הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

פיתוח מודל קוליטיס מונחה Antigen ללמוד מצגת של אנטיגנים על ידי אנטיגן הצגת תאים לתאי T

8.5K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/54421

⸱

18 בספטמבר 2016

 ,  ,  , 
1APC Microbiome Institute, University College Cork, 2Division of Gastroenterology and Hepatology, University Hospital Basel, 3Institute of Microbiology and Biotechnology, University of Ulm

במאמר זה

סיכום

במודל קוליטיס מונע אנטיגן זה, תאי OT-II CD4+ T המבטאים חלבון פלואורסצנטי אדום הועברו באופן מאומץ לעכברי RAG-/- המבטאים חלבון פלואורסצנטי ירוק בפגוציטים חד-גרעיניים (MPS). המארחים אותגרו עם Escherichia coli (E.coli) המבטא את חלבון האובאלבומין (OVA) שהתמזג לחלבון פלואורסצנטי ציאן (CFP).

תקציר

מחלת מעי דלקתית (IBD) היא דלקת כרונית הפוגעת במערכת העיכול (GIT). אחת הדרכים הטובות ביותר לחקור את המנגנונים האימונולוגיים המעורבים במהלך המחלה היא מודל העברת תאי T של קוליטיס. במודל זה, עכברים חסרי חיסון (מקבלי RAG-/-) מורכבים מחדש עם תאי CD4+ T נאיביים ממארחים בריאים מסוג בר.

מודל זה מאפשר לבחון את האירועים האימונולוגיים המוקדמים ביותר המובילים למחלה ולדלקת כרונית, כאשר דלקת המעי מנציחה אך אינה תלויה באנטיגן מוגדר. כדי לחקור את התפקיד הפוטנציאלי של תאים מציגי אנטיגן (APCs) בתהליך המחלה, כדאי שיהיה מודל מחלה מונע אנטיגן, שבו אנטיגן מוגדר שמקורו בקומנסל מוביל לקוליטיס. לכן פותח מודל קוליטיס מונע אנטיגן. במודל זה תאי OT-II CD4+ T, שיכולים לזהות רק אפיטופים ספציפיים בחלבון OVA, מועברים למארחי RAG-/- מאותגרים עם E. coli המבטא CFP-OVA. מודל זה מאפשר לבחון את האינטראקציות בין APCs לתאי T בלמינה פרופריה.

מבוא

המעי הוא השטח הגדול ביותר של הגוף, כי הוא חשוף לסביבה החיצונית. מערכים מכריעים של חיידקי תושב ליישב את המעי האנושי כדי ליצור את החיידקים במעי (או microflora). זה מוערך להכיל עד 100 טריליון תאים מיקרוביאליים ומהווה אחד בתי הגידול החיידקים הצפופים ביותר הידוע בביולוגיה 1-3. ב GIT חיידקים ליישב נישה המעי שבו הם לשרוד ולהתרבות 4. בתמורה, החיידקים מעניקים מארח עם תכונות פונקציונליות נוספות לא מקודדות על הגנום שלו 1. לדוגמא החיידקים ממגרים את השגשוג של תאי אפיתל, מייצרים ויטמינים שמארח לא יכול לייצר בעצמם, המווסתים את חילוף חומרים ומגנים מפני פתוגנים 4-6. בהינתן יחסים מועילים זו, חלק מהחברים הציעו כי בני אדם הם "סופר-אורגניזמים" או "holobionts" כי הם תערובת של גני חיידקי אדם 7,8. לאור ההשפעה המיטיבה של החיידקים על המארח (אדם), מערכת החיסון במעי צריך לסבול חיידקים commensal לאפשר קיומם לומן אלא גם להרוג את הפתוגנים לפלוש מצד לומינל 9-11. המערכת החיסונית של המעי פיתחה מנגנונים להבחין בין מזיק מזיקים חיידקים לומינל; אולם המנגנונים האלה עדיין אינם מובנים היטב 12. שמירה על שלמות מעיים דורשת הומאוסטזיס חיסוני מוסדר בחוזקה כדי לשמור על האיזון בין הסובלנות חסינה 13. חוסר איזון הומאוסטזיס חיסון תורם לזירוז של מחלות מעיים כמו מחלות מעי דלקתיות (IBD) 3,14.

ישנם שני סוגים עיקריים של IBD: מחלת קרוהן (CD) וקוליטיס כיבית (UC). חולים עם מחלות אלו בדרך כלל סובלים דימום רקטלי, לשלשולים חריפים וכאבי בטן 15,16. הגורם היחיד של IBD עדייןלא ידוע, אלא שילוב של גורמים גנטיים, השפעות סביבתיות תגובות חיסוניות dysregulated עשוי להיות האירוע המרכזי לפיתוח מחלה 15.

במודלים של בעלי חיים עבור IBD שימשו במשך למעלה מ -50 שנה. בעשורים האחרונים מערכות הדגם החדש IBD פותחו כדי לבדוק את השערות שונות בנוגע בפתוגנזה של IBD 17,18. המודל הטוב ביותר המאופיין של קוליטיס כרוני הוא המודל המדבק התא שגורם שיבוש הומאוסטזיס T-cell 19,20. מודל זה כרוך בהעברת תאי T נאיביים מעכברי immunocompetent לתוך מארחים חסרי T ו- B-תאי (כגון RAG - / - ועכברי SCID) 16,21. התפתחות המחלה במודל זה קיים מעקב על 3-10 שבועות על ידי הערכת נוכחות של שלשול, פעילות גופנית מופחתת, וירידה במשקל הגוף. זה מה שנקרא תסמונת לבזבז 16. לעומת העכברים הבריאים הרקמה גסת צבאות מושתלים היא Thicker, קצר וכבד 16. שימוש במודל העברת תאי T, אפשר להבין עד כמה שונה אוכלוסיות תאי T יכולות לתרום בפתוגנזה של IBD 22. המודל העברת תאי T אינו מנתח את יחסי הגומלין בין נגמ"שים ותאי T בתהליך המחלה בצורה אנטיגן ספציפי. הוכח כי אינטראקציה בין תאי מיאלואידית ותאי הלימפה יכולה להיות אחראית על הפיתוח של דלקת מעי 23. אף שהיבטים רבים של IBD הובהרו, האירועים הראשוניים להוביל להתפתחות המחלה עדיין צריכים להיות מובנים באופן ברור.

הוכח כי בהעדר קוליטיס העברת חיידקים לא ניתן להקים 24. לאחרונה, מספר תאוריות מראות כי IBD יכול להיות תוצאה של תגובה חיסונית נגד חיידקי commensal 25. גם מחברים הציעו כי חיידקים commensal חיוניים כדי לגרום דלקת במעי דיסטלי26. בשנת נבט חינם (GF) חיות מערכת החיסון במעי נפגעת בדרך כלל 27,28, אבל קולוניזציה של עכברים אלה בתערובת של תוצאות חיידקים ללא ספציפיים לפתוגן בפיתוח של מערכת החיסון במעי המוסמכת מלא 29. לפיכך, החיידקים נראה שיש מרכיב מפתח בפתוגנזה של IBD, או כמנגנון כי גוזר או מגינה מפני התפתחות של דלקת מעיים 30,31. התיאוריות נוכחיות מראות כי IBD היא תוצאה של חוסר איזון מיקרוביאלי, שנקרא dysbiosis, בחולי נטייה גנטית 32, אבל זה לא ברור עדיין אם dysbiosis הוא הגורם או התוצאה של המחלה 12. בהתחשב בתפקיד של מיקרואורגניזמים בפיתוח IBD, בניסויים במבחנה הראו כי תאי T מסוג CD4 + יכול להיות מופעל על ידי נגמ"שים פעמו עם חיידקים במעיים 33,34.

יתר על כן, הוכח כי אנטיגנים ממינים של חיידקים שונים commensal, כגון E. coli, Bacteroides, Eubacterium ו פרוטאוס, מסוגל להפעיל תאים מסוג CD4 + T 35. זה מצביע על כך הצגת אנטיגנים חיידקיים לתאי T. הוא בעל חשיבות לפיתוח IBD. כדי להפחית את המורכבות של אנטיגנים מרובים שמפיקים מיקרופלורת בתהליך המחלה, זן E.coli נוצר שמייצר את אנטיגן OVA. קוליטיס ההעברה הושר על ידי הזרקת תאי T OVA הספציפיים לתוך RAG - / - חיות יישב עם להביע OVA E. coli.

מודל זה מבוסס על ראיות שנעשו לאחרונה והראו כי CX 3 CR1 + חברי פרלמנט, קבוצת משנה תא מרכזי שכבת הרירית המיוחדת הגסה (CLP) 36, נמצאים באינטראקציה עם תאי CD4 + T במהלך העברת קוליטיס 37. חברי פרלמנט לדגום את חלל המעי לאנטיגן חלקיקים, כגון חיידקים, באמצעות הדנדריטים שלהם 36, 38,39. לימודים קודמיםהוכיחו כי חברי פרלמנט יכול גם לקחת את אנטיגנים מסיסים, כגון OVA, מוחדר המעי לומן 40,41. בהתחשב שפע של חברי פרלמנט CX 3 CR1 + ב CLP, יתכן כי תאים אלה יכולים לטעום חיידקים לומינל ולתקשר עם תאים מסוג CD4 T. הדמיה Confocal של עכברים מושתלים עם תאי OVA ספציפי CD4 + T יישבו עם E. coli CFP-OVA, מראים כי CX 3 CR1 + חברי פרלמנט נמצאים בקשר עם OT-II CD4 + T תאים במהלך התפתחות קוליטיס מונחה אנטיגן. מודל זה מאפשר לימוד של תהליך מצגת אנטיגן בין נגמ"שים מעיים T תאים ספציפיים רק לחיידקים להביע אנטיגן מסוים לומן המעי.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

עכברים גידלו והמשיך בתנאים הפתוגן ללא ספציפי (SPF) במתקן חיה של אוניברסיטת Ulm (Ulm, גרמניה). כל הניסויים בבעלי חיים בוצעו בהתאם להנחיות של השימוש בבעלי חיים הוועדה המקומית טיפול וחוק צער בעלי חיים הלאומי.

1. בנייה של פלסמיד pCFP-OVA

  1. להגביר את הגן OVA בגודל מלא באמצעות פריימרים Ova_SpeI_fw (3'-GACCAACTAGTATGGAATTTTGTTTTGATGTATT-5 ') ו Ova_ClaI_rev (3'--5 GACCAGATCGATTAAGGGGAAACACATCTGCC') 37 באמצעות פלסמיד PCI-OVA (אמפיצילין עמידים) 42 כתבנית. Clone המוצר PCR (כלומר רצף קידוד OVA) לתוך וקטור אמצע הפאג זמינים מסחרית בשימוש באתרי הגבלות SpeI ו ClaI של פריימרים וקטור להניב את OVA-פלסמיד מסוים.
  2. להגביר את גן CFP הקידוד יחד עם האמרגן המכונן החזק P יתר באמצעות פלסמיד Pad 1 -cCFP (chloramphenicol עמיד) 43 כתבנית פריימרים CFP_SacII_fw (3'-GATCGACCGCGGTTCTTGAAGACGAAAGGGCC-5 ') ו CFP_SpeI_rev (3'-GATCGAACTAGTACCACCACCACCACCACCTTTGTAGAGTTCATCCATGC-5') 37.
  3. לשבט את גן CFP הקידוד לתוך פלסמיד-OVA הספציפי (אמפיצילין עמיד) באמצעות אתרי הגבלת SpeI ו SACI של פריימרים וקטור 37. זה מציג spacer של 6 שאריות גליצין בין-קידוד CFP מתוך רצף קידוד OVA.

2. בניית E.coli pCFP-OVA

  1. לגדול DH10B זן E.coli ב 100 מ"ל של לוריא Bertani (LB) בינוני אירובית על 37 מעלות צלזיוס על שייקר רוטרי לילה.
  2. מערבבים 800 μl של התרבות חיידקי עם 200 μl של גליצרול ליצור המניות חנות גליצרול ב -80 ° C.
  3. הוסף 50 μl של DH10B זן E.coli ממלאי גליצרול ב 5 מ"ל של מדיום LB ולגדל אותם אירובית על 37 מעלות צלזיוס על אובה שייקר רוטריrnight.
  4. מעבירים את התרבות בבקבוק 1 ליטר Erlenmeyer מבולבל עם 250 מ"ל של מדיום LB ב 37 מעלות צלזיוס שייק סיבובית.
  5. לגדול חיידקים צפיפות אופטית ב 600 ננומטר (OD 600) של 0.5 ולאחר מכן לצנן את התרבות על קרח למשך 30 דקות. צנטריפוגה חיידקים ב 5000 XG במשך 10 דקות ב 4 °.
  6. חיידקים גלולים עם 100 מיליליטר של H סטרילי קר כקרח 2 O ו צנטריפוגות החיידקים ב 5000 XG במשך 10 דקות ב 4 ° C. חיידקים גלולים עם 100 מיליליטר של גליצרול 10% קרים כקרח בצנטריפוגה החיידקים ב 5000 XG במשך 10 דקות ב 4 מעלות צלזיוס. חזור על השלב האחרון זה פעמיים.
  7. לאחר השלב לשטוף הסופי, resuspend החיידקים 700 μl של גליצרול 10%. להקפיא 50 aliquots μl בחנקן נוזלי חנות ב -80 ° C.
  8. הפשרה aliquot 50 μl על הקרח ולהעביר לתוך קובט electroporation מראש צונן (מרחק אלקטרודה 2 מ"מ).
  9. הוסף 5 μl של ה- DNA פלסמיד (100 ng) ל -50 μl E. coli aliquots. בצע electroporation עם דופק יחיד ב 25 μF, 200 אוהם (Ω) ו -2.5 קילו.
  10. חיידקים Resuspend ב 1 מ"ל בינוני SOC מחומם מראש (5 גר '/ תמצית שמרים L, 2 גר' / ל tryptone, נתרן כלורי 10 מ"מ, אשלגן כלורי 2.5 מ"מ, מגנזיום כלוריד 10 מ"מ, מגנזיום סולפט 10 מ"מ) ו לדגור על 37 מעלות צלזיוס אירובי במשך שעה 1.
  11. חיידקים פלייט על צלחות LB-אגר בתוספת מ"ל אמפיצילין 100 מיקרוגרם / (להוסיף 100 μl של המניה אמפיצילין 100 מ"ג / מ"ל ​​ל -100 מ"ל של אגר LB) דגירה לילה אירובית על 37 מעלות צלזיוס.
  12. פיק מושבות יחיד מחדש פס אותם צלחות LB-אגר בתוספת אמפיצילין 100 מיקרוגרם / מ"ל. דגירת הלילה אירובי על 37 מעלות צלזיוס.
  13. פיק מושבות יחידים ולגדל אותם בן לילה ב 10 מ"ל של התקשורת LB בתוספת מ"ל אמפיצילין 100 מיקרוגרם / לבידוד פלסמיד. השתמש זמינה מסחרי ערכת הכנת מיני פלסמיד ו elute DNA פלסמיד עם 30 μl DH 2 O (מים מזוקקים) על פי יצרן 'פרוטוקול s;. ודא פלסמידים על ידי ניתוח הגבלה 37,42,43 רצפי DNA.
  14. הגדרת תרבות של שיבוטים חיוביים של E. coli pCFP-OVA ב 100 מ"ל של מדיום LB בתוספת אמפיצילין 100 מיקרוגרם / מ"ל. לגדול אירובי על 37 מעלות צלזיוס על לילה שייקר רוטרי.
  15. מערבבים 800 μl של התרבות חיידקי עם 200 μl של גליצרול ולאחסן טהור ב -80 מעלות צלזיוס.
  16. צנטריפוגה שאר תרבות הלילה ב 5000 XG במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר (RT) ו resuspend גלולה ב בופר פוספט (PBS). מקום 10 μl של ההשעיה לשקופית זכוכית ולכסות אותו עם coverslip.
  17. שימו לב דגימות מיקרוסקופ פלואורסצנטי סטנדרטי כדי לאשר את קרינת ביטוי CFP-OVA (עירור CFP ב 450 ננומטר, פליטה ב 480 ננומטר). לנתח את החיידקים מתחילים עם הגדלה 400X.
  18. צנטריפוגה 1 מ"ל של חיידקים מתרבויות לילה ב 5,000 XG במשך 10 דקות, RT. Resuspend גלולה ב 40 μl שלPBS ומרתיחים על 95 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות.
  19. צנטריפוגה דגימות ב 30,000 XG במשך 10 דקות ולהשתמש supernatants לניתוח כתם המערבי 37. השתמש נוגדן polyclonal אנטי OVA ארנב-הרים מדולל 1: 400.

דור 3. OT-II / עכברים אדומים

  1. לחצות זכר / עכבר OT-II נקבה עם עכברה / זכר לבטא חלבון פלואורסצנטי אדום (שני הזנים זמינים מסחרי) על מנת ליצור את עכברי OT-II / אדום 37.

4. טחול בידוד תא

  1. להרדים את OT-II / עכברים האדום על ידי נקע בצוואר הרחם לאחר הרדמה על ידי שאיפה של כל אתר הלוגניים (עד 5% לזירוז) זמינים מסחרית.
  2. השתמש במספריים לחתוך את חלק הבטן מעולה השמאלי של העכבר. לפי חלק בטן זה יש את הטחול (צורת אליפסה עם צבע אדום כהה). השתמש מספריים פינצטה כדי להסירו.
    1. חלץ את הטחול של עכברי OT-II / האדומים ולהעביר אותו דרך 100מסננת תא מיקרומטר ממוקם על צינור 50 מ"ל באמצעות הבוכנה של מזרק 1 מ"ל על מנת לקבל השעיה תא בודד. שטפו את המסננת פעמיים עם 10 מ"ל של PBS בתוספת סרום שור העובר מומת 1% חום (FBS).
  3. צנטריפוגה ההשעיה התא ב 390 XG במשך 5 דקות ב RT. Resuspend גלולה עם 5 מ"ל של חיץ תמוגה מחומם מראש (144 מ"מ NH 4 Cl, 17 מ"מ טריס, pH = 7.2) כדי lyse את כדוריות הדם האדומות. דגירה 10 דקות ב 37 מעלות צלזיוס.
  4. לשטוף את המדגם עם 25 מ"ל של PBS בתוספת 1% FBS. צנטריפוגה ב 390 XG במשך 5 דקות ב RT. Resuspend גלולה ב 10 מ"ל של PBS בתוספת 1% FBS.
  5. ספירת התאים באמצעות תא ספירת נויבאואר. מערבבים 10 μl של השעיה תאים עם 10 μl של פתרון כחול 0.4% Trypan. דגירה של 1-2 דקות.
    1. ממלא את חדר hemocytometer עם 10 μl של תאים מוכתמים. ספירת תאים מתחת למיקרוסקופ בארבעה 1 x 1 מ"מ 2 ריבועים של תא אחד determinדואר המספר הממוצע של תאים לכל מ"ר. תאי חיים נראים לבנים, תאים מתים נראים כחולים. כדי לקבוע את מספר תאים / מ"ל ​​להכפיל את המספר הסלולרי על ידי גורם הדילול. אם 2-4 רביעים נספרים, לחלק במספר הרביעים.

5. העשרה תא CD4 + CD62 L + T

  1. עשרה תאי טחול עבור CD4 + CD62L + T תאים באמצעות ערכת מגנט בידוד שימוש בעקרונות של סלקציה שלילית או חיובית. הנה, להשתמש סלקציה שלילית לבודד תאים מסוג CD4 + T ולהשתמש סלקציה חיובית להעשיר עוד יותר עבור CD62L + האוכלוסייה בתוך הבריכה תא CD4 + T.
    הערה: הליך הסלקציה השלילי, התאים, אשר יהיה לא מבודד (כאן: כל התאים השליליים CD4) מסומן עם נוגדנים ספציפיים בשילוב עם microbeads המגנטי. במהלך הכביסה טור צעדים תאים מסוג CD4 + T יעברו דרך העמודה כדי שיוכלו להיות EASIly שנאסף. בתאי הליך בחירה החיוביים להיות מבודד מסומנים עם נוגדנים מתאימים בשילוב עם microbeads המגנטי. במהלך כביסת טור צעדי התאים שכותרתו יישארו בעמודה והם יכולים להיות שנאספו על ידי הסרת העמודה מהשדה המגנטי ושטיפה אותו עם החיץ.
  2. עבור ההליך סלקציה שלילית, resuspend 10 7 תאים הטחול סך 40 μl של קר PBS השלימו עם אלבומין 0.5% שור (BSA). הוסף 10 μl של קוקטייל של נוגדנים שכותרתו ביוטין מסופק עם ערכת בידוד מגנטי (נוגדנים ספציפיים מחייב את התאים הלא-CD4 + T) ו דגירה 15 דקות על הקרח.
    1. הוסף 30 μl של קר PBS השלימו עם 0.5% BSA ו -20 μl של microbeads אנטי ביוטין. דגירה 20 דקות על הקרח.
    2. הוסף מדגם 10 מ"ל של PBS השלימו עם 0.5% BSA ו צנטריפוגות ב 390 XG במשך 5 דקות. חזור על פעולה זו פעמיים. Resuspend התאים 1 מ"ל של קר PBS השלימו עם BS 0.5%א.
    3. מניח את הטור ספציפי עבור הליך הסלקציה השלילי בשדה המגנטי ולשטוף עם 3 מיליליטר של קר PBS השלים עם BSA 0.5% על הטור. מוסיפים את ההשעיה תא על הטור לשטוף 3 פעמים עם 3 מ"ל של קר PBS השלימו עם 0.5% BSA.
    4. צנטריפוגה תאים של הקולחין בבית 390 XG במשך 5 דקות. פטירתו קולחת דרך העמודה מכילה תאי CD4 + T ללא תווית. Resuspend גלולה ב 1 מ"ל של PBS השלימו עם BSA 0.5% לספור את התאים.
    5. ספירת התאים באמצעות תא ספירת נויבאואר. מערבבים 10 μl של השעיה תאים עם 10 μl של פתרון כחול 0.4% Trypan. דגירה של 1-2 דקות.
      1. ממלא את חדר hemocytometer עם 10 μl של תאים מוכתמים. ספירת תאים מתחת למיקרוסקופ בארבעה 1 x 1 מ"מ 2 ריבועים של תא אחד ולקבוע את המספר הממוצע של תאים לכל מ"ר. תאי חיים נראים לבנים, תאים מתים נראים כחולים. כדי לקבוע את מספר תאים / מ"ל ​​להכפיל cell המספר על-ידי גורם דילול. אם 2-4 רביעים נספרים, לחלק במספר הרביעים.
  3. עבור הליך הסלקציה החיובי, להוסיף 10 μl של microbeads CD62L לכל 10 7 חלק תא מראש מועשר CD4 + T. דגירה 15 דקות על הקרח.
    1. הוסף מדגם 10 מ"ל של PBS השלימו עם 0.5% BSA ו צנטריפוגות ב 390 XG במשך 5 דקות. חזור על פעולה זו פעמיים. Resuspend ב 500 μl של PBS קר בתוספת 0.5% BSA.
    2. מניח את הטור הספציפי עבור הליך הסלקציה השלילי בשדה המגנטי ולשטוף עם 500 μl של קר PBS בתוספת BSA 0.5% על הטור. הוסיפו השעית תא על הטור לשטוף 3 פעמים עם 500 μl של PBS הקר בתוספת 0.5% BSA.
    3. הסר את העמודה מהשדה המגנטי ומניח אותו על צינור איסוף מתאים. הוסף 1 מ"ל של PBS השלימו עם BSA 0.5% על הטור ולשטוף את CD4 + CD62L + T תאשעות שמר בעמודה ידי דחיפת הבוכנה בחוזקה לתוך העמודה.
      הערה: תאים מסוג CD4 + CD62L + T מבודד מוכנים כעת עבור יישומים במורד הזרם, כגון ניסויים in vivo. פי של הוראת היצרנית מן ערכת בידוד תאי CD4 + CD62L + T, microbeads אינו רעיל. בשל גודלו הקטן (כ -50 ננומטר), הם לא להפעיל תאים והם לא להרוות אפיטופים פני התא. לכן התאים הבודדים ניתן להעביר לעכברי immunodeficient לגרום קוליטיס 37,44,45.
    4. ספירת התאים באמצעות תא ספירת נויבאואר. מערבבים 10 μl של השעיה תאים עם 10 μl של פתרון כחול 0.4% Trypan. דגירה של 1-2 דקות.
      1. ממלא את חדר hemocytometer עם 10 μl של תאים מוכתמים. ספירת תאים מתחת למיקרוסקופ בארבעה 1 x 1 מ"מ 2 ריבועים של תא אחד ולקבוע את המספר הממוצע של תאים לכל מ"ר. appea תאים חייםr לבנים, תאים מתים נראים כחולים. כדי לקבוע את מספר תאים / מ"ל ​​להכפיל את המספר הסלולרי על ידי גורם הדילול. אם 2 - 4 רביעים נספרים, לחלק במספר הרביעים.

6. אינדוקציה של קוליטיס מונחה Antigen

  1. להזריק intraperitoneally 3 x 10 5 OT-II / אדום CD4 + CD62L תאים + T לתוך CX 3 CR1 GFP / + x RAG - / - עכברים. לזירוז של קוליטיס אנטיגן ספציפי, לנהל א coli pCFP-OVA כל יום שני במינון של 1 x 10 8 המושבה יוצרי יחידות (CFU) ב 100 μl של PBS לכל חיה ידי gavage או החדרה אוראלי מאחורי החותכות.
  2. צג פעמיים בשבוע את משקל הגוף של עכברים מושתלים ומצבו הקליני שלהם (נוכחות של דם עקביות צואה, צואה ופעילות של עכברים).

7. דגימות רקמה לבחינת Histopathological

  1. קח דגימות רקמה מן המעי של עכברי הדואר גדול, לתקן בפורמלין ניטראלי שנאגר (10%) ו להטביע פרפין כפי שתואר לעיל 36,46.
  2. סעיף דגימות פרפין על microtome, הר בשקופיות, ולבצע את 47,48 כתם H & E.
  3. לסווג את היסטולוגיה של המעי הגס כפי שפורסם בעבר 47,48: רגיל (ניקוד 0); קוליטיס קל (ניקוד 1), קוליטיס מתון (ניקוד 2) וקוליטיס חמור (ניקוד 3).

8. בידוד של תאים הגס Lamina propria

  1. להרדים עכברים מושתלים על ידי נקע בצוואר הרחם לאחר הרדמה על ידי שאיפה של כל אתר הלוגניים (עד 5% לזירוז) זמינים מסחרית.
  2. מניח את החיה למטה עם הבטן כלפי מעלה. שימוש במלקחיים כדי לתפוס את העור anteriorly לפתיחת השופכה. השתמש במספריים לחתוך את העור לאורך קו אמצע הגחון מהמפשעה עד החזה. משוך את העור לאחור בצדדים.
  3. חותך דרך קיר שריר הצפק השקוףפתיחת חלל הגוף. זהה את המעי הגס שהולך מפי הטבעת אל 49 המעי האטומים. חותכים את 2 בגפיים לשחרר את רקמות מכל שומן.
  4. פתח את המעי הגס longitudinally באמצעות מספריים לנתיחה. השתמש פינצטה כדי לזעזע את רקמת המעי הגס בצלחת פטרי שמכילה 25 מ"ל של PBS השלימו עם FBS 1% להסיר פסולת רירי. חותכים את המעי הגס לתוך 5 - 8 חתיכות מ"מ.
  5. מניחים את פלחי המעי הגס בתוך שפופרת 50 מ"ל המכיל 20 מ"ל של הצפת לשטוף. המאגר לשטוף מכיל 500 מ"ל DPBS, 10mm Hepes ו 5 מ"מ חומצה ethylenediaminetetraacetic (EDTA).
  6. וורטקס הצינור במשך 30 שניות במהירות מקסימלית.
  7. דגירת הצינור המכיל את פרק המעי הגס באמבט מים ב 37 ° C עם 200 סל"ד רעדו במשך 10 דקות.
  8. לאחר הדגירה, מערבולת הצינור במשך 30 שניות במהירות מקסימלית.
  9. מחק את supernatants והמקום דגימות רקמה בתוך שפופרת חדשה 50 מ"ל המכיל 20 מ"ל של חיץ לשטוף. חזור על שלבים 6-9 שלוש פעמים
  10. מחק את היםupernatants והמקום דגימות רקמה בצלחת פטרי שמכילה 25 מ"ל של PBS. השתמש פינצטה לנער בעדינות דגימות הרקמה בצלחת פטרי עבור כמה שניות כדי להסיר תאי אפיתל שיורית. חזור על פעולה זו שלוש פעמים.
  11. חותכים רקמות הגס לתוך 2 x 2 מ"מ 2 חתיכות ולעכל אותם על ידי הדגירה ב 10 מ"ל של מכון ממוריאל פארק Roswell (RPMI) בינוני עם 0.5 מ"ג / VIII סוג collagenase מ"ל מבית histolyticum Clostridium ו -10 U / ml של DNaseI.
  12. וורטקס הצינור במשך 30 שניות במהירות מקסימלית.
  13. דגירה שברי המעי הגס באמבט מים ב 37 ° C עם 200 סל"ד רעד במשך 35 דקות ו מערבולת הצינור במשך 30 שניות במהירות מקסימלית כל 5 דקות.
  14. בסוף דגירת מערבולת הצינור במשך 30 שניות במהירות מקסימלית.
  15. אסוף את שברי מתעכל על ידי העברת אותם דרך מסננת תא 70 מיקרומטר ממוקם על צינור חדש 50 מ"ל.
  16. לשטוף את המדגם על ידי הוספת 20 מ"ל של DPBS ו צנטריפוגות ב 400 גרם במשך 5 דקות. ואז resuspend tהוא התאים 1 מ"ל של DPBS.
  17. ספירת התאים באמצעות תא ספירת נויבאואר. מערבבים 10 μl של השעיה תאים עם 10 μl של פתרון כחול 0.4% Trypan. דגירה של 1-2 דקות.
    1. ממלא את חדר hemocytometer עם 10 μl של תאים מוכתמים. ספירת תאים מתחת למיקרוסקופ בארבעה 1 x 1 מ"מ 2 ריבועים של תא אחד ולקבוע את המספר הממוצע של תאים לכל מ"ר. תאי חיים נראים לבנים, תאים מתים נראים כחולים. כדי לקבוע את מספר תאים / מ"ל ​​להכפיל את המספר הסלולרי על ידי גורם הדילול. אם 2-4 רביעים נספרים, לחלק במספר הרביעים.

9. מכתים תאיים עבור ניתוח FCM

  1. צנטריפוגה דקות 5 תאי CLP ב 390 x ז. Resuspend התאים 1 מ"ל של FACS A (PBS השלימו עם BSA 1% ו אזיד הנתרן 0.1%)
    הערה: אזיד הנתרן היא רעילה ביותר. זה יכול לגרום ירידה בלחץ דם, היפותרמיה, עוויתות כאב ראש או מוות. לדלל פתרונות של אזיד הנתרן (0.1 ל -1.0%) בדרך כלל אינם מציגים הסכנות יוצאות הדופן למשתמש, אבל הם מגרים את העין ואת העור. לכן, השתמש אזיד הנתרן רק במנדף כימי כשהוא לבוש מעיל מעבדה וזוג כפול של כפפות ניטריל הפנויה.
  2. דגירה התאים במשך 15 דקות ב RT עם נוגדן חד-שבטי (מב) 2.4G2 מכוונת נגד א FcγRIII / II CD16 / CD32 (0.5-1 מיקרוגרם מב / 10 6 תאים) מדולל FACS
  3. הוסף 200 μl של A FACS אל התאים דקות צנטריפוגות 5 ב 390 x ז. חזור על פעולה זו פעמיים. דגירה התאים עם 0.5 ng / 10 6 תאים של מב רלוונטי עבור 20 דקות ב 4 ° C. לדלל את הנוגדנים FACS א
  4. הוסף 200 μl של A FACS אל התאים דקות צנטריפוגות 5 ב 390 x ז. חזור על פעולה זו פעמיים. Resuspend דגימות 100 μl של FACS א
  5. לנתח תאי T מ CX 3 CR1 GFP / + x RAG - / - עכברים מחדש עם OT-II / תאי האדום CD4 T ב cytometer את הזרימה 37.
  6. ניתוח נתונים באמצעות תוכנה זמינה באופן מסחרי.

ניתוח מיקרוסקופי Confocal 10.

  1. לנתח את המעי הגס של 3 CX CR1 GFP / + עכברים מחדש או לא עם OT-II / אדום CD4 + CD62L + T תא ואכילה פה כל יום שני עם 1 x 10 8 CFU של E. coli זן DH10B pCFP-OVA.
  2. הסר את המעי הגס מן העכברים באמצעות מספריים ופינצטה. פתח זה longitudinally באמצעות מספריים לנתיחה.
  3. חותכים חתיכה 5-8 מ"מ של מדגם המעי הגס באמצעות מספריים, לשים על גבי שקופיות זכוכית וכסו coverslips.
  4. ניתוח דגימות המעי הגס באמצעות מיקרוסקופ confocal בהגדלה של 40 / 1.30.
  5. לזהות את חברי פרלמנט CX 3 CR1 +, שכותרתו עם חלבון והעמסה ירוק (GFP), באמצעות מסנן מוגדר עם עירור ב 488 ננומטר פליטה ב 509 ננומטר.
  6. זיהוי תא CD4 + T לבטא חלבון אדום באמצעות מסנן מוגדר עם עירור ב 554 ננומטר פליטה ב 586 ננומטר.
  7. זיהוי E.coli pCFP-OVA באמצעות מסנן מוגדר עם עירור ב 450 ננומטר פליטה ב 480 ננומטר.
  8. גדר תחום העניין וליצור דיאגרמות פיזור כפי שתואר לעיל 50 לבצע את ניתוח לוקליזציה שיתוף. השתמש 2 נוסחאות שונות: מקדם חפיפה פי מאנדרס ואת מקדם פירסון.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

כדי להקים מודל קוליטיס מונחה אנטיגן E. זן coli נבנה המכילה פלסמיד שבו הגן על CFP הוא התמזג ברצף מקודד חלבון העוף ovalbumin ואת ההיתוך לבנות מתבטא בשליטה של (איור 1 א) האמרגן P Hyper המכונן החזק. מיקרוסקופ פלואורסצנטי מראה כי א רקומביננטי coli pCFP-OVA, אבל לא את א ההורית coli DH10B, מבטא CFP (איור 1B). CFP-OVA- לייצר E. coli

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

כמו בכל מודל אחר, מודל קוליטיס מונחה אנטיגן שתואר לעיל רשאי להציג כמה בעיות שחוקר ביצוע הטכניקה חייב להיות מודע. כאשר הזרקת OT-II / אדום + CD4 + T CD62L + התאים המארחים, החוקר חייב להיות מאוד עדין וזהיר להכניס את המחט לתוך חלל הצפק. אי ביצוע הוראה זו עלולה לגרום הקריעה של המעי של העכבר אשר יכול לגרום למוות, או להזרקת תאים אשר יגרמו כל מחלה.

בדרך כלל, עכברים יעלו במשקל בשבוע הראשון...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

למחברים אין מה לחשוף.

תודות

JHN נתמך על ידי הקרן הלאומית השוויצרית (SNSF 310030_146290).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
מרק LB, מילר (לוריא-ברטני)Difco244620
שייק סיבוביReiss Laborbedarf e. K.דגם 3020 GFL
2 מ"מ מרווח פערים Peqlab Biotechnologie GmbH71-2020
גליצרולסיגמא-אולדריץ'G5516-100ML
Gene Pulser מערכת Xcell BioRad Laboratories GmbH1652660
LB Agar, Miller (Luria-Bertani)Difco244510
AmpicillinSigma-AldrichA9393-5G
SOC MediumSigma-AldrichS1797-100ML
ערכת בידוד פלסמיד טהורה גבוההRoche11754777001
AgaroseCarl Roth GmbH & Co3810.1
EDTASigma-AldrichE9884-100G
Tris-HClSigma-AldrichT5941
חומצה אצטית קרחוניתSigma-Aldrich537020 
תא ג'ל PEQLAB Biotechnology GmbH40-0708
טוען צבעתרמו פישרR0611
GeneRuler 1 kb סולם DNA Thermo FisherSM0312
תמיסת אתידיום ברומידCarl Roth GmbH & Co. KG2218.3
מערכת תיעוד תמונות Decon Science Tech GmbHDeVision G 
ריצוף DNA MWG-Biotech GmbH
פוספט חוצץ מלח (PBS)BiochromL182-50
מיקרוסקופ פלואורסצנטי ZeissHBO 100
Mini-PROTEAN Tetra SystemBio-Rad Laboratories GmbH1658005
PageRuler סולם חלבון צבוע מראש Fermentas, סנט לאון-רוט, גרמניה
IstanBlue SolutionExpedeon, קיימברידג'שייר, בריטניה
ממברנת ניטרוצלולוזה Macherey-Nagel GmbH & Co. KG741280
Electro blotter Biometra GmbH846-015-600
אלבומין סרום בקר (BSA)Sigma-AldrichA6003-25G
נוגדן נגד אובאלבומין Abcamab181688
אנטי ארנב IgG  HRPסיגמא-אולדריץ'A0545 
Pierce ECL Plus Western Blotting SubstratePierce Biotechnology, Thermo Fischer Scientific Inc32132
ForeneAbbott2594.00.00
FBSInvitrogen10500-064
מסנני תאי פלקוןפישר סיינטיפיק 08-771-2
אמוניום כלורידסיגמא-אולדריץ'254134-5G
Tris BaseSigma-Aldrich10708976001
CD4+ CD62 L+ ערכת בידוד T Miltenyi Biotec130-093-227 
טורי MACS LS Miltenyi Biotec130-042-401
עמודות MACS MS Miltenyi Biotec130-042-201
מפריד MidiMACSMiltenyi Biotec130-042-302
מפריד MiniMACSMiltenyi Biotec130-042-102
MACS MultiStandMiltenyi Biotec130-042-303
מחט האכלה 20GSouthPointe Surgical Supply, IncFN-7903
תמיסת פורמלין, ניטרלי חוצץ, 10%סיגמא-אולדריץ'HT501128
פרפיןסיגמא-אולדריץ'1496904
המטוקסיליןסיגמא-אולדריץ'H9627
Eosin ySigma-Aldrich230251 
דיתיותרייטולסיגמא-אולדריץ'D9779 
קולגנאז מסוג VIIIסיגמא-אולדריץ'C-2139
מכון הזיכרון רוזוול פארק (RPMI) בינוניAppliChemA2044, 9050
נתרן אזידסיגמא-אולדריץ'438456
עכבר BD Fc בלוקBD Pharmingen553141
מצומד FITC mAb מחייב Vß 5.1, 5.2 BD Pharmingen553189
כריכת mAb מצומד APC CD4 GK1.5 eBioscience17-0041-83
FACS קליבר BD Biosciences
FCS Express V3 תוכנהDeNovo
Meta סריקת מיקרוסקופ קונפוקלי צייסLSM 710 
Zeiss WorkstationZeissLSM 7
Zeiss ZEM תוכנה Zeissv4.2.0.121
צלחות חיסון מקסימליות NUNC, Roskilde442404
Streptavidin מצומד אלקליין פוספטאזJackson Immuno Research016-050-084
מצע פוספטאז אלקליין 4-ניטרופניל פוספט מלח דיסודיום הקסהידרטסיגמא-אולדריץ'71768-5G
mAb R4-6A2BD Biosciences551216
mAb XMG1.2 BD Biosciences554410
TECAN microplate-ELISA קוראTecan
EasyWin תוכנהTecan
DNase I רקומביננטי4536282001

מקורות

  1. Backhed, F., Ley, R. E., Sonnenburg, J. L., Peterson, D. A., Gordon, J. I. Host-bacterial mutualism in the human intestine. Science. 307, 1915-1920 (2005).
  2. Cario, E., Podolsky, D. K. Intestinal epithelial TOLLerance versus inTOLLerance of commensals. Mol Immunol. 42, 887-893 (2005).
  3. Sartor, R. B., Mazmanian, S. K. Intestinal Microbes in Inflammatory Bowel Diseases. Am J Gastroenterol Suppl. 1, 15-21 (2012).
  4. Sekirov, I., Russell, S. L., Antunes, L. C., Finlay, B. B. Gut microbiota in health and disease. Physiol Rev. 90, 859-904 (2010).
  5. Metges, C. C. Contribution of microbial amino acids to amino acid homeostasis of the host. J Nutr. 130, 1857S-1864S (2000).
  6. Rossi, M., Amaretti, A., Raimondi, S. Folate production by probiotic bacteria. Nutrients. 3, 118-134 (2011).
  7. Ley, R. E., Peterson, D. A., Gordon, J. I. Ecological and evolutionary forces shaping microbial diversity in the human intestine. Cell. 124, 837-848 (2006).
  8. Sleator, R. D. The human superorganism - of microbes and men. Med Hypotheses. 74, 214-215 (2010).
  9. Kumar, H., Kawai, T., Akira, S. Pathogen recognition by the innate immune system. Int Rev Immunol. 30, 16-34 (2011).
  10. Kumar, H., Kawai, T., Akira, S. Pathogen recognition in the innate immune response. Biochem J. 420, 1-16 (2009).
  11. Smith, P. M., Garrett, W. S. The gut microbiota and mucosal T cells. Front Microbiol. 2, 111(2011).
  12. Fava, F., Danese, S. Intestinal microbiota in inflammatory bowel disease: friend of foe? World J Gastroenterol. 17, 557-566 (2011).
  13. Mazmanian, S. K., Liu, C. H., Tzianabos, A. O., Kasper, D. L. An immunomodulatory molecule of symbiotic bacteria directs maturation of the host immune system. Cell. 122, 107-118 (2005).
  14. Muzes, G., Molnar, B., Tulassay, Z., Sipos, F. Changes of the cytokine profile in inflammatory bowel diseases. World J Gastroenterol. 18, 5848-5861 (2012).
  15. Koboziev, I., Karlsson, F., Grisham, M. B. Gut-associated lymphoid tissue, T cell trafficking, and chronic intestinal inflammation. Ann N Y Acad Sci. 1207 Suppl. 1207, Suppl 1. E86-E93 (2010).
  16. Ostanin, D. V., et al. T cell transfer model of chronic colitis: concepts, considerations, and tricks of the trade. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 296, G135-G146 (2009).
  17. Elson, C. O., Sartor, R. B., Tennyson, G. S., Riddell, R. H. Experimental models of inflammatory bowel disease. Gastroenterology. 109, 1344-1367 (1995).
  18. Boismenu, R., Chen, Y. Insights from mouse models of colitis. J Leukoc Biol. 67, 267-278 (2000).
  19. Powrie, F., Leach, M. W., Mauze, S., Caddle, L. B., Coffman, R. L. Phenotypically distinct subsets of CD4+ T cells induce or protect from chronic intestinal inflammation in C. B-17 scid mice. Int Immunol. 5, 1461-1471 (1993).
  20. Rivera-Nieves, J., et al. Emergence of perianal fistulizing disease in the SAMP1/YitFc mouse, a spontaneous model of chronic ileitis. Gastroenterology. 124, 972-982 (2003).
  21. Ostanin, D. V., et al. T cell-induced inflammation of the small and large intestine in immunodeficient mice. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 290, G109-G119 (2006).
  22. Barnett, M., Fraser, A. Animal Models of Colitis: Lessons Learned, and Their Relevance to the Clinic. Ulcerative Colitis - Treatments, Special Populations and the Future. O'Connor, M. , InTech. (2011).
  23. Reindl, W., Weiss, S., Lehr, H. A., Forster, I. Essential crosstalk between myeloid and lymphoid cells for development of chronic colitis in myeloid-specific signal transducer and activator of transcription 3-deficient mice. Immunology. 120, 19-27 (2007).
  24. Yoshida, M., et al. CD4 T cells monospecific to ovalbumin produced by Escherichia coli can induce colitis upon transfer to BALB/c and SCID mice. Int Immunol. 13, 1561-1570 (2001).
  25. Eun, C. S., et al. Induction of bacterial antigen-specific colitis by a simplified human microbiota consortium in gnotobiotic interleukin-10-/- mice. Infect Immun. 82, 2239-2246 (2014).
  26. Nell, S., Suerbaum, S., Josenhans, C. The impact of the microbiota on the pathogenesis of IBD: lessons from mouse infection models. Nat Rev Microbiol. 8, 564-577 (2010).
  27. Chinen, T., Rudensky, A. Y. The effects of commensal microbiota on immune cell subsets and inflammatory responses. Immunol Rev. 245, 45-55 (2012).
  28. Dimmitt, R. A., et al. Role of postnatal acquisition of the intestinal microbiome in the early development of immune function. J Pediatr Gastroenterol Nutr. 51, 262-273 (2010).
  29. Cebra, J. J., Periwal, S. B., Lee, G., Lee, F., Shroff, K. E. Development and maintenance of the gut-associated lymphoid tissue (GALT): the roles of enteric bacteria and viruses. Dev Immunol. 6, 13-18 (1998).
  30. Ohkusa, T., Nomura, T., Sato, N. The role of bacterial infection in the pathogenesis of inflammatory bowel disease. Intern Med. 43, 534-539 (2004).
  31. van Lierop, P. P., Samsom, J. N., Escher, J. C., Nieuwenhuis, E. E. Role of the innate immune system in the pathogenesis of inflammatory bowel disease. J Pediatr Gastroenterol Nutr. 48, 142-151 (2009).
  32. Kaur, N., Chen, C. C., Luther, J., Kao, J. Y. Intestinal dysbiosis in inflammatory bowel disease. Gut Microbes. 2, 211-216 (2011).
  33. Trobonjaca, Z., et al. MHC-II-independent CD4+ T cells induce colitis in immunodeficient RAG-/- hosts. J Immunol. 166, 3804-3812 (2001).
  34. Brimnes, J., Reimann, J., Nissen, M., Claesson, M. Enteric bacterial antigens activate CD4(+) T cells from scid mice with inflammatory bowel disease. Eur J Immunol. 31, 23-31 (2001).
  35. Cong, Y., et al. CD4+ T cells reactive to enteric bacterial antigens in spontaneously colitic C3H/HeJBir mice: increased T helper cell type 1 response and ability to transfer disease. J Exp Med. 187, 855-864 (1998).
  36. Niess, J. H., et al. CX3CR1-mediated dendritic cell access to the intestinal lumen and bacterial clearance. Science. 307, 254-258 (2005).
  37. Rossini, V., et al. CX3CR1(+) cells facilitate the activation of CD4 T cells in the colonic lamina propria during antigen-driven colitis. Mucosal Immunol. 7, 533-548 (2014).
  38. Vallon-Eberhard, A., Landsman, L., Yogev, N., Verrier, B., Jung, S. Transepithelial pathogen uptake into the small intestinal lamina propria. J Immunol. 176, 2465-2469 (2006).
  39. Chieppa, M., Rescigno, M., Huang, A. Y., Germain, R. N. Dynamic imaging of dendritic cell extension into the small bowel lumen in response to epithelial cell TLR engagement. J Exp Med. 203, 2841-2852 (2006).
  40. Farache, J., et al. Luminal Bacteria Recruit CD103(+) Dendritic Cells into the Intestinal Epithelium to Sample Bacterial Antigens for Presentation. Immunity. , (2013).
  41. Farache, J., Zigmond, E., Shakhar, G., Jung, S. Contributions of dendritic cells and macrophages to intestinal homeostasis and immune defense. Immunol Cell Biol. 91, 232-239 (2013).
  42. Schirmbeck, R., et al. Translation from cryptic reading frames of DNA vaccines generates an extended repertoire of immunogenic, MHC class I-restricted epitopes. J Immunol. 174, 4647-4656 (2005).
  43. Balestrino, D., et al. Single-cell techniques using chromosomally tagged fluorescent bacteria to study Listeria monocytogenes infection processes. Appl Environ Microbiol. 76, 3625-3636 (2010).
  44. Ortega-Gonzalez, M., et al. Validation of bovine glycomacropeptide as an intestinal anti-inflammatory nutraceutical in the lymphocyte-transfer model of colitis. Br J Nutr. 111, 1202-1212 (2014).
  45. Capitan-Canadas, F., et al. Fructooligosaccharides exert intestinal anti-inflammatory activity in the CD4+ CD62L+ T cell transfer model of colitis in C57BL/6J mice. Eur J Nutr. , (2015).
  46. Salazar-Gonzalez, R. M., et al. CCR6-mediated dendritic cell activation of pathogen-specific T cells in Peyer's patches. Immunity. 24, 623-632 (2006).
  47. Niess, J. H., Leithauser, F., Adler, G., Reimann, J. Commensal gut flora drives the expansion of proinflammatory CD4 T cells in the colonic lamina propria under normal and inflammatory conditions. J Immunol. 180, 559-568 (2008).
  48. Radulovic, K., et al. CD69 regulates type I IFN-induced tolerogenic signals to mucosal CD4 T cells that attenuate their colitogenic potential. J Immunol. 188, 2001-2013 (2012).
  49. Mowat, A. M., Agace, W. W. Regional specialization within the intestinal immune system. Nat Rev Immunol. 14, 667-685 (2014).
  50. Manta, C., et al. CX(3)CR1(+) macrophages support IL-22 production by innate lymphoid cells during infection with Citrobacter rodentium. Mucosal Immunol. 6 (3), 177-188 (2013).
  51. Feng, T., Wang, L., Schoeb, T. R., Elson, C. O., Cong, Y. Microbiota innate stimulation is a prerequisite for T cell spontaneous proliferation and induction of experimental colitis. J Exp Med. 207, 1321-1332 (2010).
  52. Mazzini, E., Massimiliano, L., Penna, G., Rescigno, M. Oral tolerance can be established via gap junction transfer of fed antigens from CX3CR1(+) macrophages to CD103(+) dendritic cells. Immunity. 40, 248-261 (2014).
  53. Fitzpatrick, L. R. Novel Pharmacological Approaches for Inflammatory Bowel Disease: Targeting Key Intracellular Pathways and the IL-23/IL-17 Axis. Int J Inflam. 2012, 389404(2012).
  54. Danese, S. New therapies for inflammatory bowel disease: from the bench to the bedside. Gut. 61, 918-932 (2012).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

TT CD4 OT IIE coli CFP OVA
פיתוח מודל קוליטיס מונחה Antigen ללמוד מצגת של אנטיגנים על ידי אנטיגן הצגת תאים לתאי T
צור קשר
המלצה לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

2026 © זכויות יוצרים MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.