איתור תיוג זיקה של אנדוגני רצפטורים מעוברים דג הזברה

סיכום

מתוארת טכניקה חדשה לאיתור קולטנים אנדוגניים בשפע נמוך הקיימים בעוברי דג הזברה. קראנו לו AFLIP מכיוון שהוא מורכב מתיוג זיקה של הקולטן על ידי הליגנד שלו המקושר למשקעים חיסוניים.

תקציר

על ידי שילוב הכוחות של Affinity Labeling ו-Immunoprecipitation (AFLIP), יושמה טכניקה לזיהוי קולטנים בשפע נמוך בעוברי דג הזברה. טכניקה זו מנצלת את הסלקטיביות והרגישות המוענקות על ידי תיוג זיקה של קולטן נתון על ידי הליגנד שלו עם הספציפיות של המשקעים החיסוניים. השתמשנו ב-AFLIP כדי לזהות את קולטן TGF-β מסוג III (TGFBR3), הידוע גם בשם בטאגליקן, במהלך התפתחות מוקדמת של דג הזברה. AFLIP היה חיוני באימות היעילות של פנוטיפ דג זברה מורפנט TGFBR3. בשלב הראשון מכינים תמציות חלבון עוברי ומשמשות ליצירת ¹²⁵קומפלקסים I-TGF-β2-TGFBR3 המטוהרים על ידי משקעים חיסוניים. מאוחר יותר, קומפלקסים אלה מקושרים קוולנטית ונחשפים באמצעות הפרדת SDS-PAGE וזיהוי אוטורדיוגרפיה. טכניקה זו דורשת זמינות של ליגנד מסומן עבור הקולטן ונוגדן ספציפי כנגדו, והיא תותאם בקלות לזיהוי כל גורם גדילה או קולטן ציטוקינים העומד בדרישות אלה.

מבוא

זיהוי ספציפי של חלבונים המתבטאים במהלך ההתפתחות העוברית נדרש כדי לאמת פרופילי ביטוי המתקבלים על ידי מדידת ה-mRNA הקוגנטיים שלהם עם RT-PCR או הכלאה במקום (ISH). זה מושג בדרך כלל על ידי כתם מערבי של תמציות עוברים ואחריו זיהוי עם נוגדנים ספציפיים. עם זאת, קשה ליישם גישה זו על חלבונים הנמצאים בשפע נמוך מאוד, או שיש להם תכונות המעכבות את העברתם הכמותית במהלך הכתמתם. בטאגליקן, הידוע גם כקולטן β גורם גדילה טרנספורמטיבי מסוג III (TGF-β) (TGFBR3), הוא דוגמה לקשיים אלה. TGFBR3 הוא פרוטאוגליקן ממברנה במשרה חלקית הקושר TGF-β דרך חלבון הליבה שלו¹, עם זיקה גבוהה יותר באופן משמעותי לאיזופורם TGF-β2, תכונה המבדילה אותו מכל חלבון קושר TGF-β^{אחר 2}. TGFBR3 בדג הזברה מתבטא מ-8 hpf ואילך, ומגיע למקסימום של 72 hpf, כפי שזוהה על ידי RT-PCR של ה-mRNA³ שלו.

עם זאת, למרות זמינותו של נוגדן ספציפי מאוד³, כל ניסיון לזהות את התוצר המתורגם שלו על ידי Western Blot לא צלח. מתוך התחשבות באופי הפרוטאוגליקני של TGFBR3, כמו גם השפע הנמוך המשוער עשויים להיות אחראים לכישלון זה, הומצאה שיטת זיהוי, AFLIP, המנצלת את הזיקה הגבוהה של TGFBR3 ל-TGF-β2. בשיטה זו, תמצית חלבון מעוברים מאוגדים מורשית לקשור באופן ספציפי ¹²⁵TGF-β2 המסומנים ב-I, וקומפלקסי הקולטן-ליגנד מטוהרים על ידי משקעים חיסוניים ומקושרים לפני ההפרדה על ידי SDS-PAGE. דפוסי הנדידה שנצפו על ידי אוטורדיוגרפיה של הג'לים חשפו את נוכחותם ואופיים של מיני הקולטנים המסומנים. גישה זו משלבת את הספציפיות של ליגנד של תיוג זיקה עם משקעים חיסוניים על ידי נוגדנים ספציפיים, הגדלת טווח הזיהוי, הימנעות מכתמי העברה לא יעילים של TGFBR3. בשל תכונותיו הטבועות, בדיקת AFLIP אינה בדיקה כמותית אך ניתן להשתמש בה כדי לאמוד בביטחון הבדלים ניסויים יחסיים בקולטן המנותח.

פרוטוקול

כל הניסויים שבוצעו בחיות אושרו על ידי הוועדה לטיפול בבעלי חיים במעבדה ושימוש של האוניברסיטה הלאומית האוטונומית של מקסיקו (UNAM), תחת מספר CICUAL-Protocol: FLC40-14. (CICUAL: "פסקה Comité Institucional אל Cuidado y שימוש עכשווי de los Animales דה Laboratorio del Instituto de Celular Fisiologìa, México Universidad de הלאומית האוטונומית").

1. הכנת תמצית חלבון העובר

1. אסוף 100 - 200 עובריים עבור כל תנאים להשוות (morphants לעומת סוג בר) בשלב רצוי עבור שלאחר הפריה למשל 72 שעות (hpf).
2. עוברת מקום צלחות פטרי המכילות מי דגים (ראה טבלה 1) באופן ידני dechorionate עובר באמצעות קנס שקצו מלקחיים. הימנע משימוש pronase במהלך שלב זה (או כל פרוטאז אחר ברחבי לפרוטוקול) כפי שהוא עשוי לעכל את הקולטן הממוקד.
3. עוברים מקום בתוך שפופרת 1.5 מ"ל microfuge ולשטוף עוברים twקרח עם פתרון חיץ פוספט 1x (PBS) (ראו טבלה 1).
4. הוסף 500 μl של חיץ deyolk (ראה טבלה 1).
5. שחרר ביותר של חלמון ידי pipetting בעדינות מעלה ומטה (כ -30 - 40 פעמים) את העוברים בתמיסה. במשך 72 hpf ו -48 עובר hpf להשתמש טיפי פיפטה כחולים וצהובים, בהתאמה. טיפים צהובים ייתכן שיהיו צורך לחתוך מעט כדי למנוע השמדה עוברת. מהדורת החלמון המוצלחת יכולה להיבדק על ידי התבוננות עוברים תחת מיקרוסקופ.
6. איסוף עוברים על ידי צנטריפוגה ב 600 XG במשך 15 שניות.
7. בטל supernatant בזהירות באמצעות pipet.
8. לשטוף עוברים פעמיים עם 500 חיץ כביסה μl (ראה טבלה 1) על ידי vortexing בעדינות במהירות הנמוכה ביותר.
9. איסוף עוברים על ידי צנטריפוגה ב 600 XG במשך 15 שניות.
10. החל מכאן, להמשיך את ההליך ב 4 ° C..
11. בטל supernatant בזהירות באמצעות pipet.
12. עוברים Resuspend ב 350 μl של חיץ תמוגה (ראה טבלה 1) ו homogenize באמצעות עלי פלסטיק.
13. דגירה עוברים lysed 30 דקות עם תסיסה על כיסא נדנדה מבחנה ב 4 מעלות צלזיוס.
14. צנטריפוגה lysed העוברת על 11,000 XG במשך 15 דקות על מנת להסיר שאריות מסיסות.
15. העברת פינת supernatant באמצעות pipet לצינור טרי.
16. לקבוע חלבון הכולל ידי השיטה ברדפורד ^4, או הליך מתאים אחר. אם assay ברדפורד משמש, לבצע את עקומת הכיול בנוכחות ריכוזים המקבילים של המתנות דטרגנטים במאגר תמוגה, כפי שהן גורמות הערכה נמוכה מדי של החלבון ⁴ הסטנדרטי.

2. איתור של חלבון קולטן אנדוגני

1. זיקה סימון Immunoprecipitation (כל השלבים הבאים ב 4 ^מעלות צלסיוס)
   1. מניחים 400 - 500 מיקרוגרם של חלבון העובר סך צינור 1.5 מ"ל microfuge לדלל עד 1 מיקרוגרם / μl עם חיץ 1 (ראה טבלה 1).
      הערה: על מנת לקבל 500 מיקרוגרם של חלבון העובר בסך הכל, כ 100 - 200 עוברים חייבים להיות מעובד בתחילה. 72 hpf עוברים באופן שגרתי להניב ~ 5 מיקרוגרם של חלבון העובר הכולל, וזה מספיק לגילוי betaglycan.
   2. הוספת נפח מספיק של מניות TGF-β2 שכותרתו להגיע לריכוז סופי של 150 בערב, דגירה עם תסיסה על hr נדנדה 2 מבחנה ב 4 מעלות צלזיוס. חייב להיות מתויג TGF-β2 לפני AFLIP הוא התחיל, עם ¹²⁵ ואני בשיטת T chloramine כפי שתואר על ידי Cheifetz et al. ^5.
      זהירות: השתמש מגן כדי לצמצם את החשיפה תוך טיפול ¹²⁵ ואני שכותרתו ליגנד.
   3. הוספת נפח מספיק של נוגדן חי נגד הקולטן של עניין על מנת להגיע דילול 1: 100 ולהמשיך דגירה של עוד 2 שעות ב 4 ° C (דגירה יכולה להיות O / N). זהו דילול אופטימלי של antiserum # 31, ששימשו במחקר זה מתואר במקומות אחרים ^3, אבל תלוי באיכות שלtibody, דילול גדול יותר או קטן יותר עשוי להיות אופטימלי.
   4. הוסף 50 μl של חרוזים מחייבים אימונוגלובולינים מתאימים (למשל, G- חלבון-Sepharose, אשר היה equilibrated בעבר TNTE ו resuspended 1: 5 של נפח המקורי TNTE) דגירה במשך 50 דקות עם תסיסה על כיסא נדנדת מבחנה ב 4 ° ג
   5. לשחזר את החרוזים על ידי microcentrifugation ב 11,000 XG במשך 20 שניות.
   6. בטל supernatant במיכל אשפה רדיואקטיבית המתאימה.
   7. לשטוף שלוש פעמים-חרוזים IP עם 1 מ"ל של חיץ לשטוף IP (ראו טבלה 1), על ידי vortexing ו microcentrifugation ב 11,000 XG במשך 20 שניות בכל פעם.
   8. Resuspend IP-החרוזים 250 μl של חיץ לשטוף IP.
   9. הוסף 1.5 μl של disuccinimidyl suberate (DSS, מומס DMSO ב 10 מ"ג / מ"ל). הכן את פתרון DSS רק לפני השימוש בו בשלב זה.
   10. דגירה במשך 15 דקות ב 4 ° C עם תסיסה.
   11. כדי להרוות את התגובה crosslinking, להוסיף 500 μl of IP לשטוף חיץ, השלימו עם מספיק טריס-Cl-pH 7.4 המניה להגיע 25 מ"מ טריס-Cl. הקבוצות אמינו חופשיות ב טריס ללכוד DSS unreacted.
   12. צנטריפוגה ב 11,000 XG במשך 20 שניות כדי לאסוף IP-חרוזים להשליך supernatant.
   13. Resuspend IP-החרוזים 30 μl של צמצום מאגר Laemmli.
   14. מרתיח דגימות 5 דקות ב 94 מעלות צלזיוס.
   15. לחלופין, לנתח דגימות דלפק גמא באמצעות הפרוטוקול של היצרן.
2. ניתוח מדגם
   1. דגימות בכפוף denaturing SDS-PAGE. השתמש polyacrylamide על האחוז המתאים המסה של הקולט ולהפעיל ג'ל תחת הליך רגיל.
   2. לטבול ג'ל בתמיסה מקבעת (ראה טבלה 1) במשך 30 דקות ב RT.
   3. לשטוף ג'ל עם מים distillated במשך 15 דקות.
   4. מניחים ג'ל בנייר מסנן hydrated בעבר ומכסים בניילון נצמד הסרט.
   5. ג'ל ניקוי על 80 מעלות צלזיוס למשך 1 שעה.
   6. לחשוף ג'ל על scre phosphorimager לבןen ב RT O / N.
   7. סרוק מסך חשוף באמצעות phosphorimager באמצעות הפרוטוקול של היצרן.

תוצאות

איור 1 מציג תוצאה נציג שהושג עם AFLIP. אותות ליין 1 באים ¹²⁵ ליגנד קשרו קוולנטית או חלבון ליבת betaglycan דג הזברה (ליבת BG, מתחת 150 בסמן KDA) או בליבתו BG כי תעובד לצורת proteoglycan שלה על ידי התקשרות של glycosaminoglycans (GAG, למרוח החל 170 kDa לחלק העליון של הג'ל). דפוס זה של הגירה, חלבון ליבה חד בתוספת proteoglycan מרווחת (בשל ההטרוגניות אורך שרשרות GAG), הוא מאפיין של TGFBR3 ^2. מאז DSS אינו לקשר קוולנט...

דיון

השימוש כתם המערבי עם נוגדן ספציפי נגד חלבון של עניין הוא כלי רב ערך כדי ללמוד את ביטוייה ⁷ במהלך embryogenesis. עם זאת, immunoblotting של חלבונים הפערים glycosylated לא היה מוצלח מאוד בשל העברתם יעיל מחייב חלש ממברנות nitrocellulose או PVDF ^8,9.

Proteoglycans הם דוגמה טובה של חיסרון זה, בגלל שרשראות גליקוז המצורפים שלהם קוולנטית (GAG) כי הם טעונים שלילית ואינם נקשרים היטב משני משטחי קלקר או ...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
Disuccinimidyl suberate (DSS)	ThermoFisher Scientific	21555
חלבון G Sepharose 4 זרימה מהירה	GE Healthcare מדעי החיים	17-0618-01
מייבש ג'ל דגם 583	BIO-RAD	1651745
טייפון 9400	GE Healthcare מדעי החיים	63-0055-78
קוברה II מונה גמא אוטומטי	קלטת חשיפה פקארד
	דינמיקה מולקולרית	63-0035-44
NaCl	J.T. Baker	3624
KCl	J.T. Baker	3040
Na2HPO4	J.T. Baker	3828
K2HPO4	J.T. Baker	3246
CH3OH	J.T. Baker	9070
CH3COOH	J.T. Baker	9508
HCHO	J.T. Baker	2106
SDS	סיגמא-אולדריץ'	L4509
EDTA	סיגמא-אולדריץ'	ED
טריטון X-100	סיגמא-אולדריץ'	T9284
CaCl2	Sigma-Aldrich	C3306
NaHCO3	Fisher Scientific	S233
PMSF	Sigma-Aldrich	P7626
Crystal Sea Marine Mix	Marine Enterprises International	http://www.meisalt.com/Crystal-Sea-Marinemix