitesby טורפים (*) ניתן לצפות באמצעות סטראו אור והרג מוצלח האכלת אירועים גם מוקלטים. גופות הן גם נראו בבירור (עיגולים). (ג) עבור מבחני גופה, פגרי זחל (חיצים) ניתן בקלות זיהו לעומת חי זחלים. סרגל קנה מידה מייצג 1 מ"מ B ו- 150 מיקרומטר ב C. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 3. תוצאות של נשיכה מבחני Corpse על ג elegans טרף. (א) התנהגות לנשוך רק ניכר בצורת הפה eurystomatous עם התנהגות זו אינה מוצגת בחיות stenostomatous. שגיאת עמודה מייצגת סטיית התקן של 10 חזרות. (ב) בד בבד עם שום התנהגות נשכנית ניכרה מבעלי חי stenostomatous, מבחני גופה חושפים גם פגרים רק על צלחות assay של חיות eurystomatous. שגיאת עמודה מייצגת סטיית התקן של 5 חזרות. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 4. Eurystomatous לשואב דרג שן תנועה במשך טורפי האכלה. תנועת שן הוא ציין רק בעוד חיות eurystomatous עוסקות האכלה טורפת. זה גם עולה בקנה אחד עם ירידת שאיבת בלוע. שגיאת עמודה מייצגת סטיית התקן של 10 חזרות. יעד href = "https://www.jove.com/files/ftp_upload/54404/54404fig4large.jpg" = "_ blank"> לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
סרט 1. תצפית של הריגת התנהגות עבור Assay תנשך באמצעות אור סטראו. (קליק ימני להוריד).
סרט מצלמה מהירה סרט 2. של פ פקיפיקוס הרג ג elegans זחלים. (קליק ימני להוריד).
המודעה / 54,404 / 54404movie3.jpg "/>
סרט 3. גדלת המצלמה המהירה של תנועת שן במהלך הטריפה. (קליק ימני להוריד).
דיון
נמטודות לספק מערכת רב עוצמה להבנת לנוירוביולוגיה והתנהגות עם ג elegans עד כה להיות הכלי העיקרי. עם זאת, מינים רבים, כולל נמטודות פ התנהגויות תצוגה פקיפיקוס, אשר נעדרות או להשתנות מורכבות מן ג אורגניזם המודל elegans ולכן להעלות שאלות מרתקות לגבי האבולוציה ורגולציה של התנהגויות אלו. אחת התנהגויות נוספות כגון נמצאו במינים נמטודות רבים אחרים, כוללים פ פקיפיקוס הוא היכולת להשלים את תזונת החיידקים שלהם על ידי עוסקי האכלת טורפי 1, 20. יש אפוא פתחנו ותארנו פרוטוקול מפורט לאפיון קל ומהיר של התנהגויות טורפים לא מוסברות בעבר אלה נמטודות.
ראשית, ספקנו שיטות למסך וריאציות האכלת מנגנון בתוך הפה נמטודות. זיהוי של סוג הפה הנכון הוא של חיוני ראשוןTEP עבור מבחני טריפה מוצלחים כמו, לפחות בתוך סוג Pristionchus רק חיות eurystomatous מסוגלות האכלה טורפת. עדיף לזהות פי morphs עם "phenotyping פה המהיר" הפרוטוקול המתואר בפרוטוקול 1.2 כמו שיטה זו היא הרבה פחות פולשני ולכן זה פחות סביר כי התנהגויות טורפים עשויות להיות מוטרדות. עם זאת, מומלץ להכיר הראשונה עם המבנים ושפה ידי הזדהות עם חיות הרדימו על רפידות אגרו (פרוטוקול 1.1).
בעקבות זיהוי של מורף הפה הרצוי, שתארנו שני מבחנים לכימות האכלה טורפת. אלה הם "assay גופה" מהיר, גבוהה תפוקה (פרוטוקול 3) וכן זמן רב יותר אבל יותר מעמיק ניתוח התנהגות הדרך "assay הביס" (פרוטוקול 2). שני פרוטוקולים אלה הם מאוד גמישים המאפשרים מספר שינויים כדי לייעל את מבחני תלוי experimenדרישות טל. עבור מבחני ביס באמצעות פ טורפים פקיפיקוס על ג elegans טרף, תצפיות של אינטראקציות התנהגותיות טורפות עבור חלון זמן של 10 דקות היו די כדי לכמת כמות משמעותית של עקיצות יחד עם אירועי האכלה אחרים. עבור "מבחני גופה" שוב ניצול פ טורפים פקיפיקוס על ג elegans טרף, 5 טורפים עבור שעה 2 מיוצר מספרי גופה לכימות ועקביים בקלות המאפשר ניתוח התנהגות מהיר. עם זאת, יש לציין מינים שונים של מהלך נמטודות טורף במהירויות שונות, לאכול בשיעורים שונים ובאופן כללי להפגין מגוון גדול בהתנהגויות אחרות 1. בנוסף, מיני טרף שונים ניתן לאכול גם בשיעורים שונים מסיבות דומות. לכן מומלץ לבצע אופטימיזציה של המבחנים מבוססים על המינים נמטודות נבדקים הם טורפים ונטרפים, וכן לכל הבדלים בתנאים סביבתיים. במהלך שני "ביס" ו "חילמבחני דואר "זה קריטי, כי הן טרף טורפים הם בריאים, כפי הדגיש או טורפים פצועים לא יהרגו ביעילות. בנוסף, צלחות assay טריות חיוניות כמו צלחות מבוגרים יכול להיות התייבשו אשר משפיעה לרעה על הבריאות של נמטודות המובילה שגוי מבחנים. כמו כן יש לקוות כי שיפורים עתידיים מבחני טורפים אלה יוכלו לנצל את השיפורים האחרונים בטכנולוגיה כדי להפוך את מרבית הניתוח כמו הושג על חקירת התנהגויות רבות שנצפו C. elegans 21, 22. נכון לעכשיו בעיות צפויות להתעורר נמטודות כגון פ פקיפיקוס כפי שהם מופיעים הרבה יותר רגישים כדי ליצור קשר, מה שהופך בידוד וקיבוע בתאי microfluidic עשויים לבטל האכלה טורפת. התגברות זו עשויה להוכיח מאתגר אבל תקל נמטודות פרט שיוקרה עבור מתוחכם טורפים התנהגויות.
לבסוף, יש לנו גם בתנאי שיטות FOr בחינת מנגנון האכלה נמטודות עצמה לסייע להשוואה בין טורפים חיידקי מצבי האכלה על ידי כימות קינטיקה השן השאיבה בלוע באמצעות מצלמה במהירות גבוהה (פרוטוקול 4). כימות של שיעורי השאיבה בלוע ב C. elegans נוצל כדי לפקח האכלה במשך שנים רבות 23, לעומת זאת, ג elegans חסר כל צורה של הפה denticle וגם חסר התנהגויות טורפות. באמצעות שילוב של כימות של בלוע שאיבה עם זה של פעילות שן, כל עצבוב של השיניים ספציפיות טריפה ניתן לצפות גם. בשל ההגדלה הנדרשת כדי להתבונן בתנועת שן החיות לעתים קרובות לעזוב את מישור המוקד, ולכן הוא בדרך כלל רק ניתן לראות את השן עבור חלונות זמן קצרה. בנוסף, שלא כמו ג elegans, הלוע של פ פקיפיקוס לא לשאוב ברציפות, אלא עוסק לחשים של שאיבה והאכלה. לכן, עבור pum בלוע מדויקשיעורי פינג בזמן ההאכלה שייקבעו, חשוב להקליט 15 שניות של האכלה רציפה.
שיטות אלה שהוצגו כאן ולכן מספקות את המסגרת הראשונה על חקירת התנהגויות טורפות במערכות נמטודות. יתר על כן, הם יכולים גם להיות בעל יכולת הסתגלות לשימוש בחקירת אינטראקציות אחרות בתוך המערכת האקולוגית נמטודות כוללת השפעת אורגניזמים רלוונטי גם מבחינה אקולוגית על טריפה כולל מיקרואורגניזמים, פטריות קרדית . לכן הם מספקים אמצעי לנתח כיצד התנהגויות טורפים אלה מוסדרות, וכיצד הם עשויים התפתחו גם המשמעות האקולוגית שלהם.
גילויים
המחברים אינם מצהירים על אינטרסים פיננסיים או מתחרים.
תודות
אנו מודים לד"ר דניאל באמברגר על תמונת התנהגות הטריפה. עבודה זו מומנה על ידי אגודת מקס פלאנק.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| מסנני רשת ניילון (20 & # 181; m) | Merck Millipore Ltd | NY2004700 | משמש לסינון תולעים רק משאיר זחלים לשימוש כטרף. |
| משפך PP למסנן (54 מ"מ) | דוראן | 292215003 | משמש לסינון תולעים רק משאיר זחלים לשימוש כטרף. |
| צלחת פטרי קטנה (35/10 מ"מ) | גריינר ביו-וואן | 627102 | להדמיה במצלמה במהירות גבוהה |
| Zeiss SteREO Discovery V12 | לזיהוי צורת הפה | ||
| Axio-Imager A1 | לזיהוי צורת הפה | ||
| שקופיות זכוכית | Roth | H869 | |
| כיסוי מחליק | Roth | 657 | |
| Motion Scope M3 מצלמה במהירות גבוהה | IDT | מצלמה במהירות גבוהה | |
| זום וידאו 44 ENG 1/2 אינץ' 0.5X עד 2.4X | Zeis | 452984-0000-000 | זום מצלמה במהירות גבוהה |
| מדיום גידול נמטודה (NGM) מרכיבים: | |||
| אגר | רוט | 5210.2 | CAS-Nr. 9002-18-0 |
| נתרן כלורי (NaCl) | רוט | 3957 | CAS-Nr. 7647-14-5 |
| בקטו טריפטון | BD | 211699 | לוט 4316614 |
| סידן כלוריד דיהידראט (CaCl<תת>2) | סיגמא-אולדריץ' | C3306 | CAS-Nr. 10035-04-8 |
| כולסטרול מלנולין | סיגמא-אולדריץ | ' F 26732 00050 | CAS-Nr. 57-88-5 |
| מגנזיום סולפט הפטהידרט (MgSO4) | Merck | 1,058,861,000 | CAS-Nr. 10034-99-8 |
| אשלגן דימימן פוספט (KH2PO4) | ACROS organics | 271080025 | CAS-Nr. 7778-77-0 |
| 6 ס"מ צלחת פטרי | גריינר ביו-וואן | 628102 | |
| 3.5 ס"מ צלחת פטרי | גריינר ביו-וואן | 627102 | |
| M9 רכיבים: | |||
| אשלגן דימימן פוספט (KH<תת>2PO4) | ACROS organics | 271080025 | CAS-Nr. 7778-77-0 |
| נתרן מימן פוספט הפטאהידראט (NaHPO<תת>4) | סיגמא-אולדריץ' | S9390-500G-D | CAS-NR. 7782-85-6 |
| נתרן כלורי (NaCl) | רוט | 3957 | CAS-Nr. 7647-14-5 |
מקורות
- Wilecki, M., Lightfoot, J. W., Susoy, V., Sommer, R. J. Predatory feeding behaviour in Pristionchus nematodes is dependent on phenotypic plasticity and induced by serotonin. J Exp Biol. 218 (Pt 9), 1306-1313 (2015).
- Ragsdale, E. J., Muller, M. R., Rodelsperger, C., Sommer, R. J. A Developmental Switch Coupled to the Evolution of Plasticity Acts through a Sulfatase. Cell. 155 (4), 922-933 (2013).
- Goodman, M. B. Mechanosensation. WormBook. , 1-14 (2006).
- Rankin, C. H. Nematode behavior: the taste of success, the smell of danger! Curr Biol. 16 (3), R89-R91 (2006).
- Beverly, M., Anbil, S., Sengupta, P. Degeneracy and neuromodulation among thermosensory neurons contribute to robust thermosensory behaviors in Caenorhabditis elegans. J Neurosci. 31 (32), 11718-11727 (2011).
- Kimata, T., Sasakura, H., Ohnishi, N., Nishio, N., Mori, I. Thermotaxis of C. elegans as a model for temperature perception, neural information processing and neural plasticity. Worm. 1 (1), 31-41 (2012).
- Vidal-Gadea, A., et al. Magnetosensitive neurons mediate geomagnetic orientation in Caenorhabditis elegans. Elife. 4, (2015).
- Chute, C. D., Srinivasan, J. Chemical mating cues in C. elegans. Semin Cell Dev Biol. 33, 18-24 (2014).
- Sherlekar, A. L., Lints, R. Nematode Tango Milonguero - the C. elegans male's search for the hermaphrodite vulva. Semin Cell Dev Biol. 33, 34-41 (2014).
- Sasakura, H., Mori, I. Behavioral plasticity, learning, and memory in C. elegans. Curr Opin Neurobiol. 23 (1), 92-99 (2013).
- Avery, L., You, Y. J. C. elegans feeding. WormBook. , 1-23 (2012).
- Bumbarger, D. J., Riebesell, M., Rodelsperger, C., Sommer, R. J. System-wide Rewiring Underlies Behavioral Differences in Predatory and Bacterial-Feeding Nematodes. Cell. 152 (1-2), 109-119 (2013).
- Dieterich, C., et al. The Pristionchus pacificus genome provides a unique perspective on nematode lifestyle and parasitism. Nature Genetics. 40 (10), 1193-1198 (2008).
- Schlager, B., Wang, X. Y., Braach, G., Sommer, R. J. Molecular Cloning of a Dominant Roller Mutant and Establishment of DNA-Mediated Transformation in the Nematode Pristionchus pacificus. Genesis. 47 (5), 300-304 (2009).
- Witte, H., et al. Gene inactivation using the CRISPR/Cas9 system in the nematode Pristionchus pacificus. Dev Genes Evol. 225 (1), 55-62 (2015).
- Lo, T. W., et al. Precise and Heritable Genome Editing in Evolutionarily Diverse Nematodes Using TALENs and CRISPR/Cas9 to Engineer Insertions and Deletions. Genetics. 195 (2), 331-348 (2013).
- Sommer, R. J., McGaughran, A. The nematode Pristionchus pacificus as a model system for integrative studies in evolutionary biology. Molecular Ecology. 22 (9), 2380-2393 (2013).
- Herrmann, M., et al. The nematode Pristionchus pacificus (Nematoda : Diplogastridae) is associated with the oriental beetle Exomala orientalis (Coleoptera:Scarabaeidae) in Japan. Zoological Science. 24 (9), 883-889 (2007).
- Chaudhuri, J., Parihar, M., Pires-daSilva, A. An Introduction to Worm Lab: from Culturing Worms to Mutagenesis. J Vis Exp. (47), e2293(2011).
- Serobyan, V., Ragsdale, E. J., Sommer, R. J. Adaptive value of a predatory mouth-form in a dimorphic nematode. Proc. R. Soc. B Biol. Sci. 281, 20141334(2014).
- Albrecht, D. R., Bargmann, C. I. High-content behavioral analysis of Caenorhabditis elegans in precise spatiotemporal chemical environments. Nat Methods. 8 (7), 599-605 (2011).
- Yeminin, E., Jucikas, T., Grundy, L. J., Brown, A. E., Schafer, W. R. A database of Caenorhabditis elegans behavioral phenotypes. Nat Methods. 9 (10), 877-879 (2013).
- Raizen, D. M., Lee, R. Y. N., Avery, L. Interacting Genes Required for Pharyngeal Excitation by Motor Neuron MC in Caenorhabditis elegans. Genetics. 141 (4), 1365-1382 (1995).
הדפסות חוזרות והרשאות
