גישה פשוטה מניפולציות חמצן מומס לתצפיות התנהגות בעלי החיים

סיכום

מאמר זה מתאר פרוטוקול פשוט לשחזור כדי לתפעל תנאי חמצן מומסים במעבדת הגדרה ללימודי התנהגות בעלי החיים. פרוטוקול זה יכול לשמש הוא הגדרות הוראת מעבדת המחקר להעריך תגובה האורגניזם של חסרי חוליות, דגים, דו-חיים או לשינויים בריכוז חמצן מומס.

תקציר

היכולת לתפעל חמצן מומס (DO) במעבדת הגדרה יש משמעות ישומית לחקור מספר שאלות התנהגות אקולוגיות האורגניזם. הפרוטוקול המתואר כאן מספק שיטה פשוטה, לשחזור, ומבוקר לתמרן לעשות כדי ללמוד תגובה התנהגותית באורגניזמים ימיים הנובעות מחוסר חמצן ותנאי anoxic. בעת ביצוע degasification מים עם החנקן הוא נפוץ הגדרות במעבדה, אין שיטה מפורשת לשימוש אקולוגי (מימי) קיימת בספרות, ואת הפרוטוקול זה הוא ראשון שתאר פרוטוקול degasify מים להתבונן בתגובה האורגניזם. טכניקת פרוטוקול זה פותחו עבור יישום ישיר עבור חסרי חוליות ימיות; עם זאת, דגים קטנים, דו-חיים, ובעלי חוליות מימיות אחרות לא יוכל להחליף בקלות. זה מאפשר מניפולציה קלה של רמות DO הנעה בין 2 מ"ג / L עד 11 מ"ג / L עם יציבות עד לתקופת חיה בטחונית 5 דקות.מעבר לכל טמפרטורות מי תצפית תקופה של 5 דקות החלו לעלות, וב -10 דקים 'DO הרמות הפכו יציבות מכדי לשמור. הפרוטוקול הוא ניתן להרחבה עד האורגניזם המחקר, לשחזור, אמין, המאפשר יישום מהיר לתוך מעבדות הוראת היכרות ויישומי מחקר ברמה גבוהה. התוצאות הצפויות של טכניקה זו צריכות להתייחס מומסות שינויי חמצן תגובות התנהגותיות של אורגניזמים.

מבוא

חמצן מומס (DO) הוא פרמטר physiochemical מפתח חשוב בתיווך מספר התהליכים ביולוגיים ואקולוגיים בתוך מערכות אקולוגיות מימיות. חשיפה לסיכוני היפוקסיה תת-קטלנים חריפה וכרונית להפחית את שיעורי צמיחת חרקים ימיים מסוימים ולהפחית את ההישרדות של חרקים חשופים ^1. פרוטוקול זה פותח כדי לספק שיטה מבוקרת לתפעל רמות DO במים זרמו בבחינת ההשפעות על התנהגות בעלי חיים. מכיוון שכל ההישרדות 'אורגניזמים הימיים האירוביים תלויה בריכוז החמצן כדי לחיות ולהתרבות, שינויים בריכוזים של DO משתקפים לעתים קרובות שינויים התנהגותיים על ידי אורגניזמים. עוד חסר חוליות ודגים ניידות מימיות נצפו להגיב ריכוזי חמצן נמוכים (חוסר חמצן) על ידי מבקשי אזורים עם DO הגבוה ^2,3. לאורגניזמים מימיים ניידים פחות, עיבודים התנהגותי להגדיל את הצריכה של DO עשויה להיות האפשרות המעשית היחידה. צו macroinvertebrate המימי של Plecoptera (Stonefly) כבר ציין לבצע תנועות "שכיבות למעלה" כדי להגביר את זרימת המים, ספיגת החמצן, על פני הזימים ⁴ החיצוני שלהם ^{- 6.} התנהגויות מסתגלות אלו נצפו בסביבות טבעיות בניסויי מעבדה.

מניפולציה מעבדה של DO במים פותחת הזדמנויות משמעותיות ללימודי התנהגות בעלי חיים, אך פערים משמעותיים פריסה מתודולוגית להתקיים. לדוגמא, מחקר אחד המשמש לאקווריום גדול כדי להעריך את זמן תגובה הפיזיולוגי של בס Largemouth (salmoides Micropterus) לסביבות היפוקסי הבאים בגז עם חנקן, אבל פרט דל ניתן לחישוב על פי השיטה ^7. מחקר נוסף מבוצע על דג הזברה (Danio rerio) מתואר באמצעות גז חנקן אבן נקבובית לספק גז מים ולהפחית את DO של המים ^8. עבור יישומים מבוססי כימיה, שיטות degasification ממס לנצל מיוחדותמנגנון ^{9 - 11} כדי להסיר חמצן ממסים, אבל לא יהיה מתאים מחקרי התנהגות בעלי החיים. בעוד שמחקרים אלה מפעילים שיטות להסרת חמצן ממים, אין שיטה תיאורי ניתן היה לזהות שתאפשר הערכה של התנהגות בעלי חיים בתגובה DO שינויים.

שיטה זו המתוארת להלן היא ניסיון מתארים פרוטוקול מלא עבור מניפולציה של DO של מים באמצעות גז חנקן. יתר על כן, שיטה זו פותחה כלפי התבוננות יחסים בין התנהגות Stonefly (שכיבות שמיכה) ולעשות כי הועסק במעבדה לביולוגיה בכיתה ט 'ברמה. אחד היתרונות העיקריים של שיטה זו היא שהיא יכולה להתבצע בקלות בתוך מעבדה עם זכוכית משותפת וחומרים ונגישים ביותר במוסדות להשכלה תיכוניים וגבוהים. הפרוטוקול הוא גם להתאמה בקלות, ומאפשר לאנשים לטפס על ההליך כדי לעמוד ביעדים שנקבעו עבור יישומי מחקר או הוראה.

פרוטוקול

הערה: ניסוי זה לא להשתמש חוליות ולכן לא טעונה אישור מכון של מכללת Juniata לטיפול בבעלי חיים ועדת שימוש. עם זאת עבור אנשים התאמת שיטה זו לשימוש עם חוליות, אישור IACUC יש לחפש.

אוסף דוגמאות שדה 1.

1. לקבוע ולהעריך אתרי שדה פוטנציאל היכולת לאסוף, לאחסן stoneflies התחבורה במהירות כדי למזער את הזמן במעבר עם זמן מקסימאלי מומלצת במעבר של 1 שעה.
2. בצע דגימה נטו בעיטה באתר השדה שנבחר בעקבות הליכים סטנדרטיים בעיטה-נטו מספיק פעמים כדי לאסוף לפחות 35 stoneflies ^12.
3. אסוף 50 ליטר של זרם מים וסלעים בקוטר מקסימאלי של 2 סנטימטרים מזרמים.
4. מניח אקווריומים במקרר מוגדר הטמפרטורה של אתר הנחל. פזר סלעים שנאספו באתר זרם לתוך אקווריומים ולמלא עם 4 ליטר מים זרם לכל אקווריום. מקום 20-30 Stoneflies שנאספו לכל אקווריום ומניחים אבן מבעבע מצורף bubbler אקווריום לתוך כל טנק ולהדליק bubblers להוסיף ברציפות באוויר חדר אל המים.
5. אפשר stoneflies כדי להסתגל לסביבה החדשה אקווריומים לתקופת 48 שעות.

איור 1. גדר עבור מניפולצית חמצן מומסת. (א) 1) נאוה צינור נחוש צינור זכר עקיצה 2) מיקום של חותם פקק לבחון להבטחה גם איטום בקבוק. (ב) 1) 2 L בצד זרוע מולא בקבוק עם 1.9 ליטר מים 2) צינור גז bubbler האוויר (כחול) לשימוש מבעבע חנקן מבעבע אוויר בחדר, בהתאמה 3) מיכל חנקן וערכים יעידו 4) 2 בקבוק L מלא 0.4 ליטר של מים עם מד חמצן 5) מומס צינור ואקום שקוע. נא ללחוץ כאןלצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

2. ניסיוני להגדיר

1. על גבי ספסל, לחבר צינור ואקום תקן חומה לזרוע בצד של בקבוקון 2 L בצד הזרוע כמו מוצג (1 באיור 1B).
2. מלאו את הבקבוק עם 1.9 ליטר מים זרם ממיכלי פלסטיק 3 L מחזיק מים זרם שנאספו במקרר להגדיר עד 12 מעלות צלזיוס.
3. מניח את הבקבוק, אבובים על מגש גדול מספיק כדי להכיל באמבט קרח סביב הבקבוק בצד הזרוע מבלי להסתיר את התצוגה של פן הבקבוק ולמלא את המגש עם קרח.
4. מקדחה שני חורים בקוטר 3 מ"מ פקק גומי כדי לאפשר מעבר של 1) צינור נחושת כדי לספק את הגז לכלי השיט ו -2) החללית המטר DO לתוך הבקבוק 2 L בצד הזרוע (1 באיור 1B) .
5. ביצוע חתך לרוחב מהקצה של פקק לאחד החורים כדי לאפשר ישיבה של החוט של חללית DO לתוך הפקק.
6. חבר מצמד עם צינור זכר 3 מ"מעקיצה אל חתיכת צינור נחושת בקוטר 2 מ"מ (1 באיור 1A). ודא כי צינור זה מספיק זמן כדי להגיע עד למרחק של 10 ס"מ של החלק התחתון של הבקבוק תוך הגעה באמצעות פקק.
7. מניחים את הצינור עם מצמד למרות החור השני פקק עד אורך מעומק את הפקק הוא מספיק כדי להגיע עד למרחק של 10 ס"מ של החלק התחתון של הבקבוק.
8. חבר צינור גז פוליאתילן 0.75 מ 'אורך, קירות דק בקוטר של 3 מ"מ עד המצמד על הצינור.
9. חלק השנייה חללית DO הצינור נחושת לתוך הבקבוק ואת החותם את הבקבוק עם הפקק.
10. בדקו חותם מאובטח בין הפקק ואת הבקבוק, כמו גם להתאמה הדוקה בין הצינור ואת חוט הבדיקה בתוך הפקק.
11. מלאו בקבוק 1 ליטר עם 0.4 ליטר של מים ברז ומניחים סמוכים המגש עם אמבט הקרח ירמוס.
12. להטביע את צינור פוליאתילן מאגף תרמוס הגדול למים של בקבוק L 1. אבטח אתצינור עם קלטת כזאת שזה יהיה להישאר תחת מים דרך הניסוי.
13. חבר את קו הגז בקוטר 3 מ"מ מבקבוק הוואקום אל bubbler אקווריום בחדר-אוויר. בגין לבעבע המים בבקבוק 2 ליטר ידי חיבור bubbler אקווריום, אשר מציגה אוויר בחדר וחמצן אל המים.
14. לפקח על ריכוז DO וטמפרטורת המים עם מד DO במשך 5 דקות או עד שיווי המשקל של DO מוקם בתוך החדר כך השינוי קטן DO מתרחש.

3. בדיקת יציבות של עד ניסיוני Set

1. בדוק כל התקנת יציבות DO לפני התוספת של stoneflies.
2. מוסיף שלוש או ארבע אבנים אל בקבוק 2 L, כך יש stoneflies מצע תורם שכיבות שמיכה.
3. בגין מניפולציה משפטו של DO ידי ניתוק צינור הגז מן bubbler מצרף אותו אל קו גז חנקן.
4. בעבוע חנקן ב 20 רגל מעוקב לשעה (CFH) למשך כ 40שניות עד 1 דקות.
5. לאחר DO ירד בתוך 0.5 מ"ג / L של ריכוז היעד, להפחית את זרימת עד 15 CFH ולאפשר ריכוז כדי להקטין אל המטרה.
6. הפסקת זרימת החנקן מייד לאחר ריכוז היעד הוא הגיע.
7. השתמש bubbler חדר-אוויר באקווריום להחזיר את הריכוז לריכוז היעד אם DO יורדת מתחת ליעד.
8. אם DO אינו יציב במהלך הבדיקה של הגדרה ולאחר מכן לבדוק את נפח המים עדיין על 1.9 L ולא מים מחלחלים, טמפרטורת מים היא יציבה ולא משתנה, וחותם על כל האביזרים להיראות חזק ואטום.
9. לאחר שלושה ניסויים בוצעו ואת הנסיין יש ביטחון ביכולת לשלוט DO, לצרף את קו הגז bubbler ואת הבועה לשיווי משקל שוב.
10. הבועה לשיווי משקל על ידי הצמדת צינור גז בקוטר 3 מ"מ bubbler אקווריום ומתחיל תוספת של אוויר בחדר למים עד ריכוז שלהחמצן במים אינו מעלה או לשנות במשך 3 דקות.
11. לאחר בשיווי משקל, להפסיק המבעבעים unseal הבקבוק.

4. ניסוי שכיבות סמיכה הגיעו Stonefly

1. מחלקים את המספר הכולל של stoneflies במספר משקיפים כדי לקבוע את מספר הניסויים לבצע.
2. קביעת רמות DO שונות בין 2 ל -10 מ"ג / L על מנת להעריך את התגובה ההתנהגותית של stoneflies (מספר שכיבות שמיכה).
3. הגדרת בקבוק אחד לכל ניסוי ולהוסיף מספר שווה של stoneflies שכן ישנם משקיפים אל הבקבוק (4 stoneflies בתוך עיצוב זה), מניחים את החללית ואת הצינור בחזרה לתוך הבקבוק, ואז לאטום את הבקבוק עם פקק גומי.
   הערה: ראשוני לעשות ריכוז של 10 מ"ג / L נבחר כנקודת התצפית הראשונה מאז זה היה הריכוז DO של הנחל מאיפה נדגמו stoneflies.
4. לאחר שהמים נמצאים במרחק של 10 מ"ג / L ידי מבעבע ביצוע שלבי 2.10-2.11, להקליט את טמפרטורת המים החל ולאפשרstoneflies כדי לצרף מצע הרוק בבקבוק.
5. קצה רק אחד הצופה לצפות Stonefly אחד, כדי להבטיח ספירה מדויקת של התנהגות פוש-אפ, שהיא התנועה למעלה ולמטה הגוף הוצגה על ידי Stonefly.
6. הרוזן ולהקליט את מספר שכיבות סמיכה שנצפו במהלך תקופת תצפית 3 דקות.
7. המניפולציות לעשות כדי לשלב הבא ניסיוני DO וחזור 3 תקופת תצפית דקות עבור רמות הניסיוני הנוספות.
   שים לב: במסגרת תכנון הניסוי הזה, שלוש רמות DO שונות הוערכו.

5. ניתוח סטטיסטי

1. כדי לבצע שימוש בניתוח סטטיסטי המספר הממוצע של שכיבות סמיכה על פני ארבע stoneflies פני קבוצה למשפט DO נתון.
2. השתמש בתוכנת מחשוב סטטיסטי חינם R ¹² לבצע ניתוח שונות (ANOVA) על מספר שכיבות סמיכה ועל ריכוזי DO באמצעות הסדר של כל בדיקה ניסיונית (DO רמה) ואת הטמפרטורה כמו covariates. נתח DO כמו רמות דיסקרטיות של גורם יחיד.
3. השתמש מבחן נורמליות אנדרסון-דרלינג על שאריות לבדוק לנורמליות ^13.
4. בצע רגרסיה ליניארית על נתונים על ידי התוויית המספר הממוצע של שכיבות סמיכה כנגד ריכוזי DO.

תוצאות

ששת הניסויים של ההתקנה המתואר בוצעו על ידי 24 תלמידי שנה א סטודנטים לתואר ראשון במעבדה הגדרה ההוראה לכמת את מספר שכיבות סמיכה stoneflies לבצע בתגובה ריכוז DO שונים במים. המספר הממוצע של שכיבות סמיכה ביצע בתוך רמה DO ובתוך כל ניסוי היה ונקווה לתכנן שכיבות סמיכה נגד רמת DO באיור 2. ANOVA בוצע בתחילה ניצול ריכוז DO, בסדר רציף של ניסויים, טמפרטורה, וכן יחסי הגומלין בין כל המשתנים. מהתוצאות עולה כי רק לעשות ריכוז משמעותי השפיעו על...

דיון

צעדים קריטיים
הליך זה מספק דרך פשוטה ויעילה כדי לתפעל DO במעבדת הגדרה לבצע מחקרים התנהגותיים על אורגניזמים ימיים. מצאנו שם כדי להיות מספר צעדים / פריטים קריטיים להיות מודע בעת ביצוע הניסוי הזה קשור ישירות את התוצאות. זוטא, הוא קריטי כדי לשמור על הלחץ הקאמרי להימנע משינויי הלחץ החלקי של גזים מעל פני המים, ולאחר DO תנודות. בעקבות הצעדים המפורטים בסעיף "בדיקת יציבות של סביבת הניסוי" קטן של הפרוטוקול הוא קריטי. בדיקת החותם של פקק עם הבקבוק, הבטחת השקיעה מלאה של צינורו...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
בקבוק מסנן 2 ליטר	Pyrex	5340
פקק גומי בגודל 6	Sigma-Aldrich	Z164534
Nalgene 180 צינורות פלסטיק שקופים	Thermo Scienfitic	8001-1216
Whisper 60 משאבת אוויר	Tetra
צינורות קו אוויר גמישים סטנדרטיים	Penn Plax	ST25
0.25 אינץ' צינורות נחושת	Lowes Home Improvement	23050
דוקרני צינור זכר	Grainger	5LWH1
נקבה	מחבר Grainger	20YZ22
מד חמצן מומס כבד	Extech	407510
גז חנקן	מתסון TRIGAS
Radnor AF150-580 רגולטור	Airgas	RAD64003036