הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

Neonatal לב פיגומים: מטריצות Novel ללימודי הרגנרציה

7.4K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/54459

⸱

5 בנובמבר 2016

 ,  , 
1Lillehei Heart Institute, University of Minnesota

במאמר זה

סיכום

במחקרים אלה, אנו מספקים מתודולוגיה חדשנית, בילוד, פיגומי לב בעכברים לשימוש במחקרים רגנרטיבית.

תקציר

הטיפול הסופי היחיד לאי ספיקת לב בשלב הסופי הוא השתלת לב אורתוטופית. מדי שנה, ההערכה היא כי יש צורך ביותר מ-100,000 לבבות תורמים להליכי השתלת לב בארצות הברית1-2. בשל מספרם המוגבל של התורמים, רק כ-2,400 השתלות מבוצעות מדי שנה בארה"ב. גישות רבות, החל ממחקרי תרפיה תאית ועד השתלת מכשירי עזר מכניים, ננקטו, לבד או בשילוב, בניסיון לשדל את הלב לתקן את עצמו או לנוחאת הלב הכושל. למרות מאמצים אלה, מכשירי עזר לחדר עדיין משמשים בעיקר לצורך גישור להשתלה והתועלת של טיפולים תאיים, למרות שהם טומנים בחובם הבטחה מרפאת, עדיין מוגבלת לניסויים קליניים. בנוסף, נעשה ניסיון להשתלה ישירה אך ההצלחה הוגבלה עקב דחייה חיסונית. ברור שנדרשת אסטרטגיה אחרת כדי לייצר איברים נוספים להשתלה, ובאופן אידיאלי, איברים אלה יהיו אוטולוגיים כדי למנוע את הסיבוכים הקשורים לדחייה ודיכוי חיסוני לכל החיים. דה-סלולריזציה היא תהליך של הסרת תאים תושבים מרקמות כדי לחשוף את המטריצה החוץ-תאית המקורית (ECM) או הפיגום. דה-סלולריזציה של פרפוזיה מציעה שימור מלא של המבנה התלת מימדי של הרקמה, תוך השארת עיקר התכונות המכניות של הרקמה שלמות4. ניתן להשתמש בפיגומים אלה לאכלוס מחדש עם תאים בריאים כדי ליצור מודלים מחקריים ואולי איברים נחוצים מאוד להשתלה. חשפנו את הפיגומים מעכברים יילודים (P3), הידועים כבעלי יכולות התחדשות לב יוצאות דופן,5-8 לדה-סלולריזציה בתיווך חומרי ניקוי ואכלסנו מחדש את הפיגומים הללו בתאי לב של עכברים. מחקרים אלה תומכים בהיתכנות של הנדסת מבנה לב יילודים. הם גם מאפשרים לחקור האם ה-ECM של לבבות מוקדמים לאחר הלידה עשוי להכיל רמזים שיביאו לאסטרטגיות משופרות של התאה.

מבוא

אי ספיקת לב היא נפוצה וקטלנית. זוהי מחלה פרוגרסיבית כי תוצאות התכווצות ירד של הלב, אשר משבש את זרימת דם לאיברים ועוזב את הדרישות המטבוליות של הגוף מסופק. ההערכה היא כי 5.7 מיליון אמריקנים סובלים מאי ספיקת לב וזה הגורם העיקרי של אשפוז בארצות הברית 9. העלות הקולקטיבית של טיפול בחולים באי ספיקת לב בארצות הברית עולה על 300 $ מיליארדים דולרים בשנת 9-10. הטיפול סופי רק עבור אי ספיקת לב סופנית הוא השתלת לב orthotopic. בכל שנה, ההערכה היא כי יותר מ -100,000 לבבות תורמים נדרשים נהלים השתלה לב בארצות הברית 1-2. לאור המספרים של תורמים המוגבלים, רק כ -2,400 השתלות מבוצעות מדי שנה בארה"ב 2. ברור, מחסור האיבר הזה צריך להיות מטופל כמו אסטרטגיות אחרות נדרשות לייצר איברים נוספים transplantation, באופן אידיאלי, איברים אלה יהיו עצמיים כדי למנוע סיבוכים הקשורים דחיית דיכוי חיסוני בחיים.

Cardiomyocytes המבוגר יונק להפגין יכולת התחדשות מוגבלת על פגיעה, אך הראיות אחרונות עולה כי לבבות בילוד יונקים לשמור על יכולת התחדשות מדהימה בעקבות פציעת 5-8. באופן ספציפי, לאחר כריתה כירורגית חלקית, חלון משוב התגלה בין יום לידה ואחרי הלידה 7. זה תקופת משובי מאופיין בחוסר צלקת פיברוטית, היווצרות נאווסקולריזציה, שחרור גורמי angiogenic מן epicardium, ו cardiomyocyte התפשטות 5-8 , 11. חלון משוב זה זמן מספק את הפוטנציאל לשימוש בלב בילוד כמקור רומן של חומר לפיתוח לב bioartificial.

מטריקס ידוע לספק רמזים חשובים לקדם cardiomyocytהתפשטות וצמיחה דואר. הבדלים ברורים בזמינויות מולקולות מטריצות הילודים מבוגרים 12 ויכולנו לקדם התחדשות נחקרו 13. מטריצות מבוגרות decellularized שמשו מספר מחקרים לספק פיגום ECM עבור ואכלוס הסלולר והדור של לב bioartificial. בעוד שמחקרים אלה, ותגליות חדשות בטכנולוגיות תאי גזע, מתקדמים במהירות, מספר משוכות טרם נפגשו. לדוגמא, מגבלות בשימור מבנה יליד המטריצה, אינטגרציה הסלולר בקיר מטריקס, ואת היכולת לתמוך התפשטות וצמיחה כל להגביל את ההצלחה של גישה זו. בעוד תכונות התחדשות מעולות כבר ייחסו ללב בילוד, על ההיבטים המעשיים של שימוש ברקמות כגון מוגבל החיפושים שלה.

בהתבסס על יכולת ההתחדשות הפגינה הלב בילוד, פתחנו מטריצות רומן על ידי פיתוחטכניקה של decellularization ללב עכבר P3. לב P3 נבחר ללימודים אלה כפי שהוא בתוך החלון של התחדשות לב כמו בעבר נקבע 6 אבל הלב הוא גדול מספיק כדי קציר, decellularize ו recellularize. מטרת המחקר הנוכחי היא להוכיח את ההיתכנות של יצירת מטריצת מלב עכבר בילוד. המחקרים שלנו לספק ראיות על היתכנותו של decellularizing דקה, לב בילוד תוך שמירה על שלמות מבני חלבוניים של ECM. כמו כן, אנו מדגימים את היכולת recellularize ECM לב זה עם cardiomyocytes mCherry לבטא ואנחנו בחנו cardiomyocytes אלה עבור ביטוי של סמנים לבביים שונים הבאים recellularization. טכנולוגיה זו תאפשר בדיקה של עליונות של מטריצה ​​בילוד לפיתוח לב bioartificial.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

כל הניסויים העכבר בוצעו בהתאם לחוק צער בעלי-חיים בארה"ב אושרו על ידי ועדת טיפול בבעלי חיים מוסדיים השתמש באוניברסיטת מינסוטה.

1. שיטת בידוד לב עכבר

  1. להרדים עכבר בילוד ידי עריפת ראש עם להב ליחד.
  2. ספוגית החזה עם 70% אתנול.
  3. לנתח העור מהחזה על ידי חיתוך זה מקיר החזה במספריים רגילים תוך משייכת העור רוחבית עם זוג # 5 מלקחיים.
  4. לחורר את הבטן רק נחה עצם החזה עם המספריים על ידי חיתוך דרך דופן הבטן. לתפוס את תהליך xiphoid עם מלקחיים # 5, לחזור בו עצם החזה rostrally מהגוף תוך צמצום אף כי צלעות משני צדי החזה עם מספריים. כלוב הצלעות משתקף superiorly עם המלקחיים כדי לחשוף את הלב.
  5. בבוטות לנתח את שתי אונות הראשיות של התימוס ידי משייכת רוחבית עם # 5 מלקחיים, חשיפההקשת של אבי העורקים, כמו גם הוורידים caval ו ריאתי.
  6. Transect העורקים הגדולים מן קשת אבי העורקים, ואת אבי העורקים עצמה, עם מספריים באביב 10 ס"מ. שמור האאורטה בין הבסיס של הלב העורק brachiocephalic. אחוז הקצוות של כלי נקטע עם # 5 מלקחיים כדי לשקף את הלב קדימה, הפרידה בינו לבין קנה הנשימה והוושט.
  7. Transect בכלי הדם הריאתי וורידים מרכזיים אחרים, על ידי חיתוך בין הריאות והלב משני צידי הלב עם מספריים באביב 10 ס"מ. הוורידים פתוחים לספק ניקוז.
  8. הסר את הלב מן mediastinum עם # 5 מלקחיים, לתפוס את הקצוות הכרותים של הכלי המרכזי. מניחים את הלב בצלחת תרבות 60 מ"מ המכיל בופר פוספט סטרילית (PBS) עבור צנתור.

2. שיטה Decellularization ידי Langendorff זלוף

  1. הכן את הרכבת קטטר מראש. צייר סעיף 4 ס"משל PE 50 צינורות בלהבת אלכוהול קטנה כדי ליצור צנתר קטן, רזה. חתוך את הקצוות עם סכין כדי לענות על המידות (מקורב. 300 מיקרומטר OD קוטר חיצוני עם מקורבות של OD כ. 500 מיקרומטר) שמוצגות באיור 1. זה יספק שני צנתרים סימטריים מכל צד של המשיכה.
  2. כוון את הקצוות של הצינור לתוך הלהבה בקצרה, כדי להמס מקורב על הפתיחה בסוף הדק.
  3. מלאו את המזרק 12 מ"ל עם PBS ולהרכיב את הקטטר על ידי הצבת שסתום 3 כיווני על המזרק. הוספת 22 G x 1 מחט הברזלים ולהוביל את המחט דרך מחץ. החלק את הקטטר צינורות PE נמשך על המחט (איור. 1).
  4. להשקות את החלקים שהותקנו עם PBS, והבטיח כי כל בועות האוויר הוסרו.
  5. הכנס את קטטר, הכינו כפי שתואר לעיל, לתוך אבי העורקים של הלב מבודד, לא הארכת בעבר שסתום אבי העורקים ולקשור עם עניבה אחת 7-0 תפר. לנוח המקורב של tהוא קטטר proximally נגד עניבה, מה שהופך חותם חזק ומניעת בלב מלבוא את הקטטר.
  6. שים לב הצנתור בהגדלה, בעוד בעדינות מרוססת בלב באמצעות המזרק המכיל PBS. ודא שאין נזילות במערכת ואת רקמת מחוויר הומוגנית כמו מוסר דם סמוי.
  7. מניח את מחץ לתוך הצוואר של מתאם הכניסה ולאטום אותו על ידי קיפול הצדדים על פני הזכוכית.
  8. חברו את המיכל מלא 60 מ"ל של סולפט dodecyl נתרן 1% (SDS) במים מזוקקים (DH 2 O) באמצעות קו של אורך מספיק כדי לייצר טור שיוצר 20 מ"מ כספית בלחץ כפי שמוצג באיור. 1. חשב את הלחץ מן גובה העמודה נוזלי מבוסס על מערכת יחסים של 1 מ"מ כספית שווה 1.3595 ס"מ H 2 O.
    זהירות: SDS היא אבקה צמרית מאוד עם תכונות מגרה. לתקשר יש להימנע. טפול האבקה באמצעות ביגוד מגן מתאים.
  9. Perfuse הלב עם 1 SDS% במשך 14 שעות. הלב יהיה שקוף במראה ללא רקמה נותרת נצפית.
  10. לרוקן את המערכת עד ברזלים של הפתרון SDS הנותרים ולהחליפו 10 מ"ל DH 2 O. Perfuse הלב עם 10 מ"ל 1% Triton X-100 (מדולל במים מזוקקים), ואחריו 10 מ"ל DH 2 O, ואחריו 60 מ"ל PBS המכיל סטרפטומיצין פניצילין 1x (עט סטרפטוקוקוס).
  11. אחסן את הלב ב- PBS עם 1x עט סטרפטוקוקוס על 4 מעלות צלזיוס. אם יישום פוסט decellularization המיועד דורש זלוף אז את הקטטר באב העורקים צריך להישמר, אחרת לחתוך את הקשר תפר ולהסיר את הקטטר.

קביעת DNA 3.

  1. הכן תקציר של הלב ECM או שליטה decellularized באמצעות 200 מיקרוגרם / מ"ל proteinase K ב 50 מ"מ KCl, 2.5 מ"מ MgCl 2, 0.45% Tween 20 ב 10 מ"מ טריס (pH 8.3).
  2. דגירת הרקמה ב 55 ° C עם תסיסה עד להמסת הרקמה,בדרך כלל 4-5 שעות.
  3. לכמת את התוכן DNA של homogenate עם DNA מחייב assay 4,11.

קיבוע 4. חתך של רקמות

  1. תקן decellularized, recellularized או P3 מלא לבבות paraformaldehyde 4% ב PBS במשך 30 דקות בטמפרטורת חדר.
  2. שטפו את הרקמה PBS 3x.
  3. הנח את הרקמה בתמיסה של סוכרוז 7.5% חיץ פוספט 0.1 M ב 4 ° C. עד שהיא שוקעת.
  4. שינוי הפתרון סוכרוז 15% חיץ פוספט 0.1 M ב 4 ° C, שוב, עד שהיא שוקעת.
  5. מומלץ לחמם את רקמות על 37 מעלות צלזיוס, להחליף מחצית מהמחזור עם פתרון ג'לטין ב סוכרוז 15% & חיץ פוספט 0.1 M לאזן בין לילה. ריכוזים של ג'לטין גדלו בשלבי דרך 1%, 2.5%, 5% ולבסוף 7.5% פעמים.
  6. מניחים את דגימות cryomolds באמצעות ג'לטין 7.5% טרי. כדי לשחזר את הצורה של דגימות decellularized, ג'לטין נוזלי ניתן perfused לתאי כמו tהוא לבבות ומעוצבים. להקפיא ידי הצפת cryomolds על חנקן נוזלי. חנות ב -80 מעלות צלזיוס.
  7. חותכים (10 מיקרומטר עבה) קטעים עם cryostat. תביא את השקופית הקרובה לפני שטח הסעיף ולבחון את הסעיף ומתרחק מן הסכין על פני השטח בשל התשלום בשקופיות המטופלים אלקטרוסטטי. לייבש את השקופיות לילה ולאחסן ב -80 ° C לצורך ניתוח עתידי.
  8. הסר את השקופיות מהמקפיא, לאזן לטמפרטורת החדר ואז ומניחים בצנצנת Coplin המכיל PBS במשך 20 דקות ב 37 מעלות צלזיוס כדי לפזר את הג'לטין.
  9. הכתם בסעיפים לחתוך משלב 4.7 עם Hematoxylin ו Eosin. מקום שקופית בתוך צנצנת Coplin. לחשוף את השקופיות hydrated בשלב 4.8 כדי Hematoxylin במשך 45 שניות, מי ברז עבור 1.5 דקות, חיץ במשך 3 דקות, מי ברז דקות 1, bluing סוכן עבור 1.5 דקות, 80% אתנול דקות 1, אלכוהוליים Eosin Y עבור 8 שניות, 80% אתנול דקות 1, 100% אתנול עבור 1 2x דקות, ניקוי סוכן (תחליף קסילן) עבור 1 3x דקות, coverslip עם שרףהרכבה בינונית מבוסס. בדוק את השקופיות מיקרוסקופיות.
  10. כדי לאשר את השמירה של תגובתיות חלבון ECM של ECM הלב, כתם במשך חלבונים מבניים ECM כגון קולגן IV על ידי הצבת את השקופיות hydrated בתא humidified ולטפל עם 10% בסרום חמור נורמלי (NDS) ב בופר פוספט עם 0.1% Triton -X100 (PBST) במשך שעה 1 בטמפרטורת החדר (RT). השתמש נפח מספיק כדי לכסות את סעיפי רקמות.
  11. החלף את הפתרון עם הנוגדן הראשוני מועדף דילול לקבוע באופן אמפירי ב 5% NDS / PBST. לדוגמא, נוגדן קולגן IV היה מדולל ב 1: 150. דגירת הלילה ב 4 מעלות צלזיוס.
  12. שטפו את השקופיות עם PBST 3x ולהחיל נוגדנים משני הבחירה מצומדות עם פלורסנט לצבוע. לדלל את הנוגדן בסכום לקבוע באופן אמפירי. דגירה במשך שעה 1 ב RT. לשטוף עם PBS 3x.
  13. כתם השקופיות עם צבע DNA מחייב כגון DAPI לאמת בהיעדר גרעיני תאים באמצעות mounti המכיל DAPIng בינוני כאשר הכיסוי מחליק את השקופיות.
  14. בדוק את השקופיות באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי ב 50 עד 400X.

5. P1 ילודים Murine חדרית cardiomyocytes עבור Recellularization

  1. ריסוס כל גור עם 70% אתנול ו לערוף עם להב לייחד.
  2. חזק כל גור בין האגודל והאצבע תוך בית החזה מחולק על קו האמצע עם מספרי סטרילי קטנים כדי לחשוף את חלל בית החזה. החל הלחץ על מנת לאפשר את הלב כדי לבלוט בחופשיות מהחזה בזמן שהוא נחתך חינם של כלי מרכזי הפרוזדורים לעזוב את רקמת חדרית בלבד.
  3. מניחים כל הלב ישירות לתוך צינור 50 מ"ל המכיל 20 מ"ל סידן קר כקרח, תמיסת מלח שנאגרו של האנק חינם ביקרבונט עם 20 מ"מ 4- (2-hydroxyethyl) חומצה -1-piperazineethanesulfonic (CBFHH) עד כל הלבבות נאספים.
  4. לשאוב CBFHH ולהוסיף 10-15 מ"ל של CBFHH טריים (קרים כקרח) אל הצינור. שטפו את הרקמה על ידי מתערבל את הרקמה tהוא הצינור מספר פעמים.
  5. למזוג את הפתרון המכיל את הלבבות לתוך צלחת פטרי פלסטיק 60 מ"מ.
  6. לנתח כל רקמה סמויה פרוזדורים מלבם בהגדלה על קרח ידי זמירה אותו הרחק הלבבות עם מספרי האביב. לרכך את החדרים לחתיכות קטנות בגודל homogenously. הסר את כל רקמה שאינה חדרית מופרדת מהצלחת עם מלקחיים 5 #.
  7. Pipet כמה שיותר הפתרון CBFHH כפי שנדרש להעביר את שברי רקמה לתוך בקבוקון סטרילית קטן המכיל בר ומערבבים מיקרו סטרילי.
  8. לאפשר לרקמות משקעות לתחתית של הבקבוקון ולהסיר פתרון CBFHH.
  9. מאפרים 50 מ"ל של פתרון אנזים 1.75 מ"ג / מ"ל ​​טריפסין, 20 מיקרוגרם / מ"ל ​​DNase השנייה CBFHH. Pipet 5 מ"ל של תמיסת אנזים זה ולהוסיף אותו צינור המכיל רקמות חדרית טחון ומניחים על בוחש מגנטי. מערבבים בקצב קבוע (340 סל"ד) בטמפרטורת החדר למשך 8 דקות.
    הערה: פעולת הערבוב צריכה להיות עדינה ובכל זאת לאפשרהשעייתו של תרחיף.
  10. הסר את הבקבוקון מהצלחת והמערבבים ולאפשר את התערובת הדלילה עד המשקעים במשך 3 דקות. Pipet וזורק supernatant לעכל ראשוני, כפי שהוא בעיקר מכיל תאי דם ופסולת רקמות.
  11. Pipet aliquot 5 מיליליטר השנייה של פתרון האנזים ולהוסיף אותו החדר לעכל. מערבבים במשך 8 דקות ולאפשר לו משקעים במשך 3 דקות אחר. לפני תחילת מעכל, להכין שני צינורות 50 מ"ל (המסומנת 1 ו -2) שכל אחת מהן מכילה 12 מ"ל קר כקרח עוברי בסרום שור (FBS). מניחים מסננת תא 40 מיקרומטר גבי צינור אחד. Pipet supernatant זו דרך המסנן על צינור 1.
  12. חזור על תהליך העיכול פעמים 8 נוספים, לסירוגין המיקום של supernatant לעכל בין שני צינורות המכילים FBS. פיצול supernatant האחרון שווה בשווה בין צינורות 1 ו -2 כדי להבטיח כמויות שווות בצינור אחד.
    הערה: כל צינור איסוף יכיל חברה 32.5 מיליליטר נפח כולל של השעית תא.
  13. בצנטריפוגה צינורות המכיליםing את XG supernatant 150 עבור 6 דקות ב 4 ° C.
  14. בעוד איסוף aliquots העיכול, להכין חמש צלחות תרבות 100 מ"מ רקמת עם 6 מ"ל של התקשורת (מדיה של הנשר שונה של Dulbecco (DMEM) עם 10% FBS, 1x עט סטרפטוקוקוס, 1x L- גלוטמין) לכל צלחת. דגירה aliquots אלה על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 למשך 30 דקות כדי לאזן את התקשורת.
  15. לשאוב את התערובת אנזים CBFHH ו resuspend התאים לתוך 30 מ"ל של התקשורת בתרבות מוכן לעיל, שילוב תאים משני צינורות איסוף.
  16. חזור 6 מ"ל של תרחיף תאים לכל אחד צלחות 100 מ"מ ו דגירה במשך 45 דקות ב 37 מעלות צלזיוס.
  17. בסוף הדגירה, העברת תאים שאינם חסידים עד 5 מנות חדשות מחדש דגירה של 45 דק '(השבר פיברובלסטים יהיה החל לדבוק את הכלים ניתן לגדל בנפרד אם רוצה).
  18. בסוף הסיבוב השני של ציפוי מראש, לאסוף את המדיה ותאי לא חסיד מן המנות ספין לתקשורת ב 150XG במשך 6 דקות.
  19. צייר את תקשורת עודפת להביא את התאים לריכוז הרצוי המשוער, (4.0 x 10 5 תאים לכל לבנות ב 100 μl של perfusate). הסרת aliquot לבדיקת ספירה או כדאיות 14.

6. Bioreactor Recellularization של מטריקס הלב P3

  1. Pretreat מטריצת הלב המבודד עם תקשורת והתרבות (ראה שלב 5.15) לילה לפני הוספת התאים.
  2. הרכיבו את האלמנטים של מערכת Langendorff כפי שמוצג באיור. 2. החיטוי חלק זכוכית אתילן אוקסיד לעקר את חלקי הפלסטיק כדי להבטיח סטריליות. יחידות משנה שונות של המערכת ניתן להרכיב במנדף זרימה למינרית לפני רכוב על דוכן תמיכה. באמבט מים במחזור ואת נתיב זרימת מים מחומם הושמט לבהירות.
  3. מלא את המערכת המורכבת עם 120 מיליליטר של תקשורת בתרבות רקמות (ראה שלב 5.15).
  4. מניח את מטריצת לב צינתור משלב 2.14 של מועצה עירונית 60 מ"מימצלחת ture בהגדלה ולהתחבר מזרק 1 מ"ל עם 22 G x 1 מחט עמוסה ההשעיה תא משלב 5.20 על קטטר. ודא כי הקהל הזה הוא ללא בועות אוויר כדי למנוע embolizing בלב.
  5. בעדינות perfuse 100 μl של השעית תא לתוך מטריצת הלב דרך העורקים הכליליים. לכשיושלם, לנתק את שילוב מזרק / מחט.
    הערה: זלוף איטי של כ. 20 μl לדקה נדרש כדי למנוע את התאים מלצאת הוורידים, העוברים בלב.
  6. עם בדל 22g בוטה מאובטח ההולם Luer על החלק התחתון של מכסה צנצנת לב bioreactor, לדחוף את הקטטר אל הבדל.
  7. הפעל את משאבת peristaltic ולבחון כי תמורת הזרימה כמתואר באיור 2. תמורת זרימה מהמאגר באמצעות המשאבה דרך מלכודת הבועה הקטטר להציב האאורטה בשלב 2.5 (השביל אדום באיור. 2). שים את זרימת מחזור הדם של הלב מתוך הוורידs ו טפטוף מן הקודקוד, הסירקולציה המחודשת למאגר התקשורת.
    הערה: קצב זרימת זלוף תלוי בגורמים בודדים כגון התנגדות כלי הדם של המבנה, ואת גודל הלב, אבל בקצב של 50 עד 100 μl / min הוא נקודת התחלה טובה. בנקודות זמן ביניים, ניתן לבצע הערכות תפקודיות. סולם גודל הלב בילוד recellularized מגביל את ההערכות, כי ניתן לבצע אך שקבענו מערכות מבוססות אופטי יכולות לשמש כדי לכמת להכות התנהגות בדיוק כפי שהם שמשו לבבות עכברוש מבוגרים. 4 הבונה ניתן perfused מורחבת תקופות של זמן (עד 23 שעות).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

decellularization
בממוצע, זמן decellularization של לב P3 באמצעות פרוטוקול זה הוא כ 14 שעות. מקבלת משקל לב ממוצע של 23 מ"ג עבור ילוד P3.

Acellularity
איור 3 א מדגימים לב בילוד P3 במלואו ללא פגם (הר שלם). איור 3B מראה את אותו בלב הבא decellularization. איורי 4 א ו -4<...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

התלות של טכניקה זו על perfusions החוזרת והנשנית של הלב הופכת את ההימנעות של תסחיף מרכיב קריטי של תוצאה מוצלחת. מתוך הצנתור הראשוני של לב שלבי 2.2-2.6, לשינויים של פתרון בין שלבי 2.8-2.14, יש מניפולציות שיכולים לאפשר כניסתה של בועות אוויר אשר פשר זרימת perfusate לתוך שריר הלב. בשל גודלו הזעיר של הלב בילוד, אפילו בועות דקות בכלי הדם יכולות לגרום אוטם טכני, ובכך הופך decellularization שלם. בנוסף, בשלבים לשטוף אחר כך, זלוף שלם יכול לגרום שאריות דטרגנט כי משפיע לרעה התאמה ביולוגית. יתר...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

למחברים אין מה לחשוף.

תודות

המחברים מודים לגב' סינתיה דקאי על הכנת האיורים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
<חזק>1. חומרים לבידוד לב עכבר
עכברים חזקים>P1 (כפי שמוצג; ב6; D2-Tg (Myh6 * -mCherry) 2Mik / J)מעבדות ג'קסון21577או שווה ערך
60 מ"מ צלחת תרביתBD Falcon353004או שווה ערך
פוספט חוצץ מלח pH 7.4 (סטרילי)HycloneSH30256.01או שווה ערך
להב חד פעמיסטנלי28-510או שווה ערך
מספריים סטנדרטייםמוריה בון (כלי מדע עדין)14381-43או שווה ערך
מספריים קפיציים 10 ס"מFine ScienceTools 15024-10או שווה ערך
Vannas Spring Scissors - 3 מ"מ Cutting EdgeFine Science Tools15000-00או שווה ערך
#5 מלקחייםDumnot (Fine Science Tools)11295-00או שווה ערך
2. חומרים למתאם דה>-סלולריזציה
ChemglassCG-1013מחיצה ניתנת לחיטוי
Chemglass CG-3022-99ניתנת לחיטוי
1/8 אינץ'. ID x 3/8 OD C-Flex צינורותCole-ParmerEW-06422-10ניתן לחיטוי
זכר לואר ל-1/8 אינץ' מתאם דוקרני צינורMcMaster-Carr51525K33ניתן לחיטוי
מתאם דוקרני צינור נקבה ל-1/8 אינץ'McMaster-Carr51525K26ניתן לחיטוי
פרולן 7-0 תפר כירורגי Ethicon8648Gאו מעמד
טבעתFisher ScientificS47807או שווה ערך
ClampFisher Scientific05-769-6Qאו שווה ערך
מחזיק רגיל ClampFisher Scientific05-754Qאו שווה ערך
לחבית מזרק 60 סמ"ק Coviden1186000777Tאו שווה ערך
BeakerKimble14000250או שווה ערך
22 G x 1 מחט מזרקBD305155 או שווה ערך
12 סמ"קCoviden8881512878או שווה ערך
לזין עצירה תלת כיווניSmith MedicalMX5311Lאו שווה ערך
PE50 צינורותBD קליי אדמס אינטרמדיק427411חייב להיות ניתן לעיצוב על ידי חום. מומלץ פוליאתילן.
1% SDSInvitrogen15525-017מומלץ בדרגת Ultrapure . הכינו תמיסה טרייה וסננו לעקר לפני השימוש.
1% טריטון X-100 Sigma-AldrichT8787איפור תמיסה טרייה ממלאי של 10% ועיקור מסנן לפני השימוש. 
סטריליים dH2OHycloneSH30538.02או מערכת MilliQ.
1x עט/סטרפטוקוקוסCorning CellGro30-001-Clאו שווה ערך
 
<חזק>3. חומרים לכימות DNA
פרוטאינאז KFisherBP1700>30 U/mg
פעילות KClSigma-AldrichP9333או שווה ערך
MgCl2· 6H2OMallinckrodt5958-04או שווה ערך
Tween 20 Sigma-AldrichP1379או שווה ערך
Tris base/hydrochlorideSigma-AldrichT1503/T5941או
ערכת בדיקת Pico-Green dsDNALife Technologies P7589דורש פלואורמטר לקרוא
<חזק>4. שיטה לקיבוע וחתך של רקמה
פרפורמלדהידSigma-AldrichP6148או
ג'לטין שווה ערך מסוג A מעור חזירSigma-AldrichG2500חייב להיות 300 פריחה ומעלה
5. שיטה להיסטולוגיה של רקמות
Cryomolds 10 x 10 x 5 מ"מTissue-Tek4565או שווה ערך
CryostatHacker/BrightModel OTFאו שווה ערך
שקופיות מיקרוסקופ  25 x 75 x 1 מ"מFisher Scientific12-550-19או שווה ערך
Hematoxylin 560 Surgipath/Leica Selectech 3801570או שווה ערך
אתנולDecon Laboratories2701או שווה ערך
DefineSurgipath/Leica Selectech מאגר כחול 3803590או שווה ערך
 Surgipath/Leica Selectech 3802915או שווה ערך
אלכוהולי Eosin Y 515 Surgipath/Leica Selectech תחליף 3801615או שווה ערך
לפורמולה 83 קסילן CBG ביוטק CH0104Bאו שווה ערך
מדיום הרכבה Permount פישר כימיקלים SP15-500או שווה ערך
נוגדן קולגן IVרוקלנד600-401-106.1או שווה ערך
אלפא;-נוגדן אקטיניןAbcamAB9465או שווה ערך
mCherry AntibodyAbcamAB205402או שווה ערך
NKX2.5 נוגדןSanta Cruz BiotechnologySC-8697או שווה ערך
חמור נגד עכבר AF488 נוגדןLife TechnologyA21202או שווה ערך
חמור נגד עוף AF594 נוגדןJackson Immunoresearch703-585-155 או שווה ערך
חמור נגד עזים CY5 נוגדןJackson Immunoresearch 705-175-147או שווה ערך
Fab Fragment Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) AF594Jackson Immunoresearch111-587-003או שווה ערך
Prolong Gold Antifade Mountant עם DAPIThermoFisherP36930או שווה ערך
6. בידוד של קרדיומיוציטים חדריים בילודים באמצעות ציפוי מקדים
HBSS (Ca, Mg Free)HycloneSH30031.02או שווה ערך
HEPES (1 M)Corning CellGro25-060-Clאו
מסננת תאיםBD Falcon352340או שווה
ערך 50 מ"ל שפופרתBD Falcon352070או שווה ערך
Primeria 100 מ"מ צלחותCorning353803Primeria משפר את ההתקשרות הפיברובלסטים ומקדם טוהר מיוציטים גבוה יותר
TrypsinDifco215240או שווה ערך
DNase IISigma-AldrichD8764או שווה ערך
DMEM (המדיה החיונית המינימלית של Delbecco)HycloneSH30022.01או שווה ערך
ויטמין B12 Sigma-AldrichV6629או צלחות מצופות
פיברונקטין שוות ערך BD Bioscience354501או סרום
בקר עוברי שווה ערך HycloneSH30910.03או שווה ערך
זכוכית ביו-ריאקטור לבRadnoti Glass Technology120101BEZחייב להיות ניתן לעיקור על ידי חיטוי או גז.
שווה ערך מים מטוהרים שווה ערך & שווה ערך משטח כלי

מקורות

  1. Yusen, R. D., et al. Registry of the International Society for Heart and Lung Transplantation: Thirty-second official adult lung and heart-lung transplantation report--2015. J Heart Lung Transplant. 34 (10), 1264-1277 (2015).
  2. Go, A. S., et al. Heart disease and stroke statistics--2014 update: A report from the american heart association. Circulation. 129 (3), e28-e292 (2014).
  3. Kapelios, C. J., Nanas, J. N., Malliaras, K. Allogeneic cardiosphere-derived cells for myocardial regeneration: current progress and recent results. Future Cardiol. 12 (1), 87-100 (2016).
  4. Ott, H. C., et al. Perfusion decellularized matrix: Using nature's platform to engineer a bioartificial heart. Nat Med. 14 (2), 213-221 (2008).
  5. Porrello, E. R., Olson, E. O. A neonatal blueprint for cardiac regeneration. Stem Cell Research. 13 (3 Pt B), 556-570 (2014).
  6. Porrello, E. R., et al. Transient regenerative potential of the neonatal mouse heart. Science. 331 (6020), 1078-1080 (2011).
  7. Polizzotti, B. D., et al. Neuregulin stimulation of cardiomyocyte regeneration in mice and human myocardium reveals a therapeutic window. Sci Transl Med. 7 (281), 281ra45(2015).
  8. Jesty, S. A., et al. c-kit+ precursors support postinfarction myogenesis in the neonatal, but not adult, heart. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (33), 13380-13385 (2012).
  9. Ambrosy, A. P., et al. The Global Health and Economic Burden of Hospitalizations for Heart Failure: Lessons Learned From Hospitalized Heart Failure Registries. J Am Coll Cardiol. 63 (12), 1123-1133 (2014).
  10. Roger, V. L., et al. Executive Summary: Heart Disease and Stroke Statistics-2012 Update A Report From the American Heart Association. Circulation. 125 (22), 188-197 (2012).
  11. Kennedy-Lydon, T., Rosenthal, N. Cardiac regeneration: epicardial mediated repair. Proc R Soc B. 282 (1821), 2147-2172 (2015).
  12. Williams, C., Sullivan, K., Black, L. D. Partially Digested Adult Cardiac Extracellular Matrix Promotes Cardiomyocyte Proliferation In Vitro. Adv Healthcare Mat. 4 (10), 1545-1554 (2015).
  13. Borg, T. K., et al. Recognition of extracellular matrix components by neonatal and adult cardiac myocytes. Dev Biol. 104 (1), 86-96 (1984).
  14. Strober, W. Trypan blue exclusion test of cell viability. Curr Protoc Immnol. 111, A3-B1-3 (2015).
  15. Gilbert, T. W., Freund, J. M., Badylak, S. F. Quantification of DNA in biologic scaffold materials. J Surg Res. 152 (1), 135-139 (2009).
  16. Akhyari, P., et al. The quest for an optimized protocol for whole-heart decellularization: a comparison of three popular and a novel decellularization technique and their diverse effects on crucial extracellular matrix qualities. Tissue Eng Part C Methods. 17 (9), 915-926 (2011).
  17. Lu, T. Y., et al. Repopulation of decellularized mouse heart with human induced pluripotent stem cell-derived cardiovascular progenitor cells. Nat Commun. 4 (2307), 1-11 (2013).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

SDSPeupopulate
Neonatal לב פיגומים: מטריצות Novel ללימודי הרגנרציה
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.