התאמנו תוספת ממברנה מיקרו-נקבובית חדירה כדי לחקות את המיקרו-סביבה של הגידול (TME). המודל מורכב מתרבית תאים מעורבת, מאפשר יצירה פשוטה של אוכלוסיות תאים בודדות מועשרות מאוד ללא שימוש בתיוג פלואורסצנטי או מיון תאים, ומאפשר לחקור תקשורת בין-תאית בתוך ה-TME בתנאים רגילים או בתנאי עקה.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
חקיין של microenvironment הגידול: שיטה פשוטה ליצירת אוכלוסיות תאים מועשרות חוקרים אינטר תקשורת
במאמר זה
סיכום
תקציר
הבנת יחסי גומלין heterotypic מוקדם בין תאים סרטניים ואת stroma שאינו סרטני שמסביב חשובה הבהיר את האירועים שהובילו הפעלת סטרומה והקמת microenvironment הגידול (TME). כמה במבחנה במודלים vivo של TME פותחו; עם זאת, באופן כללי מודלים אלה אינם מאפשרים בידוד בקלות של אוכלוסיות תאים בודדות, בתנאים שאינם מביך, למחקר נוסף. כדי לעקוף את הקושי הזה, יש לנו עבד מודל TME במבחנה באמצעות מצע צמיחת תאים מורכבים להכניס קרום microporous חדיר המאפשר דור פשוט של אוכלוסיות תאים מועשרות גדל באופן אינטימי, עדיין בנפרד, משני צדי הממברנה של הכנס על שיתוף המורחבת פעמים -culture. באמצעות שימוש במודל זה, אנו מסוגלים לייצר פיברובלסטים סרטן קשור מועשרים מאוד (CAF) אוכלוסיות פיברובלסטים אדם דיפלואידי נורמלים הבאותשיתוף תרבות (120 שעות) עם תאי סרטן שד אנושיים גרורתי מאוד, ללא שימוש תיוג ניאון ו / או מיון התא. בנוסף, על ידי הוויסות הנקבובית בגודל של הכנס, אנחנו יכולים לשלוט על המצב של תקשורת בין תאית (למשל, תקשורת צומת-פער, גורמים מופרשים) בין שתי אוכלוסיות תאי heterotypic, המתיר חקירת המנגנונים העומדים בבסיס הפיתוח של TME, כולל התפקיד של חדירות צומת-הפער. מודל זה משמש כלי רב ערך לשיפור הבנתנו את האירועים הראשוניים שהובילו ייזום הסרטן-stroma, תחילת האבולוציה של TME, ואת אפקט הכיוונון של stroma על התגובות של תאים סרטניים לסוכנים טיפוליים.
מבוא
במיקרו-סביבה של הגידול (TME) הוא מערכת מורכבת מאוד מורכבת תאי קרצינומה כי להתקיים ולהתפתח לצד stroma המארח. רכיב סטרומה זה בדרך כלל מורכב פיברובלסטים, myofibroblasts, לתאי אנדותל, רכיבי חיסון שונים, כמו גם תאי מטריקס 1. מרכיב משמעותי, לעתים קרובות רוב stroma זה, הם פיברובלסטים מופעלים, מכונים לעתים קרובות כמו פיברובלסטים סרטן קשור או פיברובלסטים הקשורים קרצינומה (CAF) 2,3. בניגוד נורמלי, פיברובלסטים שאינם מופעל, cafs לתרום התחלה של גידול, התקדמות, אנגיוגנזה, פלישה, גרורות, והישנות 4-11 במגוון רחב של גידולים סרטניים, כולל סרטן שד, ערמונית, ריאות, לבלב, עור, מעי גס, ושט, השחלה 5,6,12-17.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
1. הכנת מדיה התרבות תאים
- הכן 500 מ"ל של מדיום חיוני מינימום של הנשר בתוספת 12.5% (כרך / כרך) בסרום שור העובר חום מומת (FBS), 2 מ"מ L- alanyl-L- גלוטמין, ו -100 יחידות של פניצילין 100 מיקרוגרם של סטרפטומיצין לכל מיליליטר.
הערה: מדיום גידול התוספת (ים) ניתן להחליף בקלות לדרישות הצמיחה של זני תאים אחרים או שורות תאים. - כן 70 μl של מדיום תרבית תאים עבור כל כנס (להוסיף פורמט 6-גם): המדיום החיוני המינימום של הנשר בתוספת 50% (כרך / כרך) FBS חום מומת, 2 מ"מ L- alanyl-L- גלוטמין, ו -100 יחי....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
כאן התאמנו להכניס קרום microporous חדיר לפתח תאים במבחנה heterotypic מערכת שיתוף תרבות המחקה את microenvironment הגידול vivo (איור 1). מערכת זו מאפשרת שתי אוכלוסיות תאים שונות כדי להיות מבוגרות משני הצדים הנקבובי-הקרום של הכנס לפרקי זמן (עד 120 שעות, בשימוש שלנו). חשוב במערכת הוא מסוגלת לשמור על טוהר אוכלוסיות תאים, כפי שנקבע על ידי תאי ציפוי GFP-tagged מד"א- MB-231 בצד העליון של 0.4-, 1-, או 3 מ-נקבובי מוסיף.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
הפרוטוקול המתואר כאן הוא פשוט, להתאמה בהליך במבחנה (איור 1) אשר מנצל להכניס קרום microporous חדיר ליצור אוכלוסיות תאים בודדות מועשר מתוך שיתוף תרבות של תאי heterotypic. באופן משמעותי, המודל מתאים חוקרת מצבים שונים של תקשורת בין תאית. השלבים הקריטיים כוללים בחירת הכנס נקבובי בגודל המתאים עניין ניסוי ספציפי (ים), זריעת אוכלוסיית התא הראשונה בצד התחתון של להכניס במדיום השלים עם 50% FBS, זריעת אוכלוסיית התא השנייה בצד העליון של הכנס, ושיתוף culturing שתי אוכל.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
החוקרים מצהירים כי אין להם אינטרסים מתחרים או סותרים.
תודות
מחקר זה נתמך על ידי מענקים מוועדת ניו ג'רזי לחקר הסרטן (מלגת קדם-דוקטורט DFHS13PPCO17), המכונים הלאומיים לבריאות (CA049062) ומינהל האווירונאוטיקה והחלל הלאומי (NNX15AD62G).
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| <חזק>לתרבית תאים | |||
| AG01522 (כלומר, AG1522) פיברובלסט דיפלואידי אנושי | Coriell | 107661 | Passage 8-13 |
| MDA-MB-231-luc-D3H1 קו תאי אדנוקרצינומה של השד | PerkinElmer | 119261 | קו הורים: ATCC (#HTB-26) |
| MDA-MB-231/GFP קו תאי אדנוקרצינומה של השד | Cell Biolabs | AKR-201 | |
| Eagle's minimal essential medium (MEM) | Corning Cellgro | 15-010-CV | |
| סרום בקר עוברי (FBS), | סיגמא | F6178-500 מ"ל | |
| קורנינג גלוטגרו מוסמך (200 מ"מ L-alanyl-L-גלוטמין) | Corning Cellgro | 25-015-Cl | |
| תמיסת סטרפטומיצין פניצילין, 100x | Corning Cellgro | 30-002-Cl | |
| Transwell Insert (כלומר, הכנסת ממברנה מיקרו-נקבובית חדירה) (0.4 μ m נקבוביות) | Costar | 3450 | |
| Transwell Insert (כלומר, תוספת ממברנה מיקרופורית חדירה) (1 μ m נקבוביות) | Greiner bio-one | 657610 | |
| Transwell Insert (כלומר, הכנסת ממברנה מיקרופורית חדירה) (3 μ m נקבוביות) | Costar | 3452 | |
| 6-well Culture Plate | Greiner Bio-One Cellstar | 657160-01 | |
| 75 ס"מ2 בקבוק תרבית תאים | CellStar | 658 170 | |
| תמיסת מלח חוצץ פוספט (PBS), 1x | Corning Cellgro | 21-040-CV | ללא סידן ומגנזיום |
| 0.25% (נפח/נפח) טריפסין, 2.21 מ"מ EDTA, 1x | Corning Cellgro | 25-053-Cl | |
| 15 מ"ל צינור צנטריפוגה | CellTreat | 229411 | |
| 35 מ"מ x 10 מ"מ צלחת תרבית תאים | גריינר ביו-וואן | 627 160 | |
| <חזק>שם | <חזק>חברה | <חזק>מספר קטלוגי | <חזק>הערות |
| <חזק>למיקרוסקופיה אימונופלואורסצנטית | |||
| Mouse anti-Caveolin 1 | BD Transduction Laboratories | 610406 | In situ Immunofluorescence - 1:5,000 |
| נוגדן משני IgG (H+L) נגד עכבר עזים, Alexa Fluor 488 מצומד | ThermoFisher Scientific | A-11029 | In situ אימונופלואורסצנציה - 1:2,000 |
| אלבומין סרום בקר - Fraction V | Rockland | BSA-50 | ללא אימונוגלובולין ופרוטאז |
| 16% (wt/vol) תמיסת פורמלדהיד | ThermoFisher Scientific | 28908 | מדלל ל-4% עם 1x PBS |
| Premium Cover Glass (22 מ"מ x 22 מ"מ מס' 1) | Fisher | 12548B | |
| Triton X-100 | Sigma | T8787-50ML | |
| SlowFade Gold מגיב אנטי-דהייה עם DAPI | Invitrogen | S36938 | |
| <חזק>שם | <חזק>חברה | <חזק>מספר קטלוגי | <חזק>הערות |
| <חזק>לניתוח ציטומטרי זרימה | |||
| סידן, | בדיקות מולקולריות | AM C3100MP | |
| תמיסת מלח מאוזנת של הנקס (HBSS) | Gibco | 14025-076 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| For Western Blot Analysis | |||
| Mouse anti-Caveolin 1 | BD Transduction Laboratories | 610406 | Western Blot - 1:1,000 |
| Tween-20 | BioRad | 170-6531 | |
| ממברנת ניטרוצלולוזה (0.2 μ m) | BioRad | 162-0112 | |
| Western Lightning Plus-ECL | PerkinElmer | NEL104001EA | |
| BioRad DC Protein Assay | BioRad | 500-0116 | |
| נתרן דודציל סולפט (SDS) | BioRad | 161-0302 | |
| נתרן דאוקסיכולאט מונוהידראט (DOC) | Sigma | D5670 | |
| IGEPAL CA-630 (NP40) | Sigma | I8896 | |
| 30% תמיסת אקרילאמיד/BIS, 37.5:1 | BioRad | 161-0158 |
מקורות
- Hanahan, D., Weinberg, R. A. The hallmarks of cancer. Cell. 100 (1), 57-70 (2000).
- Olive, K. P., Jacobetz, M. A., et al. Inhibition of Hedgehog signaling enhances delivery of chemotherapy in a mouse model of pancreatic cancer. Science. 324 (5933), 1457-1461 (2009)....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
