מאמר שיטה

"Assay סגירת Phagosome" לדמיין גיבוש Phagosome בשלושה ממדים באמצעות סך פנימית השתקפות מיקרוסקופ פלואורסצנטי (TIRFM)

6.1K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/54470

⸱

26 באוגוסט 2016

 ,  ,  , 
1Inserm U1016, Institut Cochin, CNRS UMR 8104, Université Paris Descartes, Sorbonne Paris Cité

במאמר זה

סיכום

אנו מתארים מערך ניסיוני להמחשה עם היווצרות וסגירה חסרת תקדים של פגוזומים ברזולוציה גבוהה בתלת מימד במקרופאגים חיים, באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי של השתקפות פנימית כוללת. הוא מאפשר ניטור של בסיס הכוס הפגוציטית, הפסאודופודים המתרחבים, כמו גם המיקום המדויק של החתך הפגוזומי.

תקציר

פגוציטוזיס הוא מנגנון המשמש תאים מתמחים להפנמה ולסילוק מיקרואורגניזמים או פסולת תאית. הוא מסתמך על סידורים מחדש עמוקים של השלד הציטולוגי של האקטין שהוא הכוח המניע להרחבת קרום הפלזמה סביב החלקיק. בנוסף, בליעה יעילה של חומר גדול מסתמכת על אקסוציטוזיס מוקדי של תאים תוך-תאיים. תהליך זה הוא דינמי ביותר ותוארו שחקנים מולקולריים רבים כבעלי תפקיד במהלך היווצרות פגוציטית. עם זאת, הוויסות המדויק בזמן ובמרחב של כל המולקולות הללו נותר חמקמק. בנוסף, השלב האחרון של סגירת הפגוזום היה קשה מאוד לצפייה מכיוון שעיכוב על ידי הפרעות RNA או מוטציות שליליות דומיננטיות מביא לעתים קרובות להיווצרות פגוציטית עצירה.

הקמנו גישה ניסויית ייעודית המשתמשת במיקרוסקופ פלואורסצנטי של השתקפות פנימית כוללת (TIRFM) בשילוב עם אפיפלואורסצנציה כדי לנטר צעד אחר צעד את התפשטות הפסאודופודים וקצותיהם בפגוזום הגדל סביב חלקיק הקשור באופן רופף לכיסוי. שיטה זו מאפשרת לנו להתבונן, ברזולוציה גבוהה, בקצות הפסאודופודים ובהיתוך שלהם במהלך סגירת הפגוזום בתאים חיים עבור שני חלבונים שונים המתויגים פלואורסצנטית בו זמנית.

מבוא

Phagocytosis היא פונקצית תאים עיקרית שמתחילה עם ההכרה ומחייבת של חומר על פני שטח קולטנים, אשר לאחר מכן מוביל ההפנמה השפל של חומר הבליעה. בעוד אאוקריוטים חד תאיים כגון discoideum Dictyostelium עובש אמבות להשתמש phagocytosis האכלה על חיידקים, יצורים עילאיים התפתחו עם תאים מקצועיים. המקרופאגים או תאים דנדריטים הם קו ההגנה הראשון נגד פתוגנים שונים רקמות ואיברים, והם חיוניים להפעיל את המערכת החיסונית אדפטיבית דרך הייצור מצגת אנטיגן ציטוקינים 1-4. בנסיבות מסוימות phagocytosis יכולה להתבצע על ידי תאי phagocytic הלא מקצועיים, למשל, אנדותל ותאי אפיתל. תהליך זה חשוב לשמור על הומאוסטזיס במהלך פיתוח בבגרות עבור מחזור שיפוץ רקמות בריאות. לבסוף, פגוציטים מיוחדים כגון תאי Sertoli ב testis או ברשתיתתאי אפיתל הפיגמנט הם פגוציטים חזקים מאוד 5.

היווצרות של phagosome שבו השפלה של מיקרואורגניזמים או פסולת הסלולר מתרחשת מתחיל עם אשכולות של קולטנים phagocytic על פני השטח של התא phagocytic. אירועים Downstream איתות הבאים אשכולות של קולטנים opsonic כגון קולטנים Fc (FCR) או קולטני משלימים (CRS) כבר מאופיין היטב. עם זאת, ישנם גם רבים קולטנים שאינם opsonic כולל קולטנים דמוי אגרה (TLRs), לקטינים, קולטנים מנוז ואת הקולטנים נבלות. קולטנים אלה מכירים הקובעים על פני החלקיקים כגון שאריות מנוז או פוקוז, phosphatidylserine, ו lipopolysaccharides 1,6-9.

פתוגן או תא פסול הכרה כרוכה קשירה באשכולות של כמה סוגים של קולטן phagocytic, אשר לאחר מכן להוביל שיפוץ יקטין אינטנסיבי וחולף. בשנת exocytosis במקביל, המוקד של תאיים תאייםts תורמת לשחרור מתח הממברנה חשוב phagocytosis יעיל של חלקיקים גדולים. אירועי האיתות המובילים דפורמציה פילמור הקרום תקטין נותחו במודלים ניסיוניים שהפעילו קולטן phagocytic יחיד. במהלך phagocytosis FCR בתיווך, יש פילמור אקטין אינטנסיבי כי מוסדרת GTPases קטן (RAC, Cdc42). בין effectors הזרם שלהם, חלבון התסמונת ויסקוט-אולדריץ '(WASP) מוביל ההפעלה של החלבון-קשור יקטין 2/3 מורכבים (Arp2 / 3) כי nucleates סיבי יקטין 1,2,4,10. הייצור המקומי של phosphatidylinositol-4, 5-bisphosphate (PI (4,5) P 2) הוא חיוני עבור פילמור אקטין הראשוני שמניע היווצרות מדומות. המרה PI (3,4,5) P 3 נדרשה להארכת מדומות ו phagosome סגר 11. מסלולים כמה לתרום היעלמות PI (4,5) P 2. ניתוק הראשי של קינת פוספט phosphatidylinositolSES (PIPKIs) מן PI מעצרים phagosome (4,5) P 2 סינתזה. שנית, זה יכול להיות פוספורילציה ויאכל על פי מעמד ואני PI3K קינאזות (PI3K) והמיר ב PI (3,4,5) P 3 12. תפקיד phosphatases ו phospholipases גם כבר גלום במסחר PI (4,5) הידרוליזה P 2 והסרת F- יקטין במהלך phagocytosis בתאי יונקים וב Dictyostelium 13,14. ה- C פוספוליפאז (PLC) δ hydrolyzes PI (4,5) P 2 לתוך diacylglycerol ופוספט טריס 1,4,5--אינוזיטול. לצרכן (4,5) P 2 ו PI (3,4,5) OCRL phosphatase P 3 (תסמונת oculocerebrorenal של Lowe) גם היה מעורב היווצרות phagosome. היווצרות מקומית מדויקת של F-תקטין depolymerization החברה מוסדרת היטב במרחב ובזמן ואנחנו הראינו גיוס של תאים תאיים חשוב לספק מקומי phosphatase OCRL, ובכך לתרום depolymerization יקטין המקומי בבסיס כוס phagocytic 13,15. לשם כך, השתמשנו הגדרת הניסוי המתוארת כאן.

שחקני המנגנון ומולקולריים הנדרשים לסגירת phagosome ו scission הקרום להישאר מוגדרים היטב בגלל קשיי הדמית ניטור באתר של סגירת phagosome. עד לאחרונה, phagocytosis נצפתה על תאים קבוע או לחיות להפנים חלקיקים על פני הגב שלהם או על צדם, מה שהופך את ויזואליזציה בזמן של האתר של סגירת phagosome קשה. בנוסף, שיטות קיבוע יכולות לגרום הכחשה של ממברנות להטות את התוצאות על רחבת pseudopodia וסגירה. לעומת זאת, assay כי הקמנו ולתאר כאן מאפשר לנו לדמיין רחבה מדומות וצעד סגירת phagocytosis בתאים חיים 13, המבוסס על מיקרוסקופיה החזרה הגמורה (TIRFM) 16. טכניקה אופטית זו משתמשת גל חולף לרגש fluorophores באזור דק על הממשק בין שקוף כךהמכסה (coverslip) ו- (תרבית תאים בינוניים) נוזלי. העובי של עומק העירור הוא סביב 100 ננומטר מן המשטח המוצק, המאפשר הדמיה של אירועים מולקולריים קרובים קרום הפלזמה. TIRFM מאפשר יחס אות רקע גבוה, ומגביל את הקרינה מחוץ פוקוס שנאספו ואת cytotoxicity בשל התאורה של תאים.

ניצול של TIRFM, פיתחנו את "assay סגירת phagosome" שבה coverslips מופעלים עם ליזין פולי ומצופה אז עם כדוריות דם אדומות-opsonized IgG (IgG-SRBCs). המקרופאגים להביע חלבונים מתויגים fluorescently הזמני של עניין מותרים אז לבלוע את IgG-SRBCs. בעוד תאים לנתק את חלקיקי היעד המאוגדים הלא קוולנטית אל משטח זכוכית, קצות pseudopods ניתן להבחין והקליט במצב TIRF. רכישות TIRF משולבים עם רכישות במצב epifluorescence, לאחר העברת מיקרומטר בשלב 3 לעיל, המאפשר מולualization של בסיס ספל phagocytic. תוספת של תרופות תרופתיות כגון אלה עיכוב תקטין או dynamin במהלך התהליך אפשרית גם לנתח עוד את התהליך ברמה המולקולרית.

הפרוטוקול המתואר בפירוט כאן הוא עבור קו תא מקרופאג murine RAW264.7 וחלקיקי opsonized, אבל כמעט, זה יכול להיות מותאם לכל תא phagocytic אחר ועם מטרות אחרות כגון חרוזים. שיטה זו תאפשר אפיון טוב יותר של הרגולציה בזמן ובמרחב של השחקנים המולקולריים המעורבים רחבים מדומות וסגירת phagosome במהלך תהליכי phagocytic שונים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

הערה: פלסמיד המשמש Lifeact-mCherry הוא מתנה סוג של ד"ר גיום Montagnac, Institut קירי, פריז, שנוצר לאחר 17.

1. תאים Transfection

הערה: מקרופאגים RAW264.7 גדלים כדי confluency משנה בינוני שלם (RPMI (מכון ממוריאל פארק Roswell) בינוני 1640, 10 HEPES מ"מ, פירובט סודיום 1 מ"מ, 50 מיקרומטר β-mercaptoethanol, 2 מ"מ L- גלוטמין ו -10% FCS ( סרום עגל עוברי)) בצלחת 100 מ"מימ. הם טרנספקציה עם פלסמידים קידוד החלבונים המתויגים fluorescently ידי electroporation. באופן שגרתי כ 5 - 6 x 10 6 תאים הם transfected עם 20 מיקרוגרם או 10 מיקרוגרם של פלסמיד לכל transfection או-transfection שיתוף בהתאמה. שימו לב אמצעים אחרים של transfection מבוססים על electroporation או lipofection יכולים לשמש גישות חלופיות.

  1. גרדו את התאים עם מרים תא resuspend אותם 10 מ"ל של מדיום התרבות ידי pipetting מעלה ומטה מספר פעמים.
  2. צנטריפוגהתא ההשעיה XG 300, 5 דקות ב RT ב הרוטור זווית מתנדנד.
  3. מחממים 10 מ"ל של מדיום מלאה בתוספת 10 מיקרוגרם / מ"ל ​​של גנטמיצין על 37 מעלות צלזיוס.
  4. בעקבות צנטריפוגה, לבטל את supernatant ו resuspend גלולה ב 3 מ"ל של "חיץ כביסה" מתוך הערכה electroporation.
  5. צנטריפוגה ההשעיה התא XG 300, 5 דקות בטמפרטורת החדר ב הרוטור זווית מתנדנד.
  6. בינתיים מכינים את תערובת DNA בטמפרטורת החדר: 120 μl 2x הצפת B, 20 מיקרוגרם של קידוד פלסמיד דנ"א לחלבון של עניין, qsp 240 μl H 2 O.
  7. בעקבות צנטריפוגה, לבטל את supernatant כולו.
  8. Resuspend התא גלולה בתמהיל DNA ולהעביר לתוך cuvettes electroporation 4 מ"מ.
  9. לדגור על RT במשך 3 דקות.
  10. Electroporate ב 250 V, 900 μF.
  11. מיד resuspend התאים מחומם מראש (37 ° C) בינוני מלא בתוספת גנטמיצין ו צלחתמ בצלחת 100 מ"מ.
  12. דגירת תאי transfected הלילה ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2.
  13. למחרת בבוקר, להחליף את מדיום להשלים עם 10 מ"ל של מדיום מיקרוסקופית סרום ללא (RPMI 1640 ללא פנול אדום, 10 HEPES מ"מ, 1 פירובט נתרן מ"מ, 50 מיקרומטר β-mercaptoethanol, 2 מ"מ L- גלוטמין).

2. Opsonization של תאי דם אדומים

הערה: כמודל של יעד חלקיקים עבור מקרופאגים, תאי דם אדום כבשים (SRBCs) משמשים. בדרך כלל, בסביבות 7 x 10 6 SRBCs לכל 35 מ"מ צלחת זכוכית תחתונה משמש.

  1. שטפו את SRBCs עם 100 μl של PBS 1x (בופר פוספט) /0.1% BSA (אלבומין בסרום שור) צנטריפוגות (600 XG, 4 דק ').
  2. בעקבות צנטריפוגה, לבטל את supernatant ו resuspend SRBCs ב 100 μl של 1x PBS / 0.1% BSA ו צנטריפוגות (600 XG, 4 דק ').
  3. בעקבות צנטריפוגה, לבטל את supernatant ו resuspend SRBCs ב 1x PBS / 0.1% BSA עם ארנב IgG אנטי SRBCsב תת-agglutinating ריכוז. השתמש 500 μl של תמיסה המכילה נוגדן / 5 μl של SRBCs.
    הערה: הריכוז תת-agglutinating של נוגדנים תואם את הריכוז הנמוך ביותר שלא לגרום התלכדות זוהתה כמו היווצרות של רשת סלולרית. באופן כללי, ריכוז agglutinating-משנה הוא 8.2 מיקרוגרם / מ"ל.
    1. קבע את הריכוז של IgG אנטי SRBCs נדרש opsonize SRBCs ידי מבחן hemagglutination. סדרתי לדלל את (המניה ב 13.1 מ"ג / מ"ל) אנטי-SRBCs IgG בין 1/50 - 1 / 25,600 בתוך microplate. להוסיף 2 x 10 6 SRBCs בכל טוב. דגירת הצלחת בחושך ב RT במשך כמה שעות.
  4. לדגור על RT במשך 30 דקות עם סיבוב איטי.
  5. לאחר שתי שטיפות ב 1x PBS / 0.1% BSA כמתואר לעיל, resuspend SRBCs IgG-opsonized (IgG-SRBCs) במדיום מיקרוסקופיה מחומם מראש סרום ללא (2 מ"ל / צלחת).

ציפוי של Coverslips 3. פולי-ליזין

  1. בינתיים, לטפל 35 מנות מ"מ זכוכית התחתונה עם 2 מ"ל של פולי- L- ליזין 0.01% למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר.
  2. לשטוף את הכלים פעמיים עם 2 מ"ל של 1x PBS.

4. קיבוע ללא קוולנטי של SRBCs על מנות תחתיות זכוכית

  1. יוצקים 2 מ"ל של השעיה SRBCs לכל 35 מ"מ זכוכית צלחת תחתית.
  2. צנטריפוגה עם הרוטור מתנדנד ב XG 500 במהלך 2 דקות על 35 מנות תחתיות זכוכית מ"מ.
  3. הסר את supernatant ולשטוף פעם עם 2 מ"ל של BSA 1x PBS / 10%.
  4. דגירה חלקיקים למשך 30 דקות עם 2 מ"ל של BSA 1x PBS / 10% לכל צלחת.
  5. לשטוף את הכלים שלוש פעמים עם 2 מ"ל של 1x PBS.
  6. החלף 1x PBS עם 2 מ"ל של טרום התחמם (37 ° C) בינוני מיקרוסקופית סרום ללא.

5. Phagocytosis דמיינו ידי TIRFM

  1. מִיקרוֹסקוֹפּ
    הערה: TIRFM בוצע באמצעות מיקרוסקופ מצויד טבילה אובייקטיבית-שמן (N 100X, NA1.49), תא חימום עם 2 CO, ושני שריםle פוטון איתור מצלמות EMCCD (אלקטרונים והכפילה התקן צמוד) בשילוב עם עדשה 1.5x.
    1. יום לפני הפגישה מיקרוסקופ TIRF, להדליק את תא חימום על 37 מעלות צלזיוס, כדי לאפשר חימום הומוגנית של הבמה מיקרוסקופ.
  2. קביעת זווית ביקורתית
    הערה: תוכנת Profiler הצבע ImageJ משמשת תהליך זרמי תמונה TIRF.
    1. מניחים צלחת תחתית זכוכית 35 מ"מ המכיל opsonized SRBC עם המדיום מיקרוסקופיה סרום ללא מתחת למיקרוסקופ.
    2. גרדו את התאים resuspend אותם במדיום לפני הוספתם (100 - 500 μl) בצלחת.
    3. השתמש בתוכנת "Live רכישת" לשלוט מיקרוסקופ ולבצע עירור עם 491 ננומטר ו / או לייזר 561 ננומטר לזהות תאים המבטאים החלבונים המתויגים fluorescently.
    4. לזהות תא המבטא את החלבונים המתויגים fluorescently.
    5. מניחים אותו באמצע השדה ולרכוש 500 imהגילאים באורך גל עירור אחד, עם זוויות שונות החל 0º עד 5º, עם תוספת של 0.01º (איור 2 א). הזוויות משתנות באופן אוטומטי על ידי מערכת מיקרוסקופ.
    6. קבע את הזווית הקריטית המאפשרת את אור האירוע להשתקף לחלוטין בממשק הזכוכית / בינוני ליצור את הגל החולף. באמצעות תוכנת ImageJ הצבע Profiler, לפתוח את רצף תמונה על ידי לחיצה על "קובץ", "פתח" ולבחור את הקובץ.
    7. בחר אזור של (ROI) העניין, עם הכלי המלבני, בתא עם קרינה אחידה (תרשים 2B צהוב 1).
    8. שרטט את "פרופיל ציר Z" אומר עוצמת הקרינה הנמדדת ההחזר על ההשקעה עם פונקציה של זוויות על ציר x על ידי לחיצה על הלשונית "תמונה", "סטאקס" בתוך התפריט הנפתח "מגרש Z- ציר פרופיל" (תרשים 2B אדום 2).
      ההערה: הזווית הקריטית היא הזווית המובילה אל maקרינת ximum לפני ירידה חדה קרינה.
    9. השתמש בכל ערך של זווית על ציר x המעולה לזווית הקריטית במהלך הפגישה במיקרוסקופ כדי לקבל אות TIRF כמו למשל 2.00 (איור 2 ג).
  3. רכישות
    1. באמצעות תוכנת רכישה חייה, להגדיר את הפרמטרים של רכישה עם מודול "עורך פרוטוקול" (איור 3 א).
      1. צור פרוטוקול עם "לולאה" המהווים "ערוצים רבים" רכישה לרכישת אות ניאון מחלבונים של עניין באזור TIRF. הזן את זווית TIRF (למשל 2.00), את זמן החשיפה (עבור msec למשל 50) ואת עוצמת הלייזר (למשל 50%) (איור 3 ב 1).
      2. הצג "מהלך Z" של מיקרומטר האובייקטיבי 3 מעל אזור TIRF להשיג רכישת אות ב epifluorescence עם כלי "ערוצים רבים". הזן בזווית מתחת tהוא זווית קריטית (כמו למשל 1.00), הזמן של אקספוזיציה (50 msec) ואת עוצמת הלייזר (50%) (איור 3B, 2 ו -3).
      3. הבא להוסיף "מהלך z" של מיקרומטר האובייקטיבי 3 להלן, לחזור באזור TIRF (איור 3 ב 4). הוספת "תמונת מצב" של התא באור בהיר LED (דיודה פולטת אור) (איור 3 ב 5).
    2. מצא תא עניין עם רמה מתונה של ביטוי חלבון מתויג fluorescently היוזם phagocytosis של SRBC על ידי הרחבת קרום הפלזמה סביב החלקיק.
    3. מניחים אותו באמצע השדה.
    4. התחל הזרמת רכישת 500 - 1,000 מסגרות. בלשונית "ספירת לולאה", זן "750 מסגרות" (איור 3 ב 1).
      הערה: תוכנת Profiler הצבע ImageJ משמשת תהליך זרמי תמונה TIRF.
    5. פתח את התמונות ברצף בתוכנת J תמונה על ידי לחיצה"קובץ", "להרחיב" ובחירת הקובץ.
    6. הפרד את הערוצים על ידי לחיצה על הלשונית "התמונה", "Hyperstacks" לתפריט נשלף ועל "חול כדי hyperstack" פונקציה. השלם את החלון הופיע: סדר: xyctz; ערוץ (ג): מספר הערוצים (לשעבר: "2" אם יש לך שני fluorochromes); פרוסות (z): מספר הפרוסות ציר z (לשעבר: "1" אם אין תנועה בציר z-); מסגרות (t): מספר התמונות המחולקות לכל מספר הערוצים; מצב תצוגה: גוונים אפורים.
      הערה: שני רצפי תמונות נפרדים נוצרים, מתאים לשני הערוצים השונים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

מערכת הניסוי המתוארת בכתב היד הזה מיוצג סכמטי באיור 1. מקרופאגים טרנספקציה RAW264.7 להביע את החלבונים של עניין התמזג תג פלורסנט ממוקמים במגע עם תאי דם אדום כבשים-opsonized IgG (SRBCs) שהיו בלתי קוולנטית קבוע על coverslip. המקרופאגים יכול לנתק את SRBC מן coverslip לבלוע אותו. המיקרוסקופ TIRF בשימוש מאפשר רכישה קשורה של אותות מאזור TIRF מתאימים קצות pseudopods האותות במצב epifluorescence לאחר משמרת Z 3 מיקרומטר לעיל.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

פרוטוקול הניסוי המתואר כאן מציע שיטה חסרת תקדים לעקוב בזמן אמת ובתאים חיים, ברזולוציה גבוהה, היווצרות פגוזום ובמיוחד סגירתו. יש לדון במספר היבטים טכניים. ראשית, הבדיקה רגישה מאוד לטמפרטורה. חשוב מאוד לבדוק שתא החימום נמצא ב -37 מעלות צלזיוס וכי כל המדיה, המכשירים או התאים נשמרים בתוך החדר כדי למנוע שינויי טמפרטורה העלולים לפגוע ביעילות הפגוציטוזיס. שמנו לב ששינויי טמפרטורה עדינים מספיקים כדי למנוע היווצרות פגוזומים. שנית, הפרוטוקול המתואר כאן מאפשר קביעה מדויקת של זווית ה-TIRF שתשמש לאורך כל הניסוי. אנו מאמינים כי זה מהו...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

למחברים אין מה לחשוף.

תודות

אנו מודים לד"ר אלכסנדר בן מרה (Institut Imagine Necker, פריז, צרפת) על הדיונים הראשוניים על הגישה הניסויית ולד"ר ג'מיל ג'וברייל על קריאת כתב היד. נדז' קמבו וסוזנה בורייל זכו להכרה על ביצוע ניסויים בשיטה במעבדה שלנו. עבודה זו נתמכה על ידי מענקים מ-CNRS (תוכנית ATIP), Ville de Paris ו-Agence Nationale de la Recherche (2011 BSV3 025 02), Fondation pour la Recherche Médicale (FRM INE20041102865, FRM DEQ20130326518 כולל מלגת דוקטורט ל-FMA) ל-FN, והסוכנות הלאומית למחקר של SIDA et les hépatites virales" (ANRS) כולל מלגת דוקטורט ל-JM.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
תאי דם אדומים נגד כבשים IgGMP Biomedicals55806
סרום בקר אלבומין מקטע הלם חום, pH 7, ≥ 98% SigmaA7906
מרים תאיםCorning3008
Cuvettes 4 מ"מפרויקט תאיםEP104
DPBS, ללא סידן, ללא מגנזיוםThermo Fischer Scientific14190-094בטמפרטורת החדר
פרויקט תאיםEB110
100 מ"מ TC-Assisted Cell CultureCorning353003
Gene X-cell pulserBiorad165-2661
תמיסת GentamicinSigmaG1397
כלי תחתית זכוכית 35 מ"מ לא מצופה 1.5תאגיד MatTekP35G-1.5-14-C מארז
iMICTILL Photonicsמטרת טבילה בשמן (N 100X, NA1.49), תא חימום עם CO2, מצלמה לזיהוי פוטון יחיד EMCCD (אלקטרון מכשיר מצמד מטען כפול) ועדשת 1.5X
תמיסת פולי-L-ליזין 0.1%סיגמאP8920-100 מ"לדילול ב-0.01% במים 
RPMI 1640 בינוני GLUTAMAX  SupplementLife technologies61870-010
RPMI 1640 בינוני, ללא פנול אדום (10 x 500 מ"ל)Life technologies11835-105חם ב-37 מעלות; אמבט מים C לפני השימוש
תאי דם אדומים של כבשים (SRBCs)EurobioDSGMTN00-0Qנשמר במאגר אלסבר ב-4 מעלות; ג לפני השימוש
ערכת אלקטרו-מאגר

מקורות

  1. Flannagan, R. S., Jaumouille, V., Grinstein, S. The cell biology of phagocytosis. Ann Rev Pathol. 7, 61-98 (2012).
  2. Swanson, J. A. Shaping cups into phagosomes and macropinosomes. Nat Rev Mol Cell Biol. 9, 639-649 (2008).
  3. Stuart, L. M., Ezekowitz, R. A. Phagocytosis and comparative innate immunity: learning on the fly. Nat Rev Immunol. 8, 131-141 (2008).
  4. Niedergang, F. Encyclopedia of Cell Biology. Bradshaw, R. A., Stahl, P. D. 2, Academic Press. Waltham, MA. 751-757 (2016).
  5. Poon, I. K., Lucas, C. D., Rossi, A. G., Ravichandran, K. S. Apoptotic cell clearance: basic biology and therapeutic potential. Nat Rev Immunol. 14, 166-180 (2014).
  6. Aderem, A., Underhill, D. M. Mechanisms of phagocytosis in macrophages. Annu. Rev. Immunol. 17, 593-623 (1999).
  7. Underhill, D. M., Goodridge, H. S. Information processing during phagocytosis. Nat Rev Immunol. 12, 492-502 (2012).
  8. Underhill, D. M., Ozinsky, A. Phagocytosis of microbes: complexity in action. Annu Rev Immunol. 20, 825-852 (2002).
  9. Canton, J., Neculai, D., Grinstein, S. Scavenger receptors in homeostasis and immunity. Nat Rev Immunol. 13, 621-634 (2013).
  10. Freeman, S. A., Grinstein, S. Phagocytosis: receptors, signal integration, and the cytoskeleton. Immunol Rev. 262, 193-215 (2014).
  11. Scott, C. C., et al. Phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate hydrolysis directs actin remodeling during phagocytosis. J Cell Biol. 169, 139-149 (2005).
  12. Schlam, D., et al. Phosphoinositide 3-kinase enables phagocytosis of large particles by terminating actin assembly through Rac/Cdc42 GTPase-activating proteins. Nat Commun. 6, 8623(2015).
  13. Marion, S., et al. The NF-kappaB Signaling Protein Bcl10 Regulates Actin Dynamics by Controlling AP1 and OCRL-Bearing Vesicles. Dev Cell. 23, 954-967 (2012).
  14. Loovers, H. M., et al. Regulation of phagocytosis in Dictyostelium by the inositol 5-phosphatase OCRL homolog Dd5P4. Traffic. 8, 618-628 (2007).
  15. Deschamps, C., Echard, A., Niedergang, F. Phagocytosis and cytokinesis: do cells use common tools to cut and to eat? Highlights on common themes and differences. Traffic. 14, 355-364 (2013).
  16. Johnson, D. S., Jaiswal, J. K., Simon, S. Chapter 12, Unit 12.29: Total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy illuminator for improved imaging of cell surface events. Curr Protoc Cytom. , (2012).
  17. Riedl, J., et al. Lifeact: a versatile marker to visualize F-actin. Nat Methods. 5, 605-607 (2008).
  18. Marie-Anais, F., Mazzolini, J., Herit, F., Niedergang, F. Dynamin-actin cross-talk contributes to phagosome formation and closure. Traffic. 17 (5), 487-499 (2016).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

TIRF

מאמרים קשורים