הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

פיתוח Immunoassay רוק נוגדן Multiplex כדי לאמוד את חשיפת אדם לפתוגנים הסביבה

7.8K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/54415

⸱

12 בספטמבר 2016

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1National Exposure Research Laboratory, U.S. Environmental Protection Agency, 2National Risk Management Research Laboratory, U.S. Environmental Protection Agency, 3Oak Ridge Institute for Science and Education, 4Department of Biological Sciences, McMicken College of Arts and Sciences, University of Cincinnati

במאמר זה

סיכום

באקלים הנוכחי של משאבים נדירים, צצות טכנולוגיות חדשות המאפשרות לחוקרים לבצע מחקרים זולים יותר, מהירים יותר ומדויקים יותר. כאן אנו מתארים את הפיתוח של בדיקה חיסונית מרובת נוגדנים מבוססי רוק מבוססת חרוזים למדידת חשיפה אנושית למספר פתוגנים סביבתיים בו זמנית.

תקציר

האטיולוגיה ואת ההשפעות של חשיפה אנושית פתוגנים סביבתיים הם של דאגה גדולה ברחבי העולם, ובכך, את היכולת להעריך באמצעות חשיפה וזיהומים חסכוניות, גישות תפוקה גבוהה תהיה הכרחית. כתב יד זה מתאר את ההתפתחות וניתוח של immunoassay זמנית מבוסס חרוז ליכולת למדוד את הנוכחות של נוגדנים ברוק אדם פתוגנים רב בו זמנית. רוק הוא אטרקטיבי במיוחד ביישום זה בגלל זה אינו פולשני, זול יותר וקל יותר לאסוף מ בסרום. אנטיגנים של פתוגנים סביבתיים היו מצמידים את microspheres carboxylated (חרוזים) ומשמשים למדידת נוגדנים בנפחים קטנים מאוד של דגימות רוק אנושיים באמצעות assay מבוסס חרוז, פתרון פאזיים. חרוזים היו מצמידים עם אנטיגנים מ קמפילובקטר jejuni, הליקובקטר פילורי, Toxoplasma gondii, noroviruses (G I.1 ו- G II.4) ודלקת כבד נגיפית A וירוס. כדי להבטיח כי אנטיגנים היו מצמידים מספיק כדיהחרוזים, צימוד אושרו באמצעות נוגדני מינים ספציפיים, לכידה עיקרית-מחי, ואחריו דגירה עם נוגדני איתור משני אנטי-מיני biotinylated כתב streptavidin-R-Phycoerythrin (SAPE). כביקורת למדוד הלא ספציפי מחייב, סט חרוז אחד טופל באופן זהה לאחרים אלא שזה לא היה מצמיד את כל אנטיגן. האנטיגן מצמיד ובקרת חרוזי הודגרו אז עם דגימות רוק אנושיות-שנאספו פרוספקטיבית, נמדדו על נתח תפוקה גבוהה על בסיס העקרונות של cytometry זרימה, ואת הנוכחות של נוגדנים לכל אנטיגן נמדדה ביחידות עוצמות קרינה החציונית (MFI) . יש immunoassay זמנית זו מספר יתרונות, כולל נתונים נוספים עם מדגם פחות; עלויות עבודה מופחתות; ואת היכולת להתאים את assay מטרות רבות של עניין. תוצאות מחקר מראים כי immunoassay זמנית הרוק עשויה להיות מסוגל לזהות חשיפות וזיהומים קודמים, אשר יכול להיות especially שימושי במחקרי מעקב המעורבים אוכלוסיות אנושיות גדולות.

מבוא

שימונים ושמונה אחוזים של מחלה הקשורים שלשולים ברחבי העולם קשור לחשיפת אדם למים מזוהמים, מזון בטוח, והיגיינה / תברואה הירודה, גרימה כ -1.5 מיליון מקרי מוות, רובם הם ילדים 1. זהו גורם עיקרי לדאגה עבור אנשי בריאות ציבור וקובעי מדיניות. במאמץ לחקור חשיפות ומחלות הקשורות waterborne ופתוגנים סביבתיים אחרים, פיתחנו immunoassay זמנית למדוד נוגדנים בדגימות אדם 2-4. שיטה זו יכולה להיות מיושמת על מחקרים אפידמיולוגיים לקבוע חשיפה אנושית פתוגנים אלה עדיף להגדיר זיהומי immunoprevalence ואירוע.

רוק טומן בחובו הבטחה ניכרה כחלופת סרום המחקר ביו-מרקר אדם. בין היתרונות של שימוש רוק הם-הפולשנות הלא וקלות אוסף מדגם, בעלות נמוכה, ודוגמאות ניתן לאסוף בקלות מילדים 5-7 </ Sup>. סרום דגימות רוק נחקרו רבות עבור נוגדנים כנגד H. פילורי 2,3,8, Plasmodium falciparum 9, Entamoeba histolytica 10, Cryptosporidium parvum 3,11, דלקת ריאות סטרפטוקוקוס 12, וירוסים הפטיטיס A ו- C 13-14, noroviruses 2-4,15, ט גונדי 2-4, דנגה וירוס 16, וירוס הכשל החיסוני האנושי (HIV) 17, ו Escherichia coli O157: H7 18.

Immunoassay זמנית מאפשר ניתוח של analytes מרובים בו זמנית בתוך נפח דגימה אחת ותוך מחזור אחד או לרוץ. אנטיגנים Multiplexed מ ג jejuni, ט גונדי, H. pylori, הפטיטיס וירוס, ושני noroviruses שמש למדידת אדם רוק IgG 2-4 ו IgA 3,4 ופלזמת תגובות 2,3 נוגדן IgG לפתוגנים אלה באמצעותחרוז מבוסס ריבוב immunoassay. הפועל בשיתוף עם מחקרים אפידמיולוגיים של חשיפה לחיידקים במים, אדמה ומזון, הסוג של assay המתואר במחקר זה עשוי לספק מידע רב ערך על מנת לשפר את ההבנה של זיהומים הנגרמים על ידי פתוגנים סביבתיים. יתר על כן, נתוני נוגדן רוק שהתקבלו ממחקרים כאלה יכולים לשמש כדי לשפר את המודלים להערכת סיכוני 19-22.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

התקבל אישור הדירקטוריון סקירה מוסדיים (IRB # 08-1844, אוניברסיטת צפון קרוליינה, צ'אפל היל, צפון קרוליינה, ארה"ב) לאיסוף דגימות רוק crevicular מגורה מ beachgoers בחוף Boqueron, פורטו ריקו, כחלק ארצות הברית הסוכנות להגנת הסביבה (USEPA) הלאומי אפידמיולוגיים הערכה סביבתית של פנאי (NEEAR) מים לימוד 23 להעריך הקשורים שחייה חשיפות ומחלות. משתתפי המחקר סיפקו הסכמה מדעת הונחו על השימוש בהתקן אוסף הרוק ידי קבלנים USEPA מאומן. דגימות הרוק נשלחו על קרח, עם קבלה, הם היו centrifuged ומאוחסנים ב -80 ° C כמתואר 4.

1. הפעלת חרוז

  1. מניות סט חרוז גלולה ידי vortexing ו sonicating במשך 20 שניות ולהעביר כ 5.0 x 10 6 של חרוזים המניות (400 μl) צינורות microcentrifuge.
    הערה: Tהוא החרוזים מסופקים בריכוז של 12.5 x 10 6 חרוזים / ml.
  2. גלולת חרוזי המניות על ידי צנטריפוגה ב XG 10,000 במשך 2 דקות.
  3. הסר את supernatant ו resuspend את החרוזים pelleted ב 100 μl מים מזוקקים (DH 2 O) על ידי מערבולת sonication במשך 20 שניות. חזור על שלב 1.2.
  4. הסר את supernatant ו resuspend חרוזים שטף ב -80 μl של 100 monobasic נתרן פוספט מ"מ, pH 6.2 ידי מערבולת sonication במשך 20 שניות.
  5. מיד לפני השימוש, להכין 50 מ"ג / מ"ל N -hydroxysulfosuccinimide (sulfo-NHS) הפתרון על ידי הוספת 200 μl DH 2 O ל aliquot 10 מ"ג sulfo-NHS. מערבבים על ידי מערבולת.
  6. הוסף 10 μl של 50 מ"ג / מ"ל ​​sulfo-NHS על חרוזים. מערבבים על ידי מערבולת.
  7. מיד לפני השימוש, להכין 50 מ"ג / מ"ל 1-ethyl- [3dimethylaminopropyl] hydrochloride carbodiimide (EDC) הפתרון על ידי הוספת 200 μl מים מזוקקים (DH 2 O) אל aliquot 10 מ"ג EDC. מערבבים על ידי מערבולת.
  8. הוסף 10 μl של 50מ"ג / מ"ל ​​פתרון EDC אל חרוזים. מערבבים על ידי מערבולת. דגירה חרוזים עבור 20 דקות בטמפרטורת החדר, בחושך, עם ערבוב ידי מערבולת ב 10 מרווחי דקות. גלולת החרוזים מופעלים על ידי microcentrifugation ב XG 10,000 במשך 2 דקות.
  9. הסר את supernatant ו resuspend את החרוזים 250 μl של 50 מ"מ 2 [N -Morpholino] חומצה ethanesulfonic (MES), pH 5.0 ידי מערבולת sonication במשך 20 שניות.
  10. גלולת החרוזים מופעלים על ידי microcentrifugation ב XG 10,000 במשך 2 דקות.
  11. חזור על שלבים 1.9 ו 1.10.
    הערה: זה מספק סך של שני שוטף עם 50 מ"מ MES, pH 5.0.
  12. Resuspend את החרוזים 100 μl של 50 MES מ"מ, pH 5.0 ידי מערבולת sonication במשך 20 שניות.

2. חרוז זיווגים

  1. זוג אנטיגנים על הסטים החרוזים באמצעות הריכוזים שניתן לראות בטבלת 1.
  2. הוסף כל אנטיגן כדי חרוזים מופעל ולהביא את הנפח הכולל עד 500 μl ב 50 מ"מ MES, pH 5.0. מערבבים את האנטיגניםחרוזי ד ידי מערבולת.
  3. דגירה אנטיגנים וחרוזים עבור שעה 2 עם ערבוב על ידי סיבוב (~ 15 סל"ד) בטמפרטורת החדר בחושך. גלולת החרוזים מצמידים ידי microcentrifugation ב XG 10,000 במשך 2 דקות.
  4. הסר את supernatant ו resuspend את החרוזים 500 μl של בופר פוספט (PBS) אלבומין -bovine (BSA) monolaurate -polyoxyethylenesorbitan (Tween-20) -sodium אזיד (PBS-TBN) pH 7.4 ידי מערבולת sonication. גלולה חרוזים על ידי microcentrifugation ב XG 10,000 במשך 2 דקות ולהסיר את supernatant.
    זהירות: אזיד הנתרן הוא כימיקל רעיל בחריפות. זה קטלני אם בלע או מקבל במגע עם העור. לא לנשום אבק / קטר / גז / ערפל / אדים או תרסיס. ללבוש ציוד מגן אישי מתאים (PPE של) בעת טיפול ולהיפטר בהתאם לחוקים המתאימים.
  5. Resuspend את החרוזים 1 מ"ל של PBS-TBN ידי מערבולת sonication במשך 20 שניות.
  6. גלולה חרוזים על ידי microcentrifugation ב XG 10,000 במשך 2 דקות.
  7. חזור על שלבים 2.5 ו -2.6.
    הערה: זה מספק סך של שני שוטף עם PBS-TBN.
  8. Resuspend החרוזים מצמידים ורחץ ב 1 מ"ל של PBS, 1% BSA, 0.05% אזיד, pH 7.4. אחסן את החרוזים מצמידים במקרר 2-8 מעלות צלזיוס בחושך.

3. ספירת חרוז

  1. כן 1:10 דילול של החרוזים בשילוב במים או חיץ PBS.
  2. טען 10 μl של דילול חרוז גבי hemocytometer בנקודת מבוא המדגם.
  3. רוזן חרוז ראה באחד הרשתות בפינה 4 x 4. חשב את המספר הכולל של חרוזים מצמידים באמצעות הנוסחה הבאה: הרוזן (1 בפינת 4 x 4 רשת) x (1 x 10 4) x (גורם לדילול) x resuspension נפח מ"ל.

4. אישור של Antigen זיווגים

  1. Resuspend את תערובת המניות של חרוזי מצמידי אנטיגנים של עניין על ידי מערבולת sonication במשך 20 שניות.
  2. הכינו תערובת חרוז עובד על ידי דילול מניות חרוז מצמידים את סופיריכוז של 100 חרוזים / μl של כל חרוז ייחודי להגדיר במאגר PBS-1% BSA (PBS-1% BSA, pH 7.4).
  3. הכן לפחות 7 שני דילולי סדרה של מינים אנטי נוגדני IgG עיקריים על פי המלצות היצרן בצלחת תחתונה 96-גם עגולה עם חיץ BSA% PBS-1.
  4. טרום להרטיב טור 8-גם נפרד (8 שורות) של צלחת 96-גם מסנן תחתונה עבור כל בדיקת אישור צימוד אנטיגן עם 100 μl של חיץ לשטוף ולהסיר supernatant ידי ואקום. הוסף 50 μl של עובד תערובת חרוז (חרוזי מצמידי אנטיגן) אל הבארות טרום הרטובות.
  5. הוסף 50 μl של דילולים נוגדנים שורות 1-7 של כל עמודה של צלחת מסנן 96-היטב 50 μl של חיץ PBS-1% BSA לחתור 8 במקום נוגדן מדולל לשמש בארות רקע. מערבבים עם פיפטור רב ערוצית על ידי pipetting למעלה ולמטה 5 פעמים. בצע אותו התהליך עבור כל סט חרוז מצמידי אנטיגן כדי להיות מאושר.
  6. מכסים ולאפשר כדי לדגור בחושך בטמפ 'החדרerature עבור שעה 1 על שייקר microplate ב 500 סל"ד. הסר supernatant ידי ואקום.
  7. לשטוף בארות עם 100 μl של חיץ לשטוף ולהסיר supernatant ידי ואקום. חזור 1x. Resuspend את החרוזים 50 μl של BSA% PBS-1 עם פיפטור רב ערוצי.
  8. לדלל biotinylated אנטי-מינים ספציפיים נוגדן זיהוי משני IgG ל -16 מיקרוגרם / מ"ל ​​BSA% PBS-1.
  9. הוסף 50 μl של נוגדנים משני מדולל היטב כל על ידי pipetting למעלה ולמטה 5 פעמים.
  10. מכסים בצלחת מסנן ולאפשר כדי לדגור בחושך בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות על שייקר צלחת. הסר supernatant ידי ואקום. לשטוף בארות עם 100 μl של חיץ לשטוף ולהסיר supernatant ידי ואקום. חזור על לשטוף 1x.
  11. Resuspend את החרוזים 50 μl של BSA% PBS-1 עם פיפטור רב ערוצי.
  12. לדלל הכתב streptavidin-R-Phycoerythrin (SAPE) עד 24 מיקרוגרם / מ"ל ​​ב BSA% PBS-1.
  13. הוסף 50 μl של כתב היטב כל ומערבבים ידי pipetting למעלה ולמטה 5 פעמים.
  14. Cמעל צלחת מסנן ולאפשר כדי לדגור בחושך בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות על שייקר צלחת. הסר supernatant ידי ואקום. לשטוף בארות עם 100 μl של חיץ לשטוף ולהסיר supernatant ידי ואקום. חזור על לשטוף 1x.
  15. חרוזים Resuspend ב 100 μl של BSA% PBS-1 ולנתח 50 μl באמצעות מנתח 29.
    הערה: תוצאות של immunoassay זמנית מבוסס החרוז נמדדות בעוצמת קרינת חציון (MFI). תמיד מתייחס לגרסה האחרונה של מדריך התוכנה, אם היא זמינה, כדי למנוע טעויות.

5. הרוק Multiplex Immunoassay

  1. סר רוק מהמקפיא -80 ° C ולאפשר להפשיר בטמפרטורת חדר.
  2. Resuspend אנטיגן מצמיד מניות חרוז ידי מערבולת sonication במשך 20 שניות.
  3. הכינו תערובת חרוז עובד על ידי דילול מניות חרוז מצמידים לריכוז סופי של 100 חרוזים / μl של כל קבוצה חרוז ייחודי חיץ BSA% PBS-1.
  4. הכן דילול 1: 4 של הרוק wה- i-PBS 1% חיץ BSA בתוך 96 באר, צלחת באר עמוקה.
  5. צלחת מסנן טרום רטוב עם 100 μl של חיץ לשטוף ולהסיר supernatant ידי ואקום.
  6. הוסף 50 μl של תערובת חרוז עבודת נפח שווה של רוק מדולל ל 95 בארות של 96 הצלחות המסננות גם עבור דילול 1: סופי 8. מערבב תגובות עם פיפטור רב ערוצים. הפיקוח אחד היטב, מוסיפים 50 חרוזים μl מצמידים אנטיגן פלוס 50 μl של חיץ PBS-1% BSA (כתחליף הרוק).
  7. מכסים ולאפשר כדי לדגור בחושך בטמפרטורת החדר למשך שעה 1 על שייקר microplate ב 500 סל"ד. הסר supernatant ידי ואקום. לשטוף בארות עם 100 μl של חיץ לשטוף ולהסיר supernatant ידי ואקום. חזור על לשטוף 1x.
  8. חרוזים Resuspend ב 50 μl של BSA% PBS-1 עם פיפטור רב ערוצי.
  9. לדלל נוגדן זיהוי משני אנטי אנושי עז biotinylated IgG ל -16 מ"ל מיקרוגרם / ב BSA% PBS-1.
  10. הוסף 50 μl מדולל נוגדנים משני זה טוב ומערבבים תוכן עםפיפטור רב ערוצים.
  11. מכסים בצלחת מסנן ולאפשר כדי לדגור בחושך בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות על שייקר צלחת. הסר supernatant ידי ואקום. לשטוף בארות עם 100 μl של חיץ לשטוף ולהסיר supernatant ידי ואקום. חזור על לשטוף 1x.
  12. חרוזים Resuspend ב 50 μl של BSA% PBS-1 עם פיפטור רב ערוצי.
  13. לדלל הכתב streptavidin-R-Phycoerythrin (SAPE) עד 24 מיקרוגרם / מ"ל ​​ב BSA% PBS-1.
  14. הוסף 50 μl כתב היטב כל ומערבבים עם פיפטור רב ערוצים.
  15. מכסים בצלחת מסנן ולאפשר כדי לדגור בחושך בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות על שייקר צלחת. הסר supernatant ידי ואקום. לשטוף בארות עם 100 μl של חיץ לשטוף ולהסיר supernatant ידי ואקום. חזור על לשטוף 1x.
  16. חרוזים Resuspend ב 100 μl של BSA% PBS-1 ולנתח 50 μl באמצעות מנתח 29.
    הערה: תוצאות של immunoassay זמנית נמדדות Intensity חציון הקרינה (MFI) יחידות. תמיד מתייחסיםאת הגרסה האחרונה של מדריך התוכנה, אם היא זמינה, כדי למנוע טעויות.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

סט חרוז ייחודי אחת שמש כביקורת למדוד הלא ספציפי מחייב מדגם לדגום השתנות. חרוזים אלה טופלו באופן זהה חרוזים בשילוב אנטיגן למעט העובדה שהם לא הודגרו עם כל אנטיגן בשלב צימוד. ערכי MFI> 500 מתקבל החרוזים המלאים מודגרות עם כל דגימות הרוק הוצאו עוד מנתח עקב זיהום חשוד בסרום ואת התגובות שנותרו יומן מבוזרות. הרוק יכול להיות מזוהם עם סרום אם החניכיים הם שפשפו גם נמרצות עם הספוג המצורף למכשיר האוסף או אם המשתתף במחקר יש מחלת חניכיימיים. יומן טרנספורמציה נ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

תוצאות אלו מצביעות כי השיטה immunoassay זמנית שימושי להפלות בין דגימות רוק כי הם immunopositive או immunonegative. כדי לקבוע immunopositivity, נקודה אחת חתוכים פותחה על ידי חישוב הממוצע פלוס שלוש סטיות תקן מן תגובות MFI טרנספורמציה יומן של החרוזים המלאים הזוגיים נבדקו עם כל דגימות הרוק. הנקודה החתוכה ספקה את היכולת להעריך את החשיפה ואת immunoprevalence או א פתוגנים בודדים או מרובים. כוח מפלה זה עשוי להיות שימושי מחקרי אוכלוסייה לחקור סיכונים בריאותיים הקשורים עם חשיפה לפתוגנים סבי...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

הסוכנות להגנת הסביבה בארצות הברית באמצעות אופיס של מחקר ופיתוח במימון וניהל את המחקר המתואר כאן. זה כבר נתון הביקורת המנהלית של הסוכנות ואושר לפרסום. אזכור של שמות מסחריים או מוצרים מסחריים אינו מהווה אישור או המלצה לשימוש.

תודות

קלריסה קוריוזו נתמכה באמצעות מינוי לתוכנית ההשתתפות במחקר בסוכנות להגנת הסביבה של ארה"ב המנוהלת על ידי מכון אוק רידג' למדע וחינוך באמצעות הסכם בין-סוכנותי בין משרד האנרגיה האמריקאי ל-EPA האמריקאי.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
<חזק>ציוד ותוכנה
מיקרו-צנטריפוגהתרמו אלקטרונים תאגיד75002446משמש לדגימות צנטריפוגה
מערבל מערבולתVWRG560משמש לערבוב דגימות
סוניקטור (מיני)פישר סיינטיפיק15-337-22משמש להפרדת חרוזים
פיפטורים P10, P20, P100, P1000, 8 ch. Capp
שונים המציטומטר (קו בהיר)Housser Scientific 3200משמש לספירת חרוזים מצומדים
Multiscreen Vacuum ManifoldMilliporeMSVMHTS00 משמש בשלבי כביסה להסרת Supernatant
MicroShakerVWR12620-926משמש לתסיסה של חרוזים במהלך הדגירה
מתלה צינור (1.5 מ"ל ו-0.5 מ"ל) (מגוון)VWR30128-346
משקל שקילהמטלר או אחרמשמש למדידת ריאגנטים לכביסה להכנת מאגרים
Dynabead Sample MixerInvitrogen947-01משמש במהלך שלב הדגירה של הצימוד
MatLab (R2014b)The MathWorks, Inc.משמש לניתוח נתוני תגובת נוגדנים
Microsoft Excel 2014Microsoft Corporationמשמש לניתוח נתוני תגובת נוגדנים
מנתח Luminex עם תוכנת xPonent 3.1Luminex CorporationLX200-XPON3.1מכשיר ותוכנה המשמשים להפעלת מבחן
<חזק>אנטיגנים
GI.1 וירוס נורווק: p-particleXi ג'יאנג (CCHMC)*NA*בית החולים לילדים בסינסינטי. קונקציה סופית 5 µg.
GII.4 נורו-וירוס VA387: חלקיק pשי ג'יאנג (CCHMC)*NA*בית החולים לילדים בסינסינטי. קונקציה סופית 5 µg.
נגיף הפטיטיס A: תרכיז דרגה II מתרבית תאיםMeridian Life Sciences8505אנטיגן בשילוב 100 ומיקרו; g
Helicobacter pylori: ליזאטמרידיאן מדעי החייםR14101אנטיגן בשילוב 25 ומיקרו; g
Toxoplasma gondii: p30 רקומביננטי (SAG1)מרידיאן מדעי החייםR18426אנטיגן בשילוב ב-25 ומיקרו; g
Campylobacter jejuni: הרג בחום תאים שלמיםKPL50-92-93אנטיגן בשילוב 50 ומיקרו; g
נוגדנים ראשוניים
נוגדנים נגד נורו-וירוסCCHMC)*NAמשמש לאישור צימוד
עכבר נגד הפטיטיס A IgGמרידיאן מדעי החייםC65885Mמשמש לאישור צימוד
עכבר נגד הפטיטיס A IgGמרידיאן מדעי החייםC65885Mמשמש לאישור צימוד
BacTraceAffinity נוגדן מטוהר ל-Helicobacter pyloriKPL01-93-94משמש לאישור צימוד
עז pAb ל טוקסופלזמה gondiiAbcamAb23507משמש לאישור צימוד
BacTrace עז אנטי-Campylobacter מיןKPL01-92-93משמש לאישור
צימוד<חזק>משני  נוגדנים
ביוטין-SP-מצומד AffiniPure Donkey נגד עזים IgG (H+L)Jackson705-065-149משמש לאישור צימוד
ארנב ביוטיניל נגד עזים IgG (H+L)KPL16-13-06משמש לאישור צימוד
עז ביוטיניל נגד עכבר IgG (H+L)KPL16-18-06משמש לאישור
צימודנוגדן מטוהר זיקה ביוטין עם תווית עז נגד ארנב IgG (H+L)KPL176-1506משמש לאישור צימוד
<חזק>חומרים מתכלים
1.5 מ"ל צינורות מיקרוצנטריפוגה קופולימרארה"ב מדעי1415-2500משמש כצינורות מיקרוצנטריפוגה מחייבים נמוכים
10 ומיקרו; l מילוי קצה פיפטהBioVentures5030050C
200 ומיקרו; l מילוי קצה פיפטהBioVentures5030080C
1,000 ומיקרו; l מילוי קצה פיפטהBioVentures5130140C
רדיד אלומיניוםספקיםהמשמשים לשמור חרוזים בחושך במהלך הדגירה
לוחות באר עמוקהVWR40002-009משמש לדילול דגימות רוק
לוחות סינון מרובי מסךMilliporeMABVN1250משמש להפעלת בדיקות
איסוף רוק של OracolMalvern Medical פיתוחים מוגבליםמשמש לאיסוף רוק
<ריאגנטים חזקים>ריאגנטים
מיקרוספירות קרבוקסיל (חרוזים)תאגיד לומינקסתלוי בסט חרוזיםאנטיגנים מחוברים למיקרוספירות
EDC (1-אתיל-3-[3-דימתילאמינפרופיל] קרבודימיד הידרוכלוריד)פירס77149 או 22980משמש בהפעלת
חרוזיםSulfo-NHS (N-hydroxysulfosuccinimide)Pierce24510משמש בהפעלת חרוזים
Steptavidin-R-phycoerythrin (1 מ"ג/מ"ל)בדיקות מולקולריותS-866משמש כמדווח
MES (2-[N-Morpholino]ethanesulfonic acid)SigmaM-2933משמש לצימוד
Tween-20 (Polyoxyethylenesorbitan monolaurate)SigmaP-9416משמש במאגר כביסה להסרת חוצץ קשירה לא ספציפי
<חזק>חוצץ חלבון
<חזק>PBS-TBN מאגר חסימה/אחסון (PBS, 0.1% BSA, 0.02% Tween-20, 0.05% אזיד, pH 7.4)**מסנןלעקר ולאחסן בטמפרטורה של 4 מעלות; C
PBS, pH 7.4SigmaP-3813138 מ"מ NaCl, 2.7 מ"מ KCl
BSASigmaA-78880.1% (w/v)
Tween-20SigmaP-94160.2% (v/v)
נתרן אזיד (0.05% אזיד)**סיגמאS-8032**<חזק>זהירות: נתרן אזיד רעיל באופן חריף. יש להימנע ממגע עם העור והעיניים. ללבוש ציוד הגנה אישי מתאים. השלך בהתאם לחוקים החלים.
<חזק>MES/מאגר צימוד (0.05 M MES, pH 5.0)
MES (2-[N-Morpholino] חומצה אתנסולפונית)SigmaS-3139
5 N NaOHFisherSS256-500
<חזק>מאגר בדיקה (PBS, 1% BSA, pH 7.4)  מסנן יש לעקר ולאחסן בטמפרטורה של 4 מעלות; C
PBS, 1% BSA, pH 7.4SigmaP-3688138 מ"מ NaCl, 2.7 מ"מ KCl, 1% BSA
<חזק>מאגר הפעלה (0.1 מ' NaH<תת><חזק>2<חזק>PO<תת><חזק>4<חזק>, pH 6.2)מסנן לעקר ולאחסן בטמפרטורה של 4 מעלות; C
NaH2PO4 (נתרן פוספט, חד מימי)SigmaS-31390.1 M NaH2PO4
5 N NaOHFisherSS256-500
<חזק>מאגר שטיפה (PBS, 0.05% Tween-20, pH 7.4)מסנן לעקר ולאחסן ב-4 מעלות; C
PBS, 0.05% טווין-20, pH 7.4סיגמאP-3563138 מ"מ NaCl, 2.7 מ"מ KCl, 0.05% טווין
( שונים מערכת

מקורות

  1. Prüss-Üstün, A., Gore, F., Bartram, J. Safer water, better health: costs, benefits and sustainability of interventions to protect and promote health. , World Health Organization. Geneva. (2008).
  2. Augustine, S., et al. Statistical approaches to developing a multiplex immunoassay for determining human exposure to environmental pathogens. J Immunol Methods. 425, 1-9 (2015).
  3. Griffin, S., et al. Application of salivary antibody immunoassays for the detection of incident infections with Norwalk virus in a group of volunteers. J Immunol Methods. 424, 53-63 (2015).
  4. Griffin, S., Chen, I., Fout, G., Wade, T., Egorov, A. Development of a multiplex microsphere immunoassay for the quantitation of salivary antibody responses to selected waterborne pathogens. J Immunol Methods. 364 (1-2), 83-93 (2011).
  5. Ferguson, D. Current diagnostic uses of saliva. J Dent Res. 66, 420-424 (1987).
  6. Mandel, I. The diagnostic uses of saliva. J Oral Pathol Med. 19, 119-125 (1990).
  7. Malamud, D. Saliva as a Diagnostic Fluid. Brit Med J. 305, 207-208 (1992).
  8. Ballam, L., et al. Western blotting is useful in the salivary diagnosis of Helicobacter pylori infection. J Clin Pathol. 53, 314-317 (2000).
  9. Estevez, P., Satoguina, J., Nwakanma, D., West, S., Conway, D., Drakeley, C. Human saliva as a source of anti-malarial antibodies to examine population exposure to Plasmodium falciparum. Malar J. 10, 104(2011).
  10. Abd-Alla, M., Jackson, T., Reddy, S., Ravdin, J. Diagnosis of invasive amebiasis by enzyme-linked immunosorbent assay of saliva to detect amebic lectin antigen and anti-lectin immunoglobulin G antibodies. J Clin Microbiol. 38 (6), 2344-2347 (2000).
  11. Toyoguchi, A., et al. Antibody reactivity to Cryptosporidium parvum in saliva of calves after experimental infection. J Vet Med Sci. 62 (11), 1231-1234 (2000).
  12. Choo, S., Zhang, Q., Seymour, L., Akhtar, S., Finn, A. Primary and booster salivary antibody responses to a 7-valent pneumococcal conjugate vaccine in infants. J Infect Dis. 182 (4), 1260-1263 (2000).
  13. Tourinho, R., et al. Importance of the cutoff ratio for detecting antibodies against hepatitis A virus in oral fluids by enzyme immunoassay. J Virol Methods. 173 (2), 169-174 (2011).
  14. Moorthy, M., Daniel, H., Kurian, G., Abraham, P. An evaluation of saliva as an alternative to plasma for the detection of hepatitis C virus antibodies. Indian J Med Microbiol. 26 (4), 327-332 (2008).
  15. Moe, C., Sair, A., Lindesmith, L., Estes, M., Jaykus, L. Diagnosis of norwalk virus infection by indirect enzyme immunoassay detection of salivary antibodies to recombinant norwalk virus antigen. Clin Diagn Lab Immunol. 11 (6), 1028-1034 (2004).
  16. Yap, G., Sil, B., Ng, L. Use of saliva for early dengue diagnosis. PLoS Negl Trop Dis. 5 (5), e1046(2011).
  17. Schramm, W., Angulo, G., Torres, P., Burgess-Cassler, A. A simple saliva-based test for detecting antibodies to human immunodeficiency virus. Clin Diagn Lab Immunol. 6 (4), 577-580 (1999).
  18. Chart, H., Perry, N., Willshaw, G., Cheasty, T. Analysis of saliva for antibodies to the LPS of Escherichia coli O157 in patients with serum antibodies to E. coli O157 LPS. J Med Microbiol. 52 (Pt 7), 569-572 (2003).
  19. Ashbolt, N., Bruno, M. Application and refinement of the WHO risk framework for recreational waters in Sydney, Australia. J Water Health. 1 (3), 125-131 (2003).
  20. Westrell, T., Schonning, C., Stenstrom, T., Ashbolt, N. QMRA (quantitative microbial risk assessment) and HACCP (hazard analysis and critical control points) for management of pathogens in wastewater and sewage sludge treatment and reuse. Water Sci Technol. 50 (2), 23-30 (2004).
  21. Ashbolt, N. Microbial contamination of drinking water and disease outcomes in developing regions. Toxicology. 198 (1-3), 229-238 (2004).
  22. Eisenberg, J., Soller, J., Scott, J., Eisenberg, D., Colford, J. Jr A dynamic model to assess microbial health risks associated with beneficial uses of biosolids. Risk Anal. 24, 221-236 (2004).
  23. Wade, T. J., et al. Report on 2009 National Epidemiologic and Environmental Assessment of Recreational Water Epidemiology Studies, US EPA. US EPA Report Number: EPA/600/R-10/168: US EPA2011. , (2011).
  24. Fujii, Y., et al. Serological surveillance development for tropical infectious diseases using simultaneous microsphere-based multiplex assays and finite mixture models. PLoS Negl Trop Dis. 8, e3040(2014).
  25. Rota, M., Massari, M., Gabutti, G., Guido, M., De Donno, A., Ciofi degli Atti, M. Measles serological survey in the Italian population: interpretation of results using mixture model. Vaccine. 26 (34), 4403-4409 (2008).
  26. Vyse, A., Gay, N., Hesketh, L., Pebody, R., Morgan-Capner, P., Miller, P. Interpreting serological surveys using mixture models: the seroepidemiology of measles, mumps and rubella in England and Wales at the beginning of the 21st century. Epidemiol Infect. 134 (6), 1303-1312 (2006).
  27. Baughman, A., et al. Establishment of diagnostic cutoff points for levels of serum antibodies to pertussis toxin, filamentous hemagglutinin, and fimbriae in adolescents and adults in the United States. Clin Diagn Lab Immunol. 11 (6), 1045-1053 (2004).
  28. Clotilde, L., Bernard, C. IV, Hartman, G., Lau, D., Carter, J. Microbead-based immunoassay for simultaneous detection of Shiga toxins and isolation of Escherichia coli O157 in foods. J Food Prot. 74 (3), 373-379 (2011).
  29. Luminex User Software Manual (RUO) xPONENT 3.1 Rev. 2. 3, 6-102 (2014).
  30. Waterboer, T., Sehr, P., Pawlita, M. Suppression of non-specific binding in serological Luminex assays. J Immunol Methods. 309 (1-2), 200-204 (2006).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

Streptavidin R PE
פיתוח Immunoassay רוק נוגדן Multiplex כדי לאמוד את חשיפת אדם לפתוגנים הסביבה
צור קשר
המלצה לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

2026 © זכויות יוצרים MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.