Method Article

פיתוח מודל קוליטיס מונחה Antigen ללמוד מצגת של אנטיגנים על ידי אנטיגן הצגת תאים לתאי T

DOI:

10.3791/54421

⸱

September 18th, 2016

 ,  ,  , 
1APC Microbiome Institute, University College Cork, 2Division of Gastroenterology and Hepatology, University Hospital Basel, 3Institute of Microbiology and Biotechnology, University of Ulm

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

במודל קוליטיס מונע אנטיגן זה, תאי OT-II CD4+ T המבטאים חלבון פלואורסצנטי אדום הועברו באופן מאומץ לעכברי RAG-/- המבטאים חלבון פלואורסצנטי ירוק בפגוציטים חד-גרעיניים (MPS). המארחים אותגרו עם Escherichia coli (E.coli) המבטא את חלבון האובאלבומין (OVA) שהתמזג לחלבון פלואורסצנטי ציאן (CFP).

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מחלת מעי דלקתית (IBD) היא דלקת כרונית הפוגעת במערכת העיכול (GIT). אחת הדרכים הטובות ביותר לחקור את המנגנונים האימונולוגיים המעורבים במהלך המחלה היא מודל העברת תאי T של קוליטיס. במודל זה, עכברים חסרי חיסון (מקבלי RAG-/-) מורכבים מחדש עם תאי CD4+ T נאיביים ממארחים בריאים מסוג בר.

מודל זה מאפשר לבחון את האירועים האימונולוגיים המוקדמים ביותר המובילים למחלה ולדלקת כרונית, כאשר דלקת המעי מנציחה אך אינה תלויה באנטיגן מוגדר. כדי לחקור את התפקיד הפוטנציאלי של תאים מציגי אנטיגן (APCs) בתהליך המחלה, כדאי שיהיה מודל מחלה מונע אנטיגן, שבו אנטיגן מוגדר שמקורו בקומנסל מוביל לקוליטיס. לכן פותח מודל קוליטיס מונע אנטיגן. במודל זה תאי OT-II CD4+ T, שיכולים לזהות רק אפיטופים ספציפיים בחלבון OVA, מועברים למארחי RAG-/- מאותגרים עם E. coli המבטא CFP-OVA. מודל זה מאפשר לבחון את האינטראקציות בין APCs לתאי T בלמינה פרופריה.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המעי הוא השטח הגדול ביותר של הגוף, כי הוא חשוף לסביבה החיצונית. מערכים מכריעים של חיידקי תושב ליישב את המעי האנושי כדי ליצור את החיידקים במעי (או microflora). זה מוערך להכיל עד 100 טריליון תאים מיקרוביאליים ומהווה אחד בתי הגידול החיידקים הצפופים ביותר הידוע בביולוגיה 1-3. ב GIT חיידקים ליישב נישה המעי שבו הם לשרוד ולהתרבות 4. בתמורה, החיידקים מעניקים מארח עם תכונות פונקציונליות נוספות לא מקודדות על הגנום שלו 1. לדוגמא החיידקים ממגרים את השגשוג של תאי אפיתל, מייצרים ויטמינים שמארח לא יכול לייצר בעצמם, המווסתים את חילוף חומרים ומגנים מפני פתוגנים 4-6. בהינתן יחסים מועילים זו, חלק מהחברי....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עכברים גידלו והמשיך בתנאים הפתוגן ללא ספציפי (SPF) במתקן חיה של אוניברסיטת Ulm (Ulm, גרמניה). כל הניסויים בבעלי חיים בוצעו בהתאם להנחיות של השימוש בבעלי חיים הוועדה המקומית טיפול וחוק צער בעלי חיים הלאומי.

1. בנייה של פלסמיד pCFP-OVA

  1. להגביר את הגן OVA בגודל מלא באמצעות פריימרים Ova_SpeI_fw (3'-GACCAACTAGTATGGAATTTTGTTTTGATGTATT-5 ') ו Ova_ClaI_rev (3'--5 GACCAGATCGATTAAGGGGAAACACATCTGCC') 37 באמצעות פלסמיד PCI-OVA (אמפיצילין עמידים)

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כדי להקים מודל קוליטיס מונחה אנטיגן E. זן coli נבנה המכילה פלסמיד שבו הגן על CFP הוא התמזג ברצף מקודד חלבון העוף ovalbumin ואת ההיתוך לבנות מתבטא בשליטה של (איור 1 א) האמרגן P Hyper המכונן החזק. מיקרוסקופ פלואורסצנטי מראה כי א רקומביננטי coli pCFP-OVA, אבל לא את א ההורית coli DH10B, מבטא CFP (איור 1B). CFP-OVA- לייצר E. coli

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כמו בכל מודל אחר, מודל קוליטיס מונחה אנטיגן שתואר לעיל רשאי להציג כמה בעיות שחוקר ביצוע הטכניקה חייב להיות מודע. כאשר הזרקת OT-II / אדום + CD4 + T CD62L + התאים המארחים, החוקר חייב להיות מאוד עדין וזהיר להכניס את המחט לתוך חלל הצפק. אי ביצוע הוראה זו עלולה לגרום הקריעה של המעי של העכבר אשר יכול לגרום למוות, או להזרקת תאים אשר יגרמו כל מחלה.

בדרך כלל, עכברים יעלו במשקל בשבוע הראשון.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למחברים אין מה לחשוף.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

JHN נתמך על ידי הקרן הלאומית השוויצרית (SNSF 310030_146290).

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
מרק LB, מילר (לוריא-ברטני)Difco244620
שייק סיבוביReiss Laborbedarf e. K.דגם 3020 GFL
2 מ"מ מרווח פערים Peqlab Biotechnologie GmbH71-2020
גליצרולסיגמא-אולדריץ'G5516-100ML
Gene Pulser מערכת Xcell BioRad Laboratories GmbH1652660
LB Agar, Miller (Luria-Bertani)Difco244510
AmpicillinSigma-AldrichA9393-5G
SOC MediumSigma-AldrichS1797-100ML
ערכת בידוד פלסמיד טהורה גבוההRoche11754777001
AgaroseCarl Roth GmbH & Co3810.1
EDTASigma-AldrichE9884-100G
Tris-HClSigma-AldrichT5941
חומצה אצטית קרחוניתSigma-Aldrich537020 
תא ג'ל PEQLAB Biotechnology GmbH40-0708
טוען צבעתרמו פישרR0611
GeneRuler 1 kb סולם DNA Thermo FisherSM0312
תמיסת אתידיום ברומידCarl Roth GmbH & Co. KG2218.3
מערכת תיעוד תמונות Decon Science Tech GmbHDeVision G 
ריצוף DNA MWG-Biotech GmbH
פוספט חוצץ מלח (PBS)BiochromL182-50
מיקרוסקופ פלואורסצנטי ZeissHBO 100
Mini-PROTEAN Tetra SystemBio-Rad Laboratories GmbH1658005
PageRuler סולם חלבון צבוע מראש Fermentas, סנט לאון-רוט, גרמניה
IstanBlue SolutionExpedeon, קיימברידג'שייר, בריטניה
ממברנת ניטרוצלולוזה Macherey-Nagel GmbH & Co. KG741280
Electro blotter Biometra GmbH846-015-600
אלבומין סרום בקר (BSA)Sigma-AldrichA6003-25G
נוגדן נגד אובאלבומין Abcamab181688
אנטי ארנב IgG  HRPסיגמא-אולדריץ'A0545 
Pierce ECL Plus Western Blotting SubstratePierce Biotechnology, Thermo Fischer Scientific Inc32132
ForeneAbbott2594.00.00
FBSInvitrogen10500-064
מסנני תאי פלקוןפישר סיינטיפיק 08-771-2
אמוניום כלורידסיגמא-אולדריץ'254134-5G
Tris BaseSigma-Aldrich10708976001
CD4+ CD62 L+ ערכת בידוד T Miltenyi Biotec130-093-227 
טורי MACS LS Miltenyi Biotec130-042-401
עמודות MACS MS Miltenyi Biotec130-042-201
מפריד MidiMACSMiltenyi Biotec130-042-302
מפריד MiniMACSMiltenyi Biotec130-042-102
MACS MultiStandMiltenyi Biotec130-042-303
מחט האכלה 20GSouthPointe Surgical Supply, IncFN-7903
תמיסת פורמלין, ניטרלי חוצץ, 10%סיגמא-אולדריץ'HT501128
פרפיןסיגמא-אולדריץ'1496904
המטוקסיליןסיגמא-אולדריץ'H9627
Eosin ySigma-Aldrich230251 
דיתיותרייטולסיגמא-אולדריץ'D9779 
קולגנאז מסוג VIIIסיגמא-אולדריץ'C-2139
מכון הזיכרון רוזוול פארק (RPMI) בינוניAppliChemA2044, 9050
נתרן אזידסיגמא-אולדריץ'438456
עכבר BD Fc בלוקBD Pharmingen553141
מצומד FITC mAb מחייב Vß 5.1, 5.2 BD Pharmingen553189
כריכת mAb מצומד APC CD4 GK1.5 eBioscience17-0041-83
FACS קליבר BD Biosciences
FCS Express V3 תוכנהDeNovo
Meta סריקת מיקרוסקופ קונפוקלי צייסLSM 710 
Zeiss WorkstationZeissLSM 7
Zeiss ZEM תוכנה Zeissv4.2.0.121
צלחות חיסון מקסימליות NUNC, Roskilde442404
Streptavidin מצומד אלקליין פוספטאזJackson Immuno Research016-050-084
מצע פוספטאז אלקליין 4-ניטרופניל פוספט מלח דיסודיום הקסהידרטסיגמא-אולדריץ'71768-5G
mAb R4-6A2BD Biosciences551216
mAb XMG1.2 BD Biosciences554410
TECAN microplate-ELISA קוראTecan
EasyWin תוכנהTecan
DNase I רקומביננטי4536282001

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Backhed, F., Ley, R. E., Sonnenburg, J. L., Peterson, D. A., Gordon, J. I. Host-bacterial mutualism in the human intestine. Science. 307, 1915-1920 (2005).
  2. Cario, E., Podolsky, D. K. Intestinal epithelial TOLLerance versus inTOLLerance of commensals. Mol Immunol. 42, 887-893 (200....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Antigen Driven Colitis ModelT Cell Transfer ModelColonic Lamina PropriaAntigen Presenting CellsOT II CD4 T CellsCFP OVA Expressing E coliFlow Cytometry AnalysisConfocal Microscopy ImagingCell Isolation ProtocolTissue Digestion Method

Related Articles