יישום של קרום חדיר מערכת זיהום כנס מבוססת כדי לחקור את ההשפעות של מופרש בקטריאלי רעלים בתא פונדקאי יונק

Summary

כאן, שיטה באמצעות מערכת זיהום קרום חדירה מבוסס כנס כדי לחקור את ההשפעות של Streptolysin S, רעלן מופרש המיוצר על ידי הקבוצה סטרפטוקוקוס, על קרטינוציטים מתוארת. מערכת זו יכולה בקלות להיות מיושמת בחקר חלבונים חיידקיים מופרשים אחרים על סוגי תא מארח שונים במהלך הדבקה.

Abstract

חיידקים פתוגנים רב מפרישים רעלנים חזקים כדי לסייע וההרס של רקמות מארחות, ליזום שינויי איתות תאי מארח או לתמרן תגובות מערכת חיסוניות במהלך הזיהום. למרות שיטות פותחו כדי לטהר בהצלחה ולהפיק רבים של גורמים הארסיים החשובים אלה, יש עדיין הרבה רעלנים חיידקיים שמבנה ייחודי או שלאחר translational שינויים נרחבים לגרום להם קשה לטהר וללמוד במערכות במבחנה. יתר על כן, גם כאשר הרעלן טהור ניתן להשיג, ישנם אתגרים רבים הקשורים ללימוד ההשפעות הספציפיות של רעלן בתנאים פיסיולוגיים רלוונטיים. רוב במודלי תרבית תאים במבחנה נועדו להעריך את ההשפעות של רעלנים חיידקיים מופרשים בתא פונדקאי לערב דוגרי תאי מארחים עם מנה חד-פעמית של הרעלן. שיטות כאלה גרועים משוערים מה תאים מארחים למעשה ניסיון במהלך זיהום, שם רעלן מיוצר ללא הרף על ידיתאים חיידקיים ניתן לצבור בהדרגה במהלך זיהום. פרוטוקול זה מתאר את העיצוב של קרום חדיר להכניס מערכת מבוססת זיהום חיידקים כדי לחקור את ההשפעות של Streptolysin S, רעלן חזק היוצר על ידי הקבוצה סטרפטוקוקוס, על קרטינוציטים אפיתל אנושיים. מערכת זו הדוקה יותר המחקה את הסביבה הפיזיולוגית הטבעית במהלך זיהום מאשר שיטות שבו הרעלן טהור או supernatants חיידקי מוחלים ישירות לארח תאים. חשוב לציין, שיטה זו מבטלת גם את ההטיה של תגובות מארחות כי הן בשל לכוון קשר בין החיידקים ותאי מארח. מערכת זו נוצלה כדי להעריך את ההשפעות ביעילות של Streptolysin S (SLS) על שלמות קרום מארח, כדאיות הסלולר, ותגובות איתות הסלולר. טכניקה זו יכולה בקלות להיות מיושמת המחקר של גורמים ארסיים מופרשים אחרים על מגוון של סוגי תאי מארח יונקים לחקור את התפקיד הספציפי של ד גורם חיידקי מופרשuring במהלך זיהום.

Introduction

הבנת הפונקציה של גורמים ארסיים חיידקים בהקשר של תא זיהום המארח היא מוקד עיקרי של מחקר בפתוגנזה חיידקים. חיידקים פתוגנים רב פעיל להפריש רעלים וגורמים מסיסים אחרים כדי לסייע וההרס של רקמות מארחות, ליזום שינויי איתות תאי מארח או לתמרן תגובות מערכת חיסוניות במהלך הזיהום ^{1 - 10.} למרות שיטות פותחו כדי לטהר בהצלחה ולהפיק רבים של הגורמים ארסי החשובים האלה למחקר, מוצרי חיידקים כמה יש מבנים ייחודיים או שלאחר translational שינויים נרחבים שהופכים אותם למועמדים סרבנים לשיטות טיהור ועל כן אינו יכול להילמד בבידוד באמצעות במערכות חוץ גופייה . לדוגמא, קבוצת A Streptococcus, הפתוגן חיידקי אחראי המספר עצום של זיהומים החל דלקת לוע אל fasciitis necrotizing לתסמונת הלם רעיל, מייצר מופרשרעלן חיידקים המכונה Streptolysin S (SLS) ^{11 - 17 שנים.} פפטיד ribosomally המיוצר זה מקודד על ידי הגן קשור Streptolysin S (SAG) האשכול, ואת המוצר הבוגר מוערך 2.7 kDa בגודל ^{14 - 17.} Protoxin, המקודד על ידי Saga, משתנה שלאחר translationally ידי אנזימים שונים (SagB, SagC, ו SagD) לייצר בצורה הבוגרת, פונקציונלית ^{15 - 17 שנים.} המורכבות של שינויים אלה שלאחר translational בשילוב עם רצף החומצות האמיניות חריג של הרעלן הפכו את הרעלן עולה בקנה אחד עם כל המאמצים הבהרה טיהור ומבנה כבר ניסו לצאת ^15,17. יש אתגרים אלה המאמצים מסובכים לקבוע את התפקיד הספציפי של רעלן זה בפתוגנזה מארח.

במקרים שבהם הכינו רעלים מטוהרים או גורמים מופרשים אחרים הוא או מורכב או לא אפשרי, מנגנוניםלהבהיר את הפונקציה של מוצרים אלה נחקרה באופן מסורתי תוך הכנת supernatants חיידקים המסונן, אשר חלים מכן לארח תאים ^{18 - 20.} ישנם מספר אתגרים הקשורים הטכניקה הזו. ראשית, רב גורמים המופרשים אלה, כולל SLS, לא לשמור פעילות מקסימלי או עקבית כאשר הם מאוחסנים ויישומים לארח תאים במועד מאוחר יותר. בנוסף, כאשר supernatants נאסף בנקודת זמן אחת ולאחר מכן להחיל לארח תאים, קשה לקבוע את הרלוונטיות פיסיולוגיות להסיק מסקנות ישירות לגבי תהליך ההדבקה הטבעי, שבו גורמים מופרשים מותר לצבור במהלך זיהום על ריכוז רלוונטי מבחינה פיזיולוגית. אתגר שני זה חל לא רק על השימוש של supernatants בקטריאלי, אלא גם את השימוש של רעלים מטוהרים במחקרי תא מארח ^{1 - 3,8.} כדי לטפל בבעיות אלה, inse קרום חדירRT מערכת מבוססת זיהום פותחה כדי להעריך את ההשפעות של SLS בתא פונדקאי בצורה מקיימת פעילות הרעלן אופטימלית וגם מבטלת את המשתנה של מגע ישיר בין חיידקים ותאי מארח. במערכת זו, תאי אפיתל אדם גדלים בשכבה בתא התחתון של תא שני היטב, וחיידקים מוכנסים לתא העליון של אותו היטב. קרום נקבובי (0.4 מיקרומטר נקבוביים) מפריד בין תאים העליונים ותחתונים, המאפשר גורמים מופרשים שיוחלפו בין שני התאים אבל מניעת המעבר של חיידקים. מערכת זו אפשרה הערכה אפקטיבית של תגובות מארחות שהם אך ורק בשל רכיבי חיידקי מופרש מתמשכים תוך ביטול כל תגובות שעלולות להתרחש באמצעות מגע ישיר במהלך סטרפטוקוקלית זיהום קבוצת א '. למרות גורמים חיידקיים המופרשים אחרים מלבד SLS גם יכול לעבור דרך הממברנה נקבובי, השימוש של פנל מוטציה isogenic כולל wild-type (WT), גידול SLS-KNockout (ΔsagA) ו זן השלים סגה (Saga + ΔsagA) מאפשר הערכה מדויקת של תגובות מארחות כי הם בהחלט SLS התלוי ^21.

בעוד שמערכות להוסיף קרום חדירים דומות הועסקו לחקר גורמים המופרשים מעורבים זיהומים נגיפיים, ביולוגית סרטן, נדידת תאי חיסון ^{22 - 26,} מספר מחקרים שכללו אינטראקציות חיידקים עם תאי מארח השתמש בגישה זו ^6,27,28. גם מחקרים אשר העסיקו מערכות כאלה כדי לחקור אינטראקציות בין חיידקים ותאים מארח התמקדו בעיקר על הגירה של תאים דלקתיים או חיידקים דרך monolayer אפיתל או האנדותל מצופה על להכניס קרום חדיר. הקרום החדיר מערכת זיהום כנס המבוססת המתוארים כאן היא שיטה פשוטה ויעילה אשר מסתמכת על הפרדת חיידקים ותאים מארחים באמצעות קרום נקבובי להעריך את effeCTS של הרעלן המופרש, SLS, על שלמות קרום מארח, כדאיות הסלולר, הולכים אותות סלולריים, וגרם תא מארח מופרשים. טכניקה זו יכולה להיות מותאמת ללימוד גורמים ארסיים מופרשים אחרים על מגוון של סוגי תאי מארח יונקים לחקור את התפקיד של גורם חיידקים ספציפי במהלך דלקת.

Protocol

1. תרבית חיידקים

1. צורו זנים מוטנטים isogenic לשמש לחקר הגורם המופרש הספציפי של עניין ^21.
   הערה: זני GASM1T1 5448 מנוצלים עבור ניסויים אלו כללו WT גז ', חתול Δ הסאגה SLS מחסר מוטציה (מקוצר בטקסט כמו הסאגה Δ), ו זן השלים סאגה (מקוצר בטקסט כמו Δ סאגה + סאגה) ^21.
2. הכן תרבויות נוזלי לילה של זני חיידקים עניין. לגדול GAS M1T1 5448 זנים -10 מ"ל של מרק טוד יואיט ב 37 מעלות צלזיוס במשך 16-20 שעות לפני הדבקה של תאים אנושיים.
3. צנטריפוגה לילה תרביות חיידקים (2,400 RCF במשך 10 דק ') ו resuspend במדיום חיידקים טרי.
   הערה: Resuspension באותו נפח כמו תרבויות לילה גדלו (5-10 מ"ל) בדרך כלל יוצר צפיפות אופטית הראשונית רצוי.
4. לנרמל תרבויות חיידקיםריכוזי זינוק שווים על ידי דילול התרבויות מחדש מושעה במדיום חיידקים נוסף עד אותו הצפיפות אופטית ב 600 ננומטר (OD ₆₀₀₎ מתקבלים עבור כל הזנים להיבדק (OD ₆₀₀ של כ 1.0 מומלץ מטעמי נוחות).
   הערה: במחקרים אלה, תרביות חיידקים בשלב נייח שמשו להדביק תאי מארח מייד לאחר נורמליזציה. עם זאת, כמו כמה זנים של הפאזה יציאת חיידקי nonsynchronously זה עשוי להיות מתאים יותר להתחיל זיהומים מארחים עם תרבויות בשלב יומן אם זה יימצא במקרה של הזנים של עניין.
5. לפני ניתוח נוסף, לבצע מושבה לספור assay כדי לקבוע את יחידות המושבה להרכיב (CFU) לכל נוכחי למיליליטר בתרבויות החל כך הריבוי של זיהום (משרד הפנים), או היחס של חיידקים לכל תא מארח, ניתן לקבוע.
   1. הכן 1 מ"ל דילולים סדרתי של תרביות חיידקים כי כבר מנורמל ל Densi האופטי הרצויty ב בופר פוספט (PBS) או בינוני התפתחות חיידקים המתאים (מרק טוד יואיט שימש במחקרים אלה). כן דילולים הנעים בין 10 ^-1 עד 10 ^-6 לייצר לפחות קבוצה אחת של צלחות אגרו עם מושבות ספיר (30-300 מושבות). בצע את כל הדילולים בשלושה עותקים.
   2. העברת 100 μl של כל דילול סדרתי לצלחת אגר המכיל בינוני מתאים מינים של חיידקים להיות מנותח.
      הערה: אגר טוד יואיט שימש במחקרים אלה.
   3. בעזרת כוס או מפזר חיידקי פלסטיק כדי לפזר את aliquot 100 μl באופן שווה על פני כל פני השטח של צלחת אגר, ולהמשיך להפיץ עד שהנוזלים נספגו לתוך אגר. בצע תחת אש באמצעות טכניקה סטרילית.
   4. דגירת הצלחות אגרו על 37 מעלות צלזיוס למשך לילה או עד מופיעות מושבות ספיר.
   5. ספירת המושבות הגדלות על כל צלחת ולחשב את המ"ל / CFU בתרבות המקורית ידי formu הבאלה: מספר מושבות x ההופכי של נפח דילול / תרבות סדרתי מצופה מיליליטרים.
      למשל (200 מושבות x 1/10 ^-5 דילול) / 0.1 מ"ל מצופה = 2.0 x 10 ⁸ CFU / ml

2. מארח תרבית תאים

1. לקבלת קו תא המארח מתאים עבור הניתוחים הרצויים.
   הערה: קרטינוציטים אדם HaCaT אפיתל ^29, מתנה סוג מ V. Nizet, שימשו במחקרים אלה.
   1. שמור על תאי HaCaT ב 100 מנות תרבות מ"מ הבינוני של הנשר השונה של Dulbecco (DMEM) עם 10% בסרום שור עוברי חום מומת (FBS). לדגור על 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO _2.

3. מארח זיהום נייד עם מערכת הכנס קרום חדיר

1. פלייט תאים בצלחות בתרבית רקמה המתאימה ולאפשר להם לגדול עד שהם מגיעים 90% confluency.
   הערה: תאי HaCaT שימוש במחקרים אלה בדרך כלל להגיע confluency תוך 2-3 דays לאחר ציפוי.
   1. לקבלת אוסף lysate (למשל איתות ניתוח אדנוזין אדנוזין (מבחני נחישות ATP)), צלחת תאים HaCaT ב 6 מנות גם בצפיפות זריעה של כ 3 x 10 ⁵ תאים / היטב.
   2. בניסויים הדמיה immunofluorescence, תאים צלחת על coverslips זכוכית סטרילית בתוך 6 מנות גם בצפיפות זריעה של כ 3 x 10 ⁵ תאים / היטב.
   3. עבור permeabilization קרום homodimer ethidium ו לקטט דהידרוגנאז (LDH) מבחני שחרור, צלחת תאים HaCaT ב 24 מנות גם בצפיפות זריעה של כ 5 x 10 ⁴ תאים / היטב.
2. מיד לפני הטיפול, לשטוף תאים עם PBS 1x סטרילי.
3. החל מדיום גידול טרי לתאים. לקבלת בתנאים המתוארים כאן, להחיל 2 בינוני מ"ל לכל טוב במשך 6 צלחות היטב או 0.5 מ"ל בינוני לכל טוב במשך 24 צלחות היטב. אם נבדקים טיפולים תרופתיים, לערבב עם מדיום חדש ולהחיל במהלך STE זהp.
   הערה: מבחנים מסוימים עשויים לדרוש תקשורת אלטרנטיבית. לדוגמה, כמו פנול ריכוזים בסרום אדום וגבוה להפריע assay לשחרור LDH, DMEM אדום ללא פנול השלימו עם אלבומין 1% שור (BSA) (w / v), 2 מ"מ L- גלוטמין, ו פירובט סודיום 1 מ"מ היה מנוצל עבור ניסויים אלו.
4. לאחר יושם מדיום חדש, בזהירות למקם להכניס קרום חדיר 0.4 מיקרומטר סטרילי בכל טוב. בצע פעולה זו במנדף זרימה למינרית, ולהשתמש מלקחיים סטרילי להעביר את כנס הקרום החדיר לבאר כל אחד.
5. החל תרבית תאים בינוני טריה לתא העליון של כל אחד גם על פי הוראות היצרן. לקבלת בתנאים המתוארים כאן, להחיל 1 מ"ל בינוני לכל טוב במשך 6 צלחות היטב או 0.1 מ"ל בינוני לכל טוב במשך 24 צלחות היטב.
6. החל נפח מתאים של תרביות חיידקים מנורמלות (ראה סעיף 1) לתא העליון של המערכת הכנס קרום החדירה. השתמש בינוני חיידקים עבור contr הנגועטיפולי ol. לקבלת התוצאות שתוארו כאן, להוסיף 25 μl של תרבויות המנורמלות לכל תא במשך 24 צלחות היטב ולהוסיף 100 μl של תרבויות לכל תא במשך 6 צלחות היטב.
   הערה: במחקרים אלה, סוג-בר או GAS המוטציה יושם לארח תאים בכל משרד פנים של 10. משרד פנים חושב על בסיס המספרים תא אוקריוטים הסופיים (למשל 2 x 10 ⁶ תאים / טוב), כך 10 פעמים כמה חיידקים נוספו לכל תא מארח בתחילת תקופת הזיהום (למשל 2 x 10 ⁷ CFU לכל טוב). משרד הפנים מתאימים ישתנו בהתאם מינים של חיידקים שונים ועם ניתוחי מעקב הרצויים.
   הערה: בנוסף לשימוש בינוני חיידקים עבור פקדים נגועים, שולט שימושיים נוספים עבור יישומים מסוימים של טכניקה זו עשויה לכלול חיידקים חומים שחוט או בינוני חיידקים בילו להשוואה.
7. דגירת תאים נגועים ב 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO _2.

אוסף דוגמאות 4.

1. כדי לאסוף בינוני תרבית תאים, lysates התא המארח, או coverslips זכוכית עם תאים שלמים עבור מעקב ניתוחים, להתחיל על ידי הסרת להוסיף קרום חדיר בזהירות עם מלקחיים סטרילית.
2. להערכת Protiens מארח המופרש:
   1. אסוף המדיום מהאולם התחתון לתוך צינורות 1.5 מ"ל. הימנע מפריע בשכבה במהלך איסוף.
   2. צנטריפוגה דגימות ב 14,000 RCF במשך 10 דקות ב 4 ° C כדי להסיר פסולת הסלולר.
   3. הסר את כל אבל 50 μl של supernatant לצינור ולאחסן 1.5 מ"ל טריים ב -20 ° C או להשתמש מיד.
3. לקבלת הערכה של התא המארח Lystates:
   1. בעדינות לשאוב את המדיום מעל בשכבה של תאי מארחים. הימנע מפריע בשכבה, מכיוון שהדבר עלול לגרום לאובדן מדגם.
   2. יש לשטוף את התאים פעם עם 1x PBS.
   3. לשאוב בעדינות PBS. מייד להחיל נפח מתאים של חיץ תמוגה קר כקרח כדי להשיג את ריכוז החלבון הרצוי, דגירהדגימות קרח במשך 15 דקות. החל בין 200 μl ו 350 μl של חיץ תמוגה לכל טוב של כל צלחת 6 היטב להשגת ריכוזי חלבון בין 0.5 ו -1.5 מ"ג / מ"ל.
      הערה: מאגר תמוגה שימוש במחקרים אלה הורכב מים ללא יונים, 1% (v / v) תחליף P40 Nonidet, קוקטייל מעכב phosphatase, וקוקטייל מעכב פרוטאז. ריאגנטים ספציפיים המפורטים בסעיף חומרים וציוד.
   4. השתמש מגרד תא כדי לנתק את התאים מפני שטח הצלחת של כל טוב ו פיפטה את כל התוכן של כל אחד גם לתוך צינור 1.5 מיליליטר.
   5. צנטריפוגה דגימות ב 14,000 RCF במשך 20 דקות ב 4 ג.
   6. כדי להעריך רכיבים lysate מסיסים, להסיר את supernatant לצינור ולאחסן טרי ב -20 C או להשתמש מיד.
   7. כדי להעריך רכיבי lysate מסיסים גרעיניים או אחרים, שומר לעצמנו את הגלולה ולאחסן ב -20 C או להשתמש מייד.
4. לקבלת הערכה על ידי הדמית Immunofluorescence:
   1. כפי שבינוני פיראט ולשטוף תאים PBS קר 1x.
   2. תקן תאים לילה paraformaldehyde 4% (PFA) פתרון PBS (w / v).
      הערה: במחקרים אלה, 1 מיליליטר של PFA נוסף לכל טוב של כל צלחת 6 היטב.

5. אפליקציות מוצעות

1. מארח ניתוח התמרה איתותים ידי SDS-פייג 'המערבי סופג
   1. אסוף lysates התא המארח כמפורט בסעיף 4.3.
   2. קביעת ריכוז החלבון של כל lysate מדגם ידי חומצת bicinchoninic (BCA) assay או סטנדרטי חלבון באמצעות שווה ^30.
   3. לנרמל ריכוזי חלבון בין דגימות לפני טעינת והפעלה של דגימות על ג'ל polyacrylamide 4-15% או ³¹ חלופה מתאימה.
      1. לנרמל ריכוזים מדגם ידי pipetting אותה כמות חלבון מכל מדגם (למשל 20 מיקרוגרם) לתוך צינור מ"ל 1.5 חדשים הוספת כמויות משתנות של חיץ תמוגה (נפח חיץ = הנפח הכולל - נפח דגימהמוסף) על צינור אחד להפוך את הנפח הכולל (למשל 50 μl) ושווי ריכוז החלבון הסופי ברחבי דגימות.
   4. העברת דגימות פלואוריד polyvinylidene (PVDF) קרום (או שווה ערך). לקבלת התוצאות שתוארו כאן, להעביר דגימות ב 25 וולט עבור שעה 2 לפני הגדלת המתח 70 וולט עבור 45 דקות נוספות. השתמש חיץ העברת מורכב 200 בסיס מ"מ טריס, 1.5 מ 'גליצין ו -20% מתנול (V / V) במים deionized.
   5. ממברנות בלוק 5% BSA + 0.1% Tween 20 טריס שנאגרו מלוחים (TBS). התאם מבוסס בהתאם על המלצות היצרן עבור הנוגדן לשמש.
   6. דגירה ממברנות עם נוגדנים עיקריים בין הלילה ב 4 ° C.. השתמש ב יצרן מומלץ דילול.
   7. לשטוף ממברנות עבור 1.5 שעות ב TBS + 0.1% Tween 20; לרענן חיץ כל דקות 10-15.
   8. דגירה עם חזרת Peroxidase (HRP), מצומדות נוגדנים משני בדילול של 1: 5000 עבור 1.5 שעות ב חדר לטמפרטורותיור.
   9. לשטוף ממברנות עבור 1.5 שעות ב TBS + 0.1% Tween 20; לרענן חיץ כל 10 - 15 דקות.
   10. דגירה ממברנות עם מגיב זיהוי chemiluminescence לפני פיתוח על סרט על פי הוראות היצרן. שיטות זיהוי אחרות עשויות לשמש רצוי.
2. תא מארח Immunofluorescence מכתים והדמיה
   1. תקן coverslips המכיל תאי מארח כמפורט בסעיף 4.4.
   2. הסר פתרון PFA ולשטוף coverslips המכיל תאים שטופלו שתי פעמים PBS, aspirating בין שוטף.
      הערה: PFA הוא רעיל מאוד וחייב להיות מסולק כראוי.
   3. חסום את coverslips עבור 2 שעות בטמפרטורת החדר PBS עם 1% (w / v) בסרום עז נורמלי, 2% (v / v) טריטון X-100, ו -0.5% (v / v) Tween 20.
   4. לשטוף coverslips עם PBS למשך 30 דקות, מרענן למאגר כל 10 דקות.
   5. דגירה coverslips עם נוגדן ראשוני ביחס 1:50 (או כפי המומלץ על ידי היצרן) בחסימת solution לילה ב 4 מעלות צלזיוס.
   6. שטפו את coverslips עבור 1.5 שעות ב PBS, לרענן את חיץ כל 30 דקות.
   7. דגירה coverslips עבור 2 שעות בטמפרטורת החדר ב נוגדנים משני (נגד ארנב עיזים IgG AlexaFluor488 שימש למחקרים אלה) באמצעות יחס של 1: 200 של נוגדן חסימת פתרון.
   8. לשטוף coverslips עבור שעה 1, מרענן למאגר כל 20 דק '.
   9. החל כתמים רצויים.
      הערה: מחקרים אלה נוצלו DAPI (גרעיני כתם) ו rhodamine-phalloidin (כתם יקטין) על יחסים של 1: 1,000 בחסימת פתרון.
   10. דגירת coverslips עם כתמים גרעיניים יקטינו למשך 30 דקות בטמפרטורת חדר.
   11. לשטוף coverslips ב PBS למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר, לרענן את חיץ כל 10 דקות.
   12. הר coverslips על שקופיות זכוכית באמצעות הרכבה בינונית.
   13. אפשר coverslips להגדיר בשקופיות לילה לפני איטום והדמיה. לקבלת התוצאות שתוארו כאן, לאסוף תמונות על usi מיקרוסקופ פלואורסצנטיng מטרת 20X סטנדרטית. השתמש ImageJ ומיקרוסקופ הדמיה תוכנה לעבד את התמונות שנתפסו.
3. Assay מוות של תאים Ethidium homodimer
   1. לשאוב בינוני מבאר כל ולשטוף תאים פעמיים עם PBS סטרילית.
   2. החל homodimer-1 ethidium 4 מיקרומטר PBS.
   3. דגירה תאים בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות בחושך.
   4. לקבוע את רמת הקרינה באמצעות קורא צלחת מוגדר 528 עירור ננומטר 617 פליטה ננומטר עם ערך סף של 590 ננומטר.
   5. להוסיף 0.1% (w / v) סאפונין לכל הקריאה הראשונית היטב הבאים ולאפשר את הצלחת דגירה 20 דקות נוספות בטמפרטורת החדר (עם נדנדה) לפני שתקראו את הסעיף צלחת בשנית על אותן הגדרות.
   6. לקבוע permeabilization קרום אחוזים בנפרד עבור כל טוב על ידי חלוקת הקרינה הראשונית קריאה (שלאחר הטיפול) על ידי הקרינה בקריאה שנייה (שלאחר סאפונין).
4. Assay קביעת ATP
   1. איסוף lysates כמפורט בסעיף 4.3 לעיל.
   2. לנרמל את רמות חלבון lysates באמצעות assay BCA או ³⁰ דומים.
   3. קביעת רמות הסלולר ATP באמצעות ערכת נחישות ATP מבוסס הארה או שוות ערך על פי הוראות היצרן.
   4. לנרמל ערכים שטופלו על דגימות שליטה הנגועות המקבילות.
5. Assay שחרור LDH
   1. בעקבות זיהום, לאסוף supernatants כמפורט בסעיף 4.3.
   2. הערכת שחרור LDH באמצעות ערכת זיהוי רעילה לשחרור LDH פי הוראות היצרן.

Results

פרוטוקול מערכת זיהום הקרום החדיר מבוסס הכנס פתח לחקר גורמי חיידקיים המופרשים הוא מפורט באיור 1. מערכת זו מתבססת על הפרדת חיידקים ותאים מארחים באמצעות קרום נקבובי כדי להעריך את ההשפעות של גורמי חיידקיים מופרשים, במקרה זה Streptolysin S (SLS), על תגובות מארחות כגון שלמות קרום מארח, כדאיות הסלולר, הולכים אותות סלולריים, וגרם תא מארח מופרשים. איור 2 מספקים נתונים כתמים מערבי נציג הוכחת כי מערכת זו ניתן להשתמש כדי להעריך את השינויים בהפעלת קשר חלבונים עצמאיים איתות מארח. באופן ספציפי, הנתונים נציג להראות משופרים באופן משמעותי הפעלת MAPK p38 בנוכחות זנים להפקת גז-SLS. מערכת זו יכולה להיות מיושמת גם כדי להמחיש את ההשפעות של גורמי חיידקיים המופרשים על לוקליזציה חלבון מארח ידי מיקרוסקופ immunofluorescence ( איור 3). הנתונים מראים הפעלת SLS התלוי של מתווך מפתח דלקת B קאפה פקטור הגרעיני (NFκB), אשר translocates מן הציטופלסמה לגרעין באקטיבציה ^21. תוצאות איורים 2 ו -3 עולות כי הן SLS תלויות תגובות איתות דלקתיות אינן דורשות מגע ישיר בין החיידקים ותאי מארח. כמו בניסויים קודמים כבר הוכיחו SLS התלוי p38 והפעלת NFκB במודלי זיהום ישירים ^21, רמות דומות של p38 או NFκB הפעלה בין השלושה זני הגז במערכת הכנס מבוסס הקרום החדיר היה הראה כי התגובה נדרשת קשר ישיר בין חיידקים ותאים המארח. איור 4 מראה כי מערכת זיהום זה יכול להיות מיושם על מנת להעריך שינויים תלויי הרעלן cytotoxicity מארח באמצעות מבחני שחרור homodimer ethidium ו LDH. עדות לכך הוא על ידי i העלייה המשמעותיn הוא קרום permeabilization וב שחרורו של LDH מתאי מארח נחשף זני גז המכילים SLS לעומת תאים או תאים נגועים חשופים זן SLS המחסר. שינויים אלו cytotoxicity אינם מיידיות, כמו השפעות משמעותיות אינן נראות עד לאחר פגיעת 12 שעות במקרה של permeabilization הממברנה 16 שעות במקרה של שחרור LDH. הנתונים נציג להמחיש את החשיבות של בחירת נקודות זמן מתאימות ותנאי זיהום להערכת התגובות המארחות אלה. בנוסף מאפשר להערכת שינויי איתות מארח cytotoxicity, מערכת הקרום החדיר הזיהום מבוסס הכנס ישימה המחקר של שינויים מטבוליים כגון קביעה מדויקת של רמות ATP המארח על ידי מניעת זיהום חיידקים של lysates תא מארח (איור 5) . נתונים אלה מצביעים על אובדן משמעותי של ATP keratinocyte בתגובה לזיהום גז על ידי 16 שעות שלאחר זיהום, עם הפסד ATP משופרת in בנוכחות SLS. תוצאות אלו עולות בקנה אחד עם עליות רעלן תלוי שנצפו איתות מתח בתגובת מארח cytotoxicity.

איור 1: התרשים של חדיר ממברנה הכנס מבוסס זיהום מערכת פרוטוקול כדי להעריך את ההשפעות של גורמי חיידקיים מופרשים בתא פונדקאי קרטינוציטים אדם הם מצופים בתא התחתון גדלו ל -90% מפגש.. קרום קולגן מצופה עם 0.4 מיקרומטר נקבוביים מפריד לתאי העליון ותחתון, וחיידקים מתווספים בחדר העליון של המערכת הכנס קרום החדירה עבור תקופת ההדבקה הרצויה. תרבית תאי supernatants ותאי מארח עשוי להיאסף לאחר תקופת הזיהום מנוצל עבור מגוון רחב של ניתוחים. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותרשל נתון זה.

איור 2:. הקרום החדיר מערכת הזיהום הכנס המבוססת יכולה להיות מנוצלת עבור תא מארח Lysate ניתוח על ידי SDS-PAGE ו מערבי סופגים הנתונים נציג להוכיח כי SLS משפר שפעול מסלול MAPK p38 ב קרטינוציטים נגועים. (א) HaCaTs נדבקו GAS עבור 7 שעות באמצעות מערכת זיהום להוסיף קרום חדיר (ב משרד הפנים = 10) ו lysates הוערכו לצורך הפעלה של p38. (B) צפיפות משלושה מערבי עצמאי כתמים בוצעה על מנת לכמת את ההפעלה היחסית של p38 בתגובת GAS'infection. ממוצעים משלושה ביולוגי משכפל נראים לעין, עם ברי שגיאת מייצג סטיית התקן. הפעלה יחסית של p38 מיוצג רמת חלבון פוספורילציה / סה"כ. מובהקות סטטיסטיות נקבעו לעומתתאים נגועים. P-הערך הכולל נקבע על ידי ANOVA (p = 0.0063). הבדיקות של Dunnett בוצעו פוסט הוק להשוות כל תנאי לשליטה הנגועה המקבילה מתכוון. *, P = 0.01-0.05; **, P = .001-.01; ***, P = 0.0001-0.001; ****, P <0.0001. נתון זה יש הבדל בין פלהרטי et al. 2015 ^21. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 3:. הקרום החדיר מערכת הזיהום הכנס המבוססת מאפשרת ההדמיה של שינויי איתות מארח ידי Immunofluorescence המיקרוסקופי הנתונים נציג להראות כי Streptolysin S משפר פרו-דלקתי איתות באמצעות הפעלת NFκB. קרטינוציטים אדם HaCaT נדבקו GAS לעבר M OI 10 עבור 8 שעות באמצעות קרום החדיר מערכת זיהום כנס המבוססת. (A ו- B) לוקליזציה גרעינית של NFκB הוערכה על ידי הדמית immunofluorescence. אחוז התאים המקומיים גרעיניים חושב על ידי ספירת מספר תאים בם NFκB היה translocated מן הציטופלסמה לגרעין עבור שדה נתון החלוקה מספר כי במספר הכולל של תאים עבור אותו השדה. ברי סולם עולים 100 מיקרומטר. (א) הממוצע של שלושה משכפל ביולוגי מיוצגים עבור כל תנאים במוטות שגיאה מייצגות סטיית התקן. P-הערך הכולל נקבע על ידי ANOVA; p <0.0001. הבדיקות של Dunnett בוצעו להשוות כל תנאי למצב השליטה הנגוע המקביל. *, P = 0.01-0.05; **, P = .001-.01; ***, P = 0.0001-0.001; ****, P <0.0001. נתון זה יש הבדל בין פלהרטי et al. ²¹ 2015./ftp_upload/54406/54406fig3large.jpg "target =" _ blank "> לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 4:. קרום חדיר מערכת זיהום הכנס מבוסס מאפשר לקביעת בקטריאלי בתיווך ממברנה Permeabilization ו Cytotoxicity בהעדר מגע ישיר בין חיידקים ותאים מארח הנתונים נציג להוכיח כי הכדאיות keratinocyte פוחתת בנוכחות רעלן SLS פעיל . GAS - מושרה המוות של תאים הוערך בתאי HaCaT בנוכחות WT, SLS מחסר או סגת של GAS קרטינוציטים נחשפו לגז באמצעות מערכת הקרום החדיר זיהום מבוסס כנס עבור 8-16 שעות ב משרד פנים של 10. (. א) הכדאיות הוערכה על ידי assay homodimer ethidium או (ב) assay לשחרור LDH. בשני פאנלים, 3 מחדשplicates הם ממוצעי ברי שגיאה מייצגים סטיית התקן. חשיבות עבור כל נקודת זמן נקבעה על ידי ANOVA (א) 8 שעות, p = 0.0241; 12 שעות, p <0.0001) ב (8 שעות, p = 0.0287; 12 שעות, p = 0.1977; 16 שעות, p = 0.0031. הבדיקות של Dunnett בוצעו כדי להשוות אמצעים מכל מצב זיהום wild-type עבור נקודת הזמן המתאימה. *, P = 0.01-0.05; **, P = .001-.01; ***, P = 0.0001-0.001; ****, P <0.0001. נתון זה יש הבדל בין פלהרטי et al. 2015 ^21. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 5: הקרום החדיר הכנס מבוססת מערכת הזיהום מאפשרת קביעה מדויקת של רמות המארח ATP על ידי מניעת Bacterial זיהום של תא מארח Lysates. הנתונים נציג להפגין אובדן SLS התלוי של ATP במהלך סטרפטוקוקלית זיהום קבוצת א '. תאי HaCaT נדבקו GAS עבור 8-16 שעות באמצעות קרום החדיר מערכת זיהום כנס המבוססת. משכפל טכני (n = 3) מן לשכפל ביולוגי נציג אחד (2 x 10 ⁶ תאים לדגימה) היו בממוצע עבור כל תנאי, עם ברי שגיאת מייצג סטיית התקן. P-ערכים הכוללת נקבעו על ידי ANOVA (12 שעות, p <0.0001; 16 שעות, p <0.0001). הבדיקות של Dunnett בוצעו להשוות כל תנאי עם זיהום wild-type עבור נקודת הזמן המתאימה. *, P = 0.01-0.05; **, P = .001-.01; ***, P = 0.0001-0.001; ****, P <0.0001. נתון זה יש הבדל בין פלהרטי et al. 2015 ^21. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

Discussion

בזאת מתוארת שיטה באמצעות מערכת זיהום קרום חדיר מבוססי הכנס כדי לבחון את ההשפעות של הרעלן חיידקי Streptolysin S על קרטינוציטים אדם אפיתל במערכת חוץ גופית. פרוטוקול זה יכול להיות מותאם לחקר גורמים ארסיים חיידקים מופרשים אחרים, כמו גם סוגי תא מארח חלופיים. מערכת זו מספקת מספר יתרונות שפותחו לאחרונה על שיטות ניסיוניות לנצל רעלים מטוהרים או supernatants חיידקי מסוננים ^{1 - 3,8,18 - 20.} הקרום החדיר הכנס מבוססת המערכת מספקת מנה נשמרה כל זמן של רעלן החיידקים הרלוונטי לארח תאים כפי שהוא מיוצר, המאפשר פעילות הרעלן מקסימלי להישמר וגם ולהגדיל עקביות בין ניסויים. בנוסף, מערכת זו תחקה בצורה טובה יותר בתנאים פיסיולוגיים בכך שהוא מאפשר הגורם המופרש לצבור לאורך זמן כמו הזיהום מתקדם ועל ידי eliminating צורך לבחור ריכוזי רעלן ספציפיים באופן שרירותי להחיל לארח תאים. יתר על כן, מערכת זו גם תספק אמצעי החוקרים להעריך אם גורם חיידקים של העניין מועבר לארח תאים באופן מגע תלוי. לתקשר-תלות לעתים קרובות נבחנת דרך הדור של מוטנטים חיידקי isogenic חסרי עמידה או באמצעות חומרים כימיים המונעים דבקה. המערכת המתוארת כאן תספק אלטרנטיבה פשוטה להשלים או להחליף הגישות המסורתיות הללו.

בנוסף היישומים נבדקו בסעיף 5 לפרוטוקול, יישומים אחרים שאליהם מערכת זיהום זה יכול בקלות להיות מותאם כוללים איסוף דגימות עבור מערכים ציטוקינים מבחני ELISA. בשני המקרים הללו, פרוטוקול דומה לזה שתואר עבור מבחני שחרור LDH יכול להיות אחריו. אמנם לא מוצג כאן, מערכת זו נעשה שימוש כדי לאסוף ביעילות דגימות התא המארח להיותnalyzed ידי cytometry הזרימה. ביישום זה, להכניס את הקרום החדיר מוסר בעקבות תקופת ההדבקה, התאים נשטפים להסרת בינוני תרבית תאים, טריפסין מוחל לאפשר איסוף של התאים לניתוח. ההפרדה הפיסית של חיידקים מתאים מארח היא שימושית במיוחד עבור יישום זה כי זה עוזר למנוע ההיווצרות של אגרגטים גדולים המורכבים של חיידקים דבקים ותאי מארח שיכול להפריע בכל דרך אחרת ספירת תאים מדויקת ידי cytometer את הזרימה.

למרות תגובות מארחות עקביות מאוד נצפו כאשר משווות את התוצאות של מחקרי הזיהום מבוסס להוסיף קרום החדיר עם מחקרי זיהום ישירים מסורתיים, כמה הבדלים בולטים ב קינטיקה של תגובות מארח אלה נצפו ^21. לדוגמא, שינויי איתות מארח cytotoxicity המבוסס הקרום לקחת 30-50% יותר להתרחש במודל זיהום הקרום החדיר מבוסס כנס מ corלהגיב מודלי זיהום ישירים. כיוון שמערכת הקרום החדירה מבוסס הכנס דורשת בינונית לחול על התאים העליונים ותחתונים של כל הטוב, המערכת שפותחה עבור המחקרים שתוארו כאן נדרשה גידול של 30% בנפח בינוני הכולל לכל טוב לעומת מקביל מודלי זיהום ישירים השתמשו בעבר ^21. זה הבדל בנפח בינוני כולל, יחד עם המרחק המוגדל בין חיידקים ותאי מארח כאשר אסור במגע ישיר, סביר מגדיל את המשך הזמן שלוקח SLS כדי לנטרל באמצעות המדיום להגיע תאי מארחים ולעורר השפעות שנצפו. בנוסף, קרום חדיר הכנס מבוססי מערכת מסיר גורמים ארסיות GAS רבים העשויים לתרום לארח נזק לתאים; בהיעדר גורמים נוספים אלה במערכת זו הוא גם עשוי לתרום עיכוב מות תא מארח וייזום אירועי איתות מארח לעומת זיהום ישיר ^21. גורמים אלה יש לשקולבעת תכנון ניסויים להעריך רכיבי חיידקי מופרשים אחרים.

כדי לזהות את התנאים הכי המשמעותיים לבדיקת ההשפעות של גורמי חיידקיים מופרשים בתא פונדקאי, בדיקות מגוון של מועדים לפי שעון עבור כל יישום של מערכת הזיהום מבוסס להוסיף קרום החדיר מומלצת. חשוב לשקול ובאילו תנאי הגורם הארסי הספציפי של העניין מופק בצורה אופטימלית (שלב יומן למשל, בשלב נייח, בתגובה לאותות סביבתיים מסוימים, וכו ') על מנת לבחון את השפעותיו בהצלחה. בניסויים התמקדו בהערכת שינויים בחלבונים מארחים איתות, היה צורך לבחור מועדים לפי שעון שאפשרו זמן מספיק לצורך SLS להגיע תאים המארח להיות מיוצר בכמויות מספיק כדי לגרום איתות משנת ^21. במקביל, הערכה של שינויים מארח צורך איתות להתנהל לפני permeabilization קרום-induced SLS, כמו ג את האפקט הזהomplicates גביית lysates התא המארח לניתוח. מוות של תאים המושרה על ידי SLS יכול להיבחן בצורה אופטימלית בשני המודלים זיהום מבוססי להוסיף קרום חדיר ישיר כמה שעות לאחר תחילת האירועים איתות דיווחו ^21. יתר על כן, בבחירת נקודות זמן של עניין, זה גם חשוב לוודא כי החיידק הנלמד אינם מסוגל לחדור דרך הממברנה להכניס הנקבובית במהלך תקופת הלימודים. לייצור רכיבי חיידקים מסוימים על פני תקופה ממושכת עלול לשבש את שלמותו של הקרום ולאפשר מעבר של חיידקים אל המגירה התחתונה. על מנת לקבוע האם מדובר בבעיה פוטנציאל במערכת של עניין, זני חיידקים כדי להיחקר ניתן ליישם בחדר העליון של קרום חדיר להכניס מערכת מבוססת על מגוון של נקודות זמן. בכל נקודת זמן, את הכנס ניתן להסיר בזהירות את המדיום מהאולם התחתון ניתן לאסוף מנוצל שותף מושבת תקןassay unting (ראה סעיף 1.5). אם אין מושבות נוצרות ממדיום תרבית תאים בתא התחתון, קרום הכנס ניתן להניח להיות מניעת המעבר של חיידקים ביעילות בנקודת זמן עומס חיידקי נבדק.

מרכיב נוסף עיצוב ניסיוני כי הוא צפוי לדרוש אופטימיזציה עבור הניתוח היעיל של גורמי חיידקיים מופרשים הוא הריבוי של זיהום (משרד פנים). משרד הפנים מתייחס ליחס של תאים חיידקיים לכל התא המארח, ולכן מושפעת confluency התא המארח בעת זיהום במספר יחידות המושבה להרכיב בקטריאלי (CFU) להחיל את התאים. במחקרים אלה, תאי keratinocyte גדלו ל -90% confluency, אשר אפשר תאים אלה יוצרים monolayer מלוכדת עם צומת הדוקים ללא פגע. שיקול מחושב של הארגון הפיזיולוגי של תאי המארחים להיחקר יש צורך לבחור confluency מתאים לניסויי זיהום. ברגע approprמספר iate של תאי מארחים לכל נקבעת היטב, CFU חיידקים מתאים ניתן לחשב מבוסס את משרד הפנים הרצוי. במחקרים שתוארו כאן, GAS יושמה לארח תאים בכל פנים של 10. משרד פנים מתאימים תשתנה בהתאם חיידקים שונים ועם ניתוחי מעקב הרצויים. התחלה נמוכה משרד הפנים הוא בדרך כלל יותר רלוונטי מבחינה פיזיולוגית ומאפשר גורם חיידקי עניין לצבור מספיק לאט כדי ללכוד שינויים עדינים איתות תא המארח לפני שינויים דרמטיים כדאי תא מארח ניכרים. MOIs הגבוהה משמשת במחקרים רבים להערכת רעילות, אך השפעה זו גם יכולה להיות מושגת על ידי מתחיל עם משרד פנים נמוך ומאפשרים הזיהום להתקדם לתקופה ארוכה יותר של זמן. חשוב לקבוע CFU מדויק תולדת צפיפות אופטית עבור כל זני החיידקים להיבדק, כמו מוטציות isogenic עלולות להיות בעל שיעור צמיחה שינה לעומת חיידקי wild-type ועלול ולכן המחייבות גבוהה או נמוך CFU יתווסף לכל היטבלהבטיח השוואה מתאימה התגובה המארחת בין זנים. במקרים בם תאי המארחים היונקים הנלמד מסוגלים להרוג חיידקים או עיכוב הצמיחה שלהם או אם צמיחת nonsynchronous בין זני חיידקים חשודות, זה יכול להיות גם שימושי לבצע מחקרים על מנת להעריך את עומס החיידקים הסופי בסוף תקופת ההדבקה. זה יכול להיות מושלם על ידי איסוף התוכן של הכנס החדיר וביצוע assay ספירת מושבה דומה לזה שתואר בסעיף 1.5 של ההליך.

בחירת בארות בגודל המתאימה עבור assay הרצוי היא גם חשובה להשגת תוצאות אופטימליות. מוסיף קרום חדיר זמינים במגוון גדלים, אך התוצאות הכי עקבית עבור המחקרים המוצגים כאן נצפו באמצעות מוסיף המיועד 24 היטב 6 צלחות תרבית הרקמה היטב. בגדלים הכניסו אלה קלים יחסית להתמודד עם מלקחיים סטריליות, וקלות המניפולציה היא קריטית מנעתיing העברה רצויה של חיידקים מהתא העליון לתא התחתון של הפיר. בניסויים מעורבים בגביית lysates תא המארח, 6 מנות גם לספק מספר תאים מתאים לכל מצב עבור רוב הניתוחים הם גדולים מספיק כדי להכיל מגרדי תאים לאיסוף דגימה. עבור מבחני cytotoxicity שבו תאי המארחים להישאר חסיד מסומן עם פלורסנט או לצבוע colorometric שניתן למדוד על קורא צלחת (assay homodimer למשל ethidium, assay הרחקת trypan הכחול), שימוש 24 צלחת היטב עם מוסיף המקביל הוא מוּמלָץ. עבור ניסויים שבם תאים בינוניים תרבות ייאסף ונותחו (שחרור LDH למשל, מחקרים ציטוקינים) את 24 טוב או 6 צלחות גם עשויות לשמש, אם כי הבארות הקטנות בדרך כלל לספק כרכי מדגם נאותים של ניתוחים אלו ולמזער שימוש הנדרש ריאגנטים. בסך הכל, השיטה הוא תכליתי מאוד יכול להיות מותאם לפי הצורך להכין samples עבור יישומים ומעקב רבים.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
מרק טוד-יואיט	Acumedia	7161A	השתמש במרק מתאים למיני חיידקים מעניינים.
ביוספקטרומטר	בסיסי	של אפנדורף	כל ספקטרופוטומטר UV-Vis מתאים.
מנות פטרי	פישר סיינטיפיק	FB0875713	מותגים אחרים מתאימים.
אגר	סיגמא	A1296-1 ק"ג	מותגים אחרים מתאימים.
		אפיתל אנושיים HaCaT	מתנה ממעבדתו של ויקטור ניזט.
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)	Life Technologies	11995-073	השתמש במדיה מתאימה לקו התא המעניין.
סרום בקר עוברי (FBS)	Biowest	S162H	השתמש בתוספי מדיה מתאימים לקו התאים המעניין.
כלי תרבית רקמות 10 ס"מ	Nunc	150350	מותגים אחרים מתאימים.
6 כלי תרבית רקמות היטב	CytoOne	cc7682-7506	מותגים אחרים מתאימים אך צריכים להיות תואמים לתוספת קורנינג.
24 כלי תרבית רקמות היטב	CytoOne	cc7682-7524	מותגים אחרים מתאימים אך צריכים להיות תואמים לתוספת קורנינג.
כיסויי זכוכית	Fisherbrand	12-541-B	יש לבצע חיטוי לפני השימוש לציפוי תאים.
תמיסת מלח חוצצת פוספט (PBS)	Gibco	10010-023
פנול אדום ללא	DMEM Life Technologies	31053028	מדיה ללא פנול אדום נדרשת רק לבדיקת שחרור LDH.
סרום בקר אלבומין (BSA)	Fisher Scientific	BP1600-100
L-גלוטמין	Gibco	25030149	נדרש רק להשלמת מצע תרבית תאים לבדיקת שחרור LDH.
נתרן פירובט	Gibco	BP356100	נדרש רק להשלים את אמצעי תרבית התאים לבדיקת שחרור LDH.
מצופה קולגן 0.4 μ מ מוסיף טרנסוול (6 באר)	קורנינג	3540
מצופה קולגן 0.4 μ m מוסיף Transwell (24 באר)	Corning	3595
Fisher	Fisher	3120018	יש לעקר אותם עם אתנול לפני הטיפול בתוספות Transwell.
מגרדי תאים	פישרברנד	08-100-241	אלה נדרשים רק לאיסוף ליזטים של תאים.
פרפורמלדהיד	פישר סיינטיפיק	04042-500	רעיל.  זה נדרש רק להדמיה אימונופלואורסצנטית.
ערכת בדיקת חומצה ביצינצ'ונינית (BCA)	פירס	23227	ניתן להשתמש במבחני כימות חלבון אחרים.
יש לבחור טריס-גליצין 4 - 15% ג'ל פוליאקרילאמיד	BioRad	4561083	מערכת חיץ ואחוז פוליאקרילאמיד על סמך חלבונים מעניינים.
קלטת אלקטרופורזה מספקת	BioRad	1658063	נדרשת רק עבור Western Blotting.
ספק כוח אלקטרופורזה	BioRad	1645050	נדרש רק עבור Western Blotting.
קלטת העברת כתם מערבי	BioRad		נדרשת רק עבור Western Blotting.
ממברנה פוליווינילידן (PVDF) EMD	Millipore	IPVH00010	נדרש רק עבור Western Blotting.
Tween 20	Sigma	P1379-500ml
ארנב IgG-HRP נוגדן משני	סנטה קרוז ביוטכנולוגיה	sc2030	יש לקבוע את הנוגדן המשני על סמך שיטת הזיהוי שנבחרה.
נוגדן משני IgG-HRP עכבר	סנטה קרוז ביוטכנולוגיה	sc2031	יש לקבוע את הנוגדן המשני על סמך שיטת הזיהוי שנבחרה.
Phospho-p38 (T180 + T182) נוגדן MAPK	איתות תאים	4511	בחר נוגדנים ראשוניים מתאימים על סמך חלבונים מעניינים.
סה"כ p38 נוגדנים MAPK	איתות תאים	8690	בחר נוגדנים ראשוניים מתאימים על סמך חלבונים מעניינים.
עיזים נגד ארנב IgG Alexafluor 488	בדיקות מולקולריות	A-11034	נוגדנים משניים אחרים עשויים לשמש לזיהוי הדמיית אימונופלואורסנס.
מגיב זיהוי LumiGLO	KPL	54-61-00	נדרש רק עבור Western Blotting עם זיהוי בסרט.
סרט זיהוי	Biodot	BDB57	נדרש רק עבור Western Blotting עם זיהוי על סרט.
מיקרוסקופ פלואורסצנטי DeltaVision Nikon 90i	Nikon		מיקרוסקופים פלואורסצנטיים אחרים מתאימים לניתוחים אלה.
סרום עיזים רגיל	Thermo Scientific	31873
Triton X-100	Sigma	T9284-500mL
DAPI כתמים גרעיניים	איתות תאים	4083	בחר כתמים על סמך יישומי אימונופלואורסצנציה ספציפיים מעניינים.
כתם רודמין-פלואידין אקטין	בדיקות מולקולריות	R415	בחר כתמים על סמך יישומי אימונופלואורסצנציה ספציפיים מעניינים.
Fluoromount-G	Southern Biotech	0100-01	נדרש רק להדמיה אימונופלואורסצנטית.
אתידיום הומודימר 1	בדיקות מולקולריות	E1169	נדרש רק לבדיקת ציטוטוקסיות של חדירת הממברנה.
Spectramax M5 Microplate Reader		מולקולריים	קוראי מיקרו-פלטות אחרים המסוגלים לזהות UV-vis, פלואורסצנטיות וזוהר עשויים להתאים.
Saponin	Sigma	47036-50G-F	נדרש רק לבדיקת ציטוטוקסיות של חדירת הממברנה.
בדיקות מולקולריות ערכת קביעת ATP	טכנולוגיות חיים	A22066	ערכות אחרות עשויות להתאים.
ערכת זיהוי ציטוטוקסיות לשחרור LDH	Roche	11644793001	ערכות אחרות עשויות להתאים.
תחליף Nonidet P40	סיגמא	74385-1L	ספקים אחרים מתאימים.
קוקטייל מעכב פוספטאז HALT	Thermo Scientific	78420B	קוקטיילים אחרים עשויים להתאים.
טבליות קוקטייל מעכב פרוטאז SIGMAFAST, ללא EDTA	Sigma	S8830-2TAB	קוקטיילים אחרים עשויים להתאים.