מאמר שיטה

עיצוב ושימוש בעלות נמוכה, אוטומטי Morbidostat עבור Adaptive אבולוציה מהירה של חיידקים תחת אנטיביוטי והתרופות בחירה

9.6K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/54426

⸱

27 בספטמבר 2016

 ,  ,  , 
1Electrical Engineering, National Tsing Hua University

במאמר זה

סיכום

אנו מתארים מורבידוסטט בעלות נמוכה וניתן להגדרה המאפשר לאפיין עמידות לתרופות אנטיביוטיות על ידי התאמה דינמית של ריכוז התרופה. ניתן לשלב את המכשיר עם פלטפורמה מיקרופלואידית מרובבת. ניתן להרחיב את הגישה למחקרי מעבדה של עמידות לתרופות אנטיביוטיות.

תקציר

אנו מתארים בעלות נמוכה, morbidostat להגדרה לאפיון נתיב אבולוציוני של עמידות לאנטיביוטיקה. Morbidostat הוא מכשיר תרבית חיידקים מנטרים התפתחות חיידקים ברציפות ומתאימה באופן דינמי את ריכוז התרופה לקרוא תיגר על חיידקי זמן כפי שהם מתפתחים לרכוש עמידות לתרופות. המכשיר כולל נפח עבודה של ~ 10 מיליליטר הוא אוטומטי לחלוטין ומצויד מדידת צפיפות אופטית ו-משאבות מייקרו בינוני משלוח סמים. כדי לאמת את הפלטפורמה, מדדנו את הרכישה בשלבים של התנגדות trimethoprim ב coli Escherichia MG 1655, ומשולב המכשיר עם פלטפורמת microfluidic מרובבת לחקור מורפולוגיה תאי רגישות לאנטיביוטיקה. הגישה יכול להיות עד-לשנותם כדי במחקרי מעבדה של עמידות לתרופות אנטיביוטיות, והוא extendible כדי אדפטיבית האבולוציה לשיפורים זן בהנדסה מטבולית וניסויים התרבות חיידקים אחרים.

מבוא

מאז כניסתה של פניצילין התרופה הראשון האנטיביוטי, עמידות לאנטיביוטיקה של חיידקים התפתחה עולמית בעיה בריאותית 1. למרות רכישת עמידות לאנטיביוטיקה ניתן ללמוד למפרע in vivo, התנאים של ניסויים אלה הם בדרך כלל לא מבוקרים לאורך האבולוציה כולה 2. לחלופין, אבולוצית מעבדת אדפטיבית יכולה לחשוף את האבולוציה המולקולרית של מינים של חיידקים תחת לחצים סביבתיים או לחץ ברירה מתרופת אנטיביוטיקת 3. לאחרונה, מבוקר היטב ניסויים רבים האבולוציונית של עמידות לתרופות אנטיביוטיות יש הבהיר את הופעתה של עמידות לתרופות אנטיביוטיות. לדוגמה, קבוצה של אוסטין הפגינו הופעתם המהירה בסביבה 4 מחולקים microfluidic מהונדסים כראוי. Morbidostat שפותח לאחרונה גורם מוטציות שיטתיות תחת לחץ ברירת תרופת 5,6. Morbidostat, תמיכה בבחירה מיקרוביאלימכשיר tion אשר מתאים את ריכוז האנטיביוטיקה ללא הרף כדי לשמור על אוכלוסייה קבועה כמעט, הוא התקדמות גדולה ממבחן התנודות בשימוש במיקרוביולוגיה 7,8. במבחן התנודות, תרופה אנטיביוטית מוזרקת בריכוז גבוה, ואת מוטנטים לשרוד מוקרנים ומנה. במקום זאת, חיידקים בתוך morbidostat מאותגרים כל הזמן צוברים מוטציות מרובות.

Morbidostat פועלת בדומה chemostat, מכשיר התרבות הומצא על ידי נוביק ו Szliard בשנת 1950, אשר שומר אוכלוסייה קבועה על ידי אספקת חומרים מזינים באופן רציף תוך דילול אוכלוסיית החיידקים 9. מאז השקתו, את chemostat כבר מתקדמת ומשופרת. chemostats microfluidic הנוכחי הגיע nanoliter וקיבולות תא בודד. עם זאת, מכשירים אלה אינם מתאימים לניסויי אבולוציה אדפטיבית, הדורשים אוכלוסיית תא גדולה עם אירועים רבים מוטציה 10,11. לאחרונה, מיניchemostats עם כרכים עובדים של ~ 10 מיליליטר גם פותח כדי למלא את הפער בין מתקני גידול בהיקף ליטר ואת 12,13 microfluidic chemostat.

כאן אנו מציגים את העיצוב ושימוש של בעלות נמוכה, morbidostat אוטומטית מחקר עמידות לתרופות אנטיביוטי. המודול המוצע יכול להיות מועסק בתוך חממה שייקר במעבדה למיקרוביולוגיה עם דרישת חומרה מינימאלית. הקושחה הקוד הפתוח גם מותאם בקלות ליישומים ספציפיים של התפתחות אדפטיבית, כגון הנדסה מטבולית 3. לבסוף, morbidostat משתלבת פלטפורמת microfluidic מרובבת עבור בדיקות רגישות לאנטיביוטיקה 14.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

1. הרכבה Pretesting של התקן Morbidostat

  1. עצרת של Morbidostat
    1. פונץ '3 חורים על המכסה של בקבוקון התרבות עם מחט מזרק 18 G. חותכים שלוש חתיכות של צינורות פוליאתילן ~ 7 ס"מ אורך. הכנס שלושת חלקים אלה של צינורות פוליאתילן על הכובע.
    2. השתמש קלטת לעטוף את קצה הכובע לשמש בגבס תערובת polydimethylsiloxane (PDMS). מערבבים 5 גרם של רכיב ו -0.5 גרם של רכיב ב 'של PDMS במיכל פלסטיק 150 מ"ל ידי ערבוב ידני עם קיסם. טען את התערובת לתוך מזרק 10 מ"ל.
      1. יוצקים את התערובת PDMS על כובע עם מזרק. אופים את הכובע כולו כדי לרפא את PDMS עבור 8 שעות בתנור על 70 מעלות צלזיוס.
    3. הלחם את האנודה LED עם חוט 24 מד ואת קתודת LED עם נגד פחמן עם מלחם. הלחמת נגד פחמן 680 Ω עם חוט G 24. לבודד את חיבור תיל באמצעות הקלטת חשמל.
    4. כךlder האספן של גלאי האור עם 24 חוט G ואת הפולט של photodetector עם נגד פחמן 100 קילו-אוהם. לבודד את חיבור תיל באמצעות הקלטת חשמל.
    5. מניחים את דיודה פולטת אור במחזיק הבקבוקון תרבות. על ידי ביצוע דיאגרמת מעגל ב משלים איור 2, לחבר את אור דיודה וכוח זה עם ספק כוח של 5 V. ודא LED פועלת באמצעות מצלמה דיגיטלית שיכולה לזהות IR (למשל, מצלמת הטלפון הנייד).
    6. מניח את גלאי האור במחזיק בקבוקון התרבות. על ידי ביצוע דיאגרמת המעגל ב משלים איור 2, לחבר את גלאי האור וכוח זה עם ספק כוח של 5 V. חבר את הכבל לשני הצדדים של נגדי photodetector למדוד את המתח על פני לוח הבקרה האלקטרוני.
    7. מדביק מגנט על הפיר של מאוורר הקירור, אשר משמש כיחידת בוחש המגנטית. ראוי לציין, כי alignmאף אוזן גרון של הפיר של מאוורר בקבוקון התרבות, ואת המרווח בין בקבוקון תרבות המגנט הוא מאוד קריטי עבור פעילותו התקינה של היחידה בחישה המגנטית.
    8. חבר כל חתיכה של צינורות פוליאתילן של בקבוקון התרבות לתוך חתיכת מקביל צינורות סיליקון עבור משאבות מייקרו, בקבוקים בינוניים, ובקבוק פסולת. הפעל את המשאבה למשך שעה 1 ולמדוד את הנפח הכולל נשאב מהבקבוק הבינוני עד בקבוקון התרבות לקבוע את שיעור המשאבה. ראוי לציין, כי קצב השאיבה הטיפוסי צריך להיות ~ 4 מיליליטר / שעה, אשר תואמת את שיעור הדילול D = 0.33 hr -1 עבור 12 מיליליטר עובד נפח של בקבוקון התרבות.
    9. הנח את מכלול שלם על בינוניים חממה שייקר (34 ס"מ x 34 ס"מ x 43.5 ס"מ).
  2. Pretesting Morbidostat
    1. מתח החשמל סט אוהד מגניב 5 V להתחיל המנוע שלה כדי לבדוק את בר בחישה מגנטית. ראוי לציין, כי פעולת הערבוב יכולה להיבדק חזותית. המתח שמניעשעות מנוע מאוורר הקירור לשלוט במדויק על ידי אפנון רוחב פולס (PWM).
    2. הכינו סדרה של סוג בר E. דגימות coli עם צפיפות אופטית ב 600 בדרך כלל ננומטר החל 0.07 כדי 0.3 לכיול. מניחים מבחן E. מדגם coli בבקבוקון התרבות ולהקליט את מתח photodetector.
      1. מקום ~ 100 μl של המדגם הזהה אצל קורא הצלחת ולהקליט את הצפיפות האופטית. השתמש מתח photodetector לעומת נתוני צפיפות אופטיים להתוות את עקומת הכיול. שים לב שבדרך כלל שינוי יחיד אחת צפיפות אופטית מקביל ~ 7.6 V שינוי photodetector עם ערכת ההטיה משמשת כאן.

2. הרצת Morbidostat

  1. הכנה לפני תחילת הניסוי היומי
    1. הכן את בקבוקון התרבות עם שלושה tubings Tygon אולטרה-כימי עמיד עם אינץ פנימי בקוטר 1/32 ו- inch בקוטר 3/32 חיצוני עבור צריכת אוויר כדי ליצור את המכשיר כאמור בסעיף1.1 וב משלים איור 1.
    2. הכן את המדיום מינימלי M9 (0.2% גלוקוז) וסרימתופרים (TMP) בינוני המכיל תרופה. לעקר את המדיום, הבקבוק הבינוני, בקבוק בינוני התרופה, בקבוק פסולת, ואת בקבוקון התרבות ב חיטוי ב 121 מעלות צלזיוס.
      הערה: TMP הוא פתרון המניות המשמש מאוחר יותר להשיג את הריכוזים בטבלה 1 והתרופה TMP המכיל בינוני אינו autoclaved.
  2. הרצת Morbidostat
    1. ביום הראשון של הניסוי, להפשיר 1 מ"ל של סוג בר קפוא E. coli MG1655 התאים למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר ולהעביר 120 μl של תאים כדי בקבוקון תרבות המכילה ~ 12 מ"ל של מדיום הגידול M9. אחרי היום הראשון, להפשיר 1 מ"ל של E. קפוא coli תאים מן היום הקודם במשך 5 דקות ולהעביר 120 μl של תאים כדי בקבוקון תרבות חדשה המכילה ~ 12 מ"ל של מדיום הגידול M9.
    2. הפעל החממה שייקר ולהגדיר את בטמפה rature עד 30 מעלות צלזיוס ללא רעד.
    3. להתחיל את הפעולה morbidostat על ידי הפעלת משאבת מיקרו, היחידה בחישה מגנטית, ומדידת צפיפות אופטית.
      הערה: במהלך המבצע, אלגוריתם סף משוב משמש כדי לשלוט על הזרקת סמים. כאשר הצפיפות האופטית נמדדה עוברת סף שנקבע מראש, משאבת הזרקת התרופה הייתה להיות מופעל המשאבה הבינונית תהיה כבויה. אחרת, משאבת הזרקת התרופה נותרת כבויה ואת המשאבה הבינונית פועל.
    4. לפקח על המתח מעת לעת כדי להבטיח שיש התפתחותם של חיידקים.
      הערה: בגלל מחזור הקפאת הפשרה, E. coli תאי תערוכת עיכוב של ~ 4 שעות במהלך כל זקן בן יום.
    5. אחרי ~ 23 שעות, להפסיק את שאיבת מיקרו-ידי כיבוי מתח האספקה ​​שלה להוציא את הבקבוקון תרבות. הוסף 15% גליצרול לתוך בקבוקון התרבות ולהקפיא המדגם ב -80 מעלות צלזיוס לאחסון.
    6. חזור על שלבים 2.2.1 עד 2.2.5.
le "> 3. מדידה רגישה לאנטיביוטיקה ב 96 פורמט ובכן

הערה: בצע את מדידת קצב צמיחה קוראת צלחת עם פורמט 96 גם כדי לקבוע את רמת עמידות לאנטיביוטיקה.

  1. להפשיר את המדגם הקפוא היומי בטמפרטורת חדר למשך 5 דקות ולהעביר 15 μl של התא אל בקבוקון התרבות המכיל ~ 15 מיליליטר בינוני M9. ולאפשר להם לגדול עד הצפיפות האופטית ב 600 ננומטר מגיעה ~ 0.1. מחלקים את 15 מ"ל לתוך 1 מ"ל בקבוקים ולהוסיף התרופה TMP בשלב זה כדי לקבל את ריכוזי התרופה הרצויה כפי שמוצג בטבלה 1.
  2. קח 200 μl של המדגם משלב 3.1 ומקום לבאר כל בקורא צלחת ולאפשר להם לגדול במשך 12 שעות 5. הצפיפות האופטית ב ננומטר אורך גל 600 נרשמה באופן אוטומטי בזמן המדידה.
    הערה: עבור כל נקודת נתונים, מדידות בשלושה עותקים נרשמות בממוצע כדי להבטיח עקביות של הנתונים. הנתונים על צפיפות אופטית לעומת הזמן יכול בדואר על מנת לקבל את שיעור הצמיחה.
  3. מגרש את נתוני שיעור צמיחה לעומת ריכוז התרופה להשיג IC 50. שים לב IC 50 מוגדר ריכוז התרופה שבה שיעור הצמיחה הוא חמישים אחוזי שיעור הצמיחה המקסימאלי 5.

מורפולוגיה 4. תא בודד ומדידה רגישה לאנטיביוטיקה ב מכשירי microfluidic

  1. בצע ייצור של מכשירי microfluidic באמצעות ליתוגרפיה multilayer הרכה מן PDMS כמתואר במקום אחר 15.
    1. השתמשו photolithography כדי להפוך את התבנית photoresist עבור שכבות שליטה וזרימה. שים לב כי עבור השכבה מלאה, השתמש photoresist שלילית (~ 15 מיקרומטר גובה) ו photoresist חיובי (~ 8 מיקרומטר גובה) לייצר עובש על פרוסות סיליקון חשוף.
    2. הכן תערובות PDMS עם יחס לחצות קישור 5: 1 ו -20: 1 עבור ההשכבה מלאת השכבת הזרימה, בהתאמה. שים את התערובות לתוך ייבוש תחת ואקום כדי להסיר בועות, במשך שעה 1.
    3. לחשוף את תבניות photoresist השכבה מלאה על פרוסות סיליקון כדי trimethylchlorosilane אדי (TMCS). הפוך את השכבה המלאה של ~ עובי מ"מ 6 על ידי יציקה את תערובת PDMS (עם יחס לחצות קישור 5: 1) על פרוסות סיליקון על תבנית photoresist השכבה המלאה. אופים את השכבה מלאה במשך 40 דקות ב 80 מעלות צלזיוס במשך שעה 1. בתנור.
    4. הפוך את שכבת זרימת ידי ספין ציפוי תערובת PDMS (עם 20 יחס לחצות קישור: 1, ספין מהירות 3,000 סל"ד במשך 60 שניות) על תבנית photoresist שכבת הזרם. אופים את שכבת זרימת למשך 30 דקות ב 80 מעלות צלזיוס במשך שעה 1. בתנור.
    5. השתמש סכין גילוח לחתוך את השכבה מלאה לתוך גודל השבב הרצוי (בדרך כלל 3 ס"מ X 2 ס"מ) ידני לקלף את השכבה מלאה. מניח את השכבה המלאה על גבי שכבת הזרימה וליישר אותם תחת סטראו. לרפא את המכלול מיושר על 80 מעלות צלזיוס למשך הלילה בתנור. לאחר מכן, יש להשרות את הרכבה ב 250 מ"ל מים ללא יונים במיכל פלסטיק במשך 5 שעות כדי לפזר את TMCS שיורית.
    6. בהמשך לכך, אגרוף החורים מפרצון עם 20 מחטים G והאג"ח אלסטומר כולו לשקופית זכוכית מצופה בשכבה PDMS ריק (צלב PDMS המקשר יחס 5: 1, ספין מהירות 2,000 סל"ד למשך 30 שניות) על ידי טיפול פלזמה אוויר במשך 40 שניות ב לחץ 1.2 אוויר Torr.
    7. לבצע אפייה נרחבת במשך 36 שעות ב 80 מעלות צלזיוס כדי להפחית את ההשפעות ציטוטוקסיות מן PDMS. שים לב, שלב האפייה זה הוא קריטי כדי למזער את רעילות תאים חיידקיים.
  2. על שבב צמיחת ניסוי
    1. לפני הטעינה לתוך מכשיר microfluidic, יש לשטוף אותו עם מים ללא יונים 1 hr ובינוני M9 עבור שעה 1.
    2. להפשיר את המדגם הקפוא היומי בטמפרטורת חדר למשך 5 דקות ולחסן מבחנה חדשה עם מדיום M9 טרי. הנח את הדוגמה חממה שייקר ב 37 מעלות צלזיוס למשך הלילה.
    3. לדלל את הקיפול 10 מדגם חיידקים עם המדיום M9 ולטעון אותו לתוך המכשיר microfluidic על ידי הפעלת לחץ על מיכל מדגם חיידקים ב 5 psi. לאחר מכן טען את תרופת TMPמדיום לתוך השבב על ידי הפעלת לחץ על מיכל בינוני התרופה 5 psi. הפעל את הערבוב בין חיידק התרופה על ידי מפעילי שסתום micromechanical בין שני החדרים על שבב microfluidic במשך 15 דקות.
    4. מניח את שבב microfluidic בחממת מיקרוסקופ רכובה על מיקרוסקופ ההפוכה. רוכש את תמונת התא בתא הצמיחה בכל שעה במשך 8 שעות עם מצלמת CCD רכוב על מיקרוסקופ ההפוכה.
    5. השתמש תסריט התכנית האישית כדי לחשב את מספרי התא באמצעות אלגוריתם סף על נתוני תמונת תא 18. ראוי לציין כי הנתונים מספר הסלולרי הם ממוצעים בדרך כלל מעל שלושה תאי microfluidic.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

Morbidostat המתואר לעיל הוא schematized באיור 1. פעילות morbidostat המשותפת, לרבות התפתחות ניסיונית, מבחן רגישות לאנטיביוטיקה ובדיקת מורפולוגיה תא, אושש בבית E. תרבות MG1655 coli נחשף וסרימתופרים (TMP), תרופה אנטיביוטית נפוץ 5,6. TMP גורם עליות בשלבים ייחודיות מאוד עמידים לתרופות, ואת מוטציות מקובצים סביב דיהידרופולאט רדוקטאז (DHFR) הגן. לכן, TMP הוא סם תקן יעיל מאוד עבור אימות מבצע morbidostat. כל יום,...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

מכשיר morbidostat נמוך טביעת רגל מרכיבים בעלות הנמוכה מודגם. העליות רמות עמידות לתרופות שנרשמו על ידי המכשיר הנן עקביות עם אלו של דוחות קודמים 5. עוצב עבור מחקרים אבולוציוניים של עמידות לתרופות, המכשיר הוא ישים פוטנציאל ניסויים רבים אחרים. ראשית, מסד נתונים מקיף של מוטציות-סמים ניתן לקבוע עבור קבוצה גדולה של אנטיביוטיקה משמעות קלינית. לדוגמה, מסלול אבולוציוני של עמידות לתרופות מרובות ניתן ללמוד רק על ידי הגדלת מספר התרופות השתמשו בניסוי. היתרון העיקרי של מודול דיווח כאן...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

למחברים אין מה לחשוף.

תודות

המחברים מבקשים להודות לפרופ' סזה-בי סו ולגב' ג'נז'ן על דיונים מועילים ועזרה בניתוח התיאורטי ובסימולציה הנומרית. י.ת.י. מבקש להודות לתמיכה במימון ממשרד המדע והטכנולוגיה תחת מענקים מספרי MOST 103-2220-E-007-026 ו-MOST 104-2220-E-007-011, ומהאוניברסיטה הלאומית צינג הואה תחת מענק מספרי 103N2042E1, 104N2042E1 ו- 105N518CE1.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
חממת שייקר סביבתיBioSanES-20
Arduino לאונרדו לוחארדואינולאונרדו
680 אוהם נגד פחמןDigikeyהטיה נגד עבור LED
100k אוהם נגד פחמןDigikeyהטיה נגד פוטו-טרנזיסטור
940 ננומטר דיודה פולטת אורבהיר LED אלקטרוניBIR-BM13E4G-2מדידת צפיפות אופטית
940 ננומטר פוטו-טרנזיסטורKodenshi ST-2L2Bמדידת צפיפות אופטית
דרלינגטון IC ToshibaMouserULN2803APGIC זה דוחף מיקרו-משאבות ויחידת ערבוב מגנטית
5 V DC מאוורר ללא מברשותADDAAD0405LX-G70מפרט: מתח אספקה 5 V ו-80  אמא; זמין www.jameco.com
מיקרו-משאבה פיזואלקטריתCurieJetPS15I-FT-5Lלחץ > 3  kPa; קצב זרימה >5 מ"ל/דקה
Tygon 3350 כוונוןסנט גובייןABW00001ID: 1/32 אינץ' OD: 3/32 אינץ' L:50' 
מוט ערבוב מגנטיCOWIEצורה מחודדת עמומה: 10  מ"מ x 4 מ"מ
נצנוץ זכוכית 20 מ"ל בקבוקוןDGSפיירקס זכוכית 28 מ"מ (קוטר) x 61 מ"מ (גובה)
בקבוקון תרבותמיוצר בהתאמה אישית מפוליפורמלדהיד 
סיליקוןDow CorningSylgald 184המשמש לאיטום בקבוקון הזכוכית
בקבוק בינוניVWR66022-065
Difco M9 מלח מינימלי 5xBD
חומצת קדמינוBD
גלוקוזסיגמא
אוקסואידבטריולוגילצלחת אגר
Luria Bertani בינוני
מיקרוסקופ הפוךLeica MicrosystemsLeica DMI-LEDהמשמש למדידה מיקרופלואידית השתמש 40X אובייקטיבי NA = 0.55
חממת מיקרוסקופמכשיר תא חיCU-109המשמש למדידה מיקרופלואידית
שסתומים סולנואידייםPneumadyneS10MM-31-12-3פתוח בדרך כלל 1.3 וואט 12 Vdc
כרטיס ממשק USBמודול קלט/פלט דיגיטלי USBIO24-Rהנדסת תחביביםלמדידת מיקרופלואידיקה
מדחס אווירנדנדה מדעיתROCKER 440מקור לחץ למיקרופלואידים; מקסימום לחץ 80 psi
אביזרי נעילת לואר זכר ל-1/8 אינץ' דוקרניםValuePlastics.comMTLL230-1המשמש לבקרה מיקרופלואידית
1/8 אינץ' דוקרנים ליציאת הברגה 10-32ValuePlastics.com-B-1המשמש לבקרה מיקרופלואידית
אביזרי נעילת לואר נקבה ליציאתהברגה 10-32ValuePlastics.comKFTL-1המשמש לבקרה מיקרופלואידית
טרנזיסטור NPN דרלינגטון 500 mA, 40  V (2N6427)DigiKey.com2N6427GOS-NDמשמש לבקרה מיקרופלואידית
10 kOhm, נגד סרט פחמן, 0.25 WDigiKey.comP10KBACT-NDהמשמש לבקרה מיקרופלואידית
קבל טנטלום, 10  μ F, 25 V, 10%DigiKey.com478-1841-NDמשמש לבקרה מיקרופלואידית מצלמת
Andor CCDAndorZyla 4.2 Plus SCMOSהמשמשת להדמיית מיקרופלואידית על שבב
קורא
סיליקון דו-רכיבי MomentiveRTV 615המשמש לייצור שבבים מיקרופלואידיים
SU-8 פוטו-רזיסטMicrchemSU8 2015המשמש לייצור שבבים מיקרופלואידיים
AZ4620 פוטו-רזיסטClariantAZ 4620המשמש לייצור שבבים מיקרופלואידיים
מנקה פלזמהHarrick PlasmaPDC 32Gהמשמש לייצור שבבים מיקרופלואידיים
20 מד מזרק מחטBDמשמש לייצור שבבים מיקרופלואידיים
LabcyclerSensoquestLabcyclerPCR
DNA פולימראזטויובוKDO פלוסהגברת PCR
קורא צלחות TrimethoprimSigma
BiotekSynergy H1 היברידי מדידת אנטיביוטיקה רזיסטן
זוג מחזיק בינונית בינוני אגר  צלחות ELISA

מקורות

  1. Levy, S. B., Marshall, B. Antibiotic resistance worldwide: causes, challenges, and responses. Nat. Med. 10, s122-s129 (2004).
  2. Wang, M. M., et al. Tracking the in vivo evolution of multidrug resistance in Staphylococus aureus by whole genome sequencing. Pro. Natl. Acad. Sci. 104, 9451(2007).
  3. Dragosits, M., Mattanovich, D. Adaptive laboratory evolution - principles and applications for biotechnology. Microbial Cell Factory. 12, 64(2013).
  4. Zhang, Q., et al. Acceleration of emergence of bacterial antibiotic resistance in connected microenvironment. Science. 333, 1764-1767 (2011).
  5. Toprak, E., Veres, A., Michel, J. B., Chait, R., Hartl, D. L., Kishony, R. Evolutionary paths to antibiotic resistance under dynamically sustained drug selection. Nature Genetics. 44, 101-106 (2012).
  6. Toprak, E., et al. Building a morbidostast: an automated continuous culture device for studying bacterial drug resistance under dynamically sustained drug inhibition. Nature Protocol. 8, 555-567 (2013).
  7. Rosenthal, A. Z., Elowitz, M. B. Following evolution of bacterial antibiotic resistance in real time. Nature Genetics. 44, 11-13 (2012).
  8. Young, K. In vitro antibacterial resistance selection and quantitation. Curr Protoc Pharmacol. , (2006).
  9. Novick, A., Szilard, L. Experiments with the Chemostat on spontaneous mutations of bacteria. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 36, 708-719 (1950).
  10. Balagadde, F. K., You, L., Hansen, C. L., Arnold, F. H., Quake, S. R. Long-term monitoring of bacteria undergoing programmed population control in a microchemostat. Science. 309, 137-140 (2005).
  11. Groisman, A., et al. A microfluidic chemostat for experiments with bacterial and yeast cells. Nat. Methods. 2, 685-689 (2005).
  12. Miller, A. W., Befort, C., Kerr, E. O., Dunham, M. J. Design and Use of Multiplexed Chemostat Arrays. J. Vis. Exp. (72), e50262(2013).
  13. Takahashi, C. N., Miller, A. W., Ekness, F., Dunham, M. J., Klavins, E. A low cost, customizable turbidostat for use in synthetic circuit characterization. ACS Synthetic Biology. , (2015).
  14. Mohan, R., et al. A multiplexed microfluidic platform for rapid antibiotic susceptibility testing. Biosens Bioelectrons. 49, 118-125 (2013).
  15. Unger, M. A., Chou, H. P., Thorsen, T., Scherer, A., Quake, S. R. Monolithic microfabricated valves and pumps by multilayer soft lithography. Science. 288, 113-116 (2000).
  16. Kellogg, R. A., Gomez-Sjoberg, R., Leyrat, A. A., Tay, S. Nat. Protocols. 9, 1713(2014).
  17. Gu, G. Y., Lee, Y. W., Chiang, C. C., Yang, Y. T. A nanoliter microfluidic serial dilution bioreactor. Biomicrofluidics. 9, 044126(2015).
  18. Gonzalez, R. C., Woods, R. E., Eddins, S. L. Digital image using Matlab processing. , Pearson Prentice Hall. Upper Saddle River, New Jersey. (2004).
  19. Heikkila, E., Sundstrom, L., Huovinen, P. Trimethoprim resistance in Escherichia coli isolates from a geriatric unit. Antimicrob. Agents Chemother. 34, 2013-2015 (1990).
  20. Flensburg, J., Skold, O. Massive overproduction of dihydrofolate reductase in bacteria as a response to the use of trimethoprim. Eur. J. Biochem. 162, 473-476 (1987).
  21. Ohmae, E., Sasaki, Y., Gekko, K. Effects of five-tryptophan mutations on structure, stability and function of Escherichia coli dihydrofolate reductase. J. Biochem. 130, 439-447 (2001).
  22. Smith, D. R., Calvo, J. M. Nucleotide sequence of dihydrofolate reductase genes from trimethoprim-resistant mutants of Escherichia coli. Evidence that dihydrofolate reductase interacts with another essential gene product. Mol. Gen. Genet. 187, 72-78 (1982).
  23. Okumus, B., Yildiz, S., Toprak, E. Fluidic and microfluidic tools for quantitative systems biology. Curr Opin Biotech. 25, 30-38 (2014).
  24. Cho, J., et al. A rapid antimicrobial susceptibility test based on single-cell morphological analysis. Sci. Transl. Med. 17, 267(2014).
  25. Hsu, S. B., Waltman, P. E. Analysis of a model of two competitors in a chemostat with an external inhibitor. SIAM J. Applied Math. , 528-540 (1992).
  26. Fu, W., et al. Maximizing biomass productivity and cell density of Chlorella vulgaris by using light-emitting diode-based photobioreactor. J. Biotech. 161, 242-249 (2012).
  27. Peabody, V. G. L., Winkler, J., Kao, K. C. Tools for developing tolerance to toxic chemicals in microbial systems and perspectives on moving the field forward and into the industrial setting. Curr Opin in Chem Eng. 6, 9-17 (2014).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

Escherichia coli

מאמרים קשורים