הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

מי כלוריד-induced Ferric מודלים פקקת Murine

22.5K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/54479

⸱

5 בספטמבר 2016

 ,  , 
1Department of Cellular and Molecular Medicine, Lerner Research Institute, Cleveland Clinic, 2Department of Molecular Medicine, Cleveland Clinic Lerner College of Medicine of Case Western Reserve University, 3Department of Pharmacology, Case Western Reserve University, 4Department of Biomedical Engineering, Case Western Reserve University

במאמר זה

סיכום

אנו מדווחים הליך מעודן של כלוריד Ferric (FeCl 3) מודלים פקקת -induced על העורק הראשי ואת mesenteric וכן וריד, מאופיין באמצעות מיקרוסקופ intravital ביעילות לפקח הזמן Occlusive היווצרות thrombi.

תקציר

פקקת עורקים (קריש דם) היא סיבוך שכיח של מחלות מערכתיות רבות הקשורות לדלקת כרונית, כולל טרשת עורקים, סוכרת, השמנת יתר, סרטן והפרעות ראומטולוגיות אוטואימוניות כרוניות. פקקת היא הגורם לרוב התקפי הלב, שבץ ואובדן הגפיים, מה שהופך את הפקקת לבעיה חשובה ביותר בבריאות הציבור. מכיוון שפקקת זו נובעת מהפעלה לא מתאימה של טסיות הדם וקרישה לאחר מכן, להתמקדות במערכות אלה מבחינה טיפולית יש משמעות קלינית חשובה לפיתוח טיפולים בטוחים יותר. בשל המורכבות של המערכת ההמוסטטית, ניסויים במבחנה אינם יכולים לשכפל את האינטראקציות בין דם לדופן כלי הדם; לכן, מחקרי in vivo הם קריטיים להבנת מנגנונים פתולוגיים של היווצרות פקקת. לשם כך פותחו מודלים שונים של פקקת בעכברים. ביניהם, פגיעה בכלי הדם הנגרמת על ידי ברזל כלוריד (FeCl3) היא מודל בשימוש נרחב של פקקת חסימה המדווח על הפעלת טסיות דם וצבירה בהקשר של מערכת כלי דם סגורה אספטית. מודל זה מבוסס על פגיעה בתאי אנדותל הנגרמת על ידי חמצון חיזור, שהיא פשוטה ורגישה לתרופות נוגדות קרישה ונוגדות טסיות כאחד. הזמן הנדרש להתפתחות פקקת החוסמת את זרימת הדם נותן מדד כמותי של פגיעה בכלי הדם, הפעלת טסיות דם וצבירה הרלוונטית למחלות פקקת. חידדנו משמעותית את מודל פקקת כלי הדם המושרה על ידי FeCl3, מה שהופך את הנתונים לשחזור מאוד עם שונות מינימלית. כאן אנו מתארים את המודל ומציגים נתונים מייצגים ממספר מערכי ניסוי המדגימים את התועלת של מודל זה בחקר פקקת.

מבוא

פקקת עורקים (קריש דם) היא סיבוך נפוץ של מחלות מערכתיות רבות הקשורות בדלקת כרונית, כולל טרשת עורקים, סוכרת, השמנת יתר, סרטן והפרעות rheumatologic אוטואימונית כרונית. Thrombi המתרחשת בגזע במחזור עורקים מהפעלת טסיות הולמת, צבירה ומנגנוני coagulatory הבאות שלה מעורבת התקף לב, שבץ ואובדן גפיים. בדפנות כלי הדם היא מערכת מורכבת הכוללת סוגי תאים מרובים ומושפע רב של גורמים חיצוניים כולל מאמץ הגזירה, תאי דם, הורמונים וציטוקינים, כמו גם ביטוי של חלבונים נוגדי חמצון בדפנות כלי הדם. ניסויים במבחנה לא יכול לשכפל בסביבה המורכבת הזו ולכן במחקרים vivo תוך שימוש במודלים של בעלי חיים הם קריטיים כדי לאפשר הבנה טובה יותר של המנגנונים המעורבים הפרעות של פקקת.

עכברים הוכחו יש simמנגנוני ilar לבני אדם במונחים של פקקת, טרשת עורקים, דלקת 1,2 סוכרת. יתר על כן, העכברים הטרנסגניים ו בנוקאאוט ניתן ליצור לבדוק את הפונקציה של מוצרים גנים ספציפיים פיזיולוגי מורכב או הסביבה פתולוגיים. מחקרים כאלה לחקות הפתולוגיה האנושית עשויה לספק מידע מכניסטית חשובים הקשורים גילוי מסלולים וטיפולים חדשים, כמו גם לספק פרטים חשובים באפיון השפעות התרופה על פקקת.

Thrombi עורקי הפתולוגי להתרחש עקב אנדותל פציעה שכבה או תפקוד לקוי וחשיפה של זרם הדם המטריצה ​​subendothelial 3,4. מודלים פקקת שונים פותחו כדי לגרום נזק האנדותל זה כגון פגיעה מכנית, מתחם photoreactive פציעה חמצוני מבוססי בנגל רוז לייזר פציעה 5. ב הספקטרום הזה, כלוריד Ferric (FeCl 3) -induced לפגיעה בכלי דם היא מודל נפוץ של פקק. מגיב זה כאשרמוחל על היבט של כלי החיצוני גורם נזק חמצוני לתאים וסקולרית 6-8, עם הפסד של הגנה תא האנדותל מן במחזור טסיות ורכיבים של מפל הקרישה. המודל 3 FeCl הוא פשוט רגיש לשני תרופות נוגדות קרישה ואנטי-טסיות, והועלה על התרדמה ועורקים הירך, ורידי הצוואר, mesenteric ו arterioles cremasteric ו venules בעכברים, חולדות, שרקנים וארנבות 6-15.

אחת פרמטר מדיד במודל זה הוא הזמן שחלף מפציעה להשלים חסימה כלי, כפי שנמדד הפסקת זרימת הדם עם מד זרימת דופלר או בהשגחה ישירה עם 6,7,9 מיקרוסקופיה intravital. מגוון של פעמים בין 5 עד 30 דקות דווח במחקרים שונים C57BL6 עכברי 7-10,16, דבר המצביע על כך ריכוזי FeCl 3, סוגים של הרדמה, טכניקות כירורגיות, גיל עכבר, רקע גנטי, שיטת המדידה בזרימת lood, ומשתנים סביבתיים אחרים יש השפעה משמעותית במודל זה. השתנות רחבה זה עושה את זה קשה להשוות מחקרים מקבוצות מחקר שונות והוא רשאי להתקין זיהוי של הבדלים דקים קשה.

עם חזון כדי למזער variabilities כאלה ולהקים לשחזור אחיד במערכת מודל vivo, יש לנו מודל חלופי שהוצע עורק התרדמה -induced FeCl 3 שעושה את הנתונים לשחזור ביותר עם ​​וריאציה מינימלי 6-10,16-19. במאמר זה נתאר ולשתף את הכישורים ולדווח כמה דוגמאות ניסיוני נציג שיכול להפיק תועלת במודל זה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

כל הנהלים והמניפולציות של חיות אושרו על ידי טיפול בבעלי חיים מוסדיים ועדות שימוש (IACUC) של קליבלנד קליניק בהתאם למדיניות השירות לבריאות ציבור ארצות הברית על הטיפול האנושי ושימוש בחיות, ואת מדריך NIH עבור הטיפול ושימוש בחיות מעבדה.

1. הכנות:

  1. צבע פלואורסצנטי עבור טסיות תיוג
    1. הכן פתרון 6G rhodamine, 0.5 מ"ג / מ"ל, ב מליחים לעקר את הפתרון עם 0.22 מיקרומטר הסינון.
  2. פתרון FeCl 3
    1. בצע פתרון מניות טרי של 30% FeCl 3 (נטול מים, שווה 1.85 M) במים טהורים, ולסנן עם 0.45 מיקרומטר סינון. כן 5 מיליליטר הטרי FeCl 3 פתרון בריכוז הרצוי [למשל, 2.5% (0.154 מ '), 5% (0.308 מ'), 7.5% (0.463 מ '), 10% (0.617 מ') ו -12.5% ​​(0.771 M)] על ידי דילול הפתרון 30% 3 FeCl עם i מיםנה מנה 6 ס"מ רקמת התרבות לשמור על מכסה סגור.
      הערה: שימוש מנת התרבות מקל להרים את נייר הסינון רווי פתרון FeCl 3 מ להרים אותו ממכל צר, כגון צינור 1.5 מיליליטר microcentrifuge. FeCl3 מאוד מסוכן וכי אמצעי זהירות, כגון כפפות לובשות חלוק מעבדה וכו ', ציוד מגן אישי, תמיד צריכה להילקח.
  3. ניירות לסנן
    1. חותכים את נייר הסינון עד 1 מ"מ x 2 גודל מ"מ. משרים מספיק חתיכות של נייר לחתוך מסנן בפתרון 3 FeCl באותה צלחת.
  4. Papaverine Hydrochloride פתרון
    1. הכן פתרון hydrochloride papaverine (25 מ"ג / מ"ל) במים לעקר את הפתרון עם 0.22 מיקרומטר הסינון.
  5. agarose ג'ל
    1. הכן ג'ל agarose 2% ב PBS או תמיסת מלח בצלחת בתרבית רקמה 6-היטב, ~ 1 ס"מ עובי, ו גut אותו חצי עיגול עם ~ 3 ס"מ קוטר.

2. FeCl 3 מושרת דגם פקק פגיעת ראש עורקים

  1. ניתוחים עבור הדגם פקק
    1. השתמש 8 - 12 שבועות עכברים C57BL6 (או זנים אחרים לפי הצורך). להרדים עכברים עם תערובת של קטמין (100 מ"ג / ק"ג) / xylazine (10 מ"ג / ק"ג) באמצעות הזרקה intraperitoneal. אשר את עומק ההרדמה על ידי צביטת בוהן.
      הערה: סכום זה של קטמין / xylazine מספיק כדי לשמור על בעלי החיים בהרדמה יציבה ללא כאב (בתגובת בוהן הצובטת) לפחות 1 שעה.
    2. הסר פרווה על הצוואר והחזה העליון עם גוזז חשמלי חיה קטנה. קרם מקריח אינו הכרחי. החל משחת עין נפט ניטראלית על העיניים כדי למנוע יובש במהלך הרדמה.
    3. אבטח את העכבר במצב שכיבה על מכסה צלחת בתרבית רקמה 15 ס"מ. השתמש קלטת אחת ארוכה (~ 10 ס"מ) להבטחת היןגפי ד ואת גוף תחתון, ואת שתי חתיכות של נייר קטן (2 סנטימטרים X 0.5 סנטימטרים) להבטחת רגליים קדמיות. השתמש תפר 4-0 כדי לעטוף החותכות, קלט את שני קצוות של תפר את המכסה כדי לשמור על צוואר עכבר ישר (איור 2).
    4. מניחים צלחת עם הראש העכבר כלפי המפעיל תחת מקור אור כירורגית.
    5. לעקר את האתר כירורגית עם כרית אלכוהול. להשתמש במלקחיים מיקרו-Adson להחזיק את העור ולהשתמש מספריים כירורגיות לעשות חתך קטן (2 - 3 מ"מ).
    6. מתח את העור של החתך עם המלקחיים וכנס מספרי כירורגיות עם לסתות סגורות לתוך החתך. לדחוף את המספריים מתחת לעור כלפי manubrium או הסנטר, ולאחר מכן פתח את המספריים לשחרר את העור מפני השכבה התת עורית.
    7. חותכים את העור עם מספריים כירורגיות לעשות חתך קו האמצע מן manubrium לרמה של עצם הלשון (איור 3 א ו 3 ב). בבוטות לנתח את fascia הדקה (קו מקווקו, ב איור 3B) בין בלוטות submaxillary עם hemostat בסדר מלקחיים גרפה (איור 3 ב ו -3 ג; חיצים כחולים).
      הערה: manubrium (חץ שחור איור 3 ג) ואת קנה הנשימה (T באיור 3C) יראו לאחר שלב זה.
    8. החזק את הרקמות הרכות העור לראות בחלק הימני של manubrium עם המלקחיים גרפו, הכנס את hemostat תחת fascia כלפי בעמדת 2 שעה (קו מקווקו צהוב איור 3 ג), לפתוח את הלסתות של hemostat לשחרר את וריד הצוואר מן הרקמה שמסביב.
    9. חותכים את fascia, רקמות רכות העור כלפי בעמדה 2 השעה (איור 3 ג) עם מספריים כירורגיות כדי לחשוף את וריד הצוואר הימני (איור 3D, חץ).
    10. צייר על 200 - פתרון 300 μl rhodamine 6G באמצעות מזרק 1 מ"ל עם 22 מחט G, ולאחר מכן שינויזה עד 30 מחט G.
      הערה: זה מגן המחט 30 G מנזק בין קצהו בסדר. ישירות ציור הפתרון 6G rhodamine עם מחט 30 G לא תגרום נזק קצה; עם זאת נוגע בקיר מיכל בטעות תגרום נזק, אשר עלול לגרום הזרקת קשה.
    11. שטוף את המחט 30 G על ידי לאט לדחוף את הפתרון 6G rhodamine, לוודא שאין בועות אוויר להישאר בתוך המזרק או המחט. הצב של 100 μl rhodamine פתרון 6G להזרקה.
    12. בנד 2 - 3 מ"מ קצה המחט לזווית של 90 מעלות עם בעל מחט, אשר ימנע החדרת המחט עמוק מדי אל וריד הצוואר והופך את הזריקה יותר לשלוט בקלות (איור 3D).
    13. להזריק את הפתרון 6G rhodamine לווריד תקין הצוואר כדי טסיות התווית. כדי לייצב את המזרק ולשמור על המחט בנקודה, להחזיק את המזרק ביד אחת ואת המחט עם המלקחיים גרפו עם יד אחרת במהלך injection.Afהזרקת ter, מהדקת את הזריקה עם המלקחיים גרפו כדי למנוע דימום.
    14. פתח את הלסתות של hemostat ולהכניס אותו תחת מלקחיים גרפה כדי לצבוט בדפנות כלי הדם של הזריקה, ולאחר מכן ולקשור את הזריקה עם תפר 6-0.
      הערה: כחלופה של צעד 2.1.15, הפעלת לחץ על הזריקה באצבע למשך 2 דקות יהיה לעצור את הדימום; יש עם זאת, שיטה זו סיכון בגרימת דימום נוסף אם הקריש באזור הזריקה מוסר בטעות.
    15. בבוטות לנתח את רקמות fascia הרכות סביב בלוטת submaxillary נותרת עם hemostat ו המלקחיים גרפו ולמשוך את הבלוטה כלפי ובמיקום 7 שעה (האיור 3E) כדי לחשוף את שרירי sternocleidomastoid שמאלה (חץ כחול באיור 3E).
    16. בבוטות לנתח את fascia (3E איור, קו מקווקו) בין שריר sternocleidomastoid שמאלה שריר omohyoid או sternohyשריר OID (3E איור, חץ ירוק) ממוקם לאתר השמאלי של קנה הנשימה עם hemostat.
    17. לעבור מחט עם תפר משי 6-0 (כ -15 ס"מ) תחת באמצע השריר sternocleidomastoid (חץ כחול 3E איור), לשים את שני הקצוות של תפר ביחד ומשוך תפר רוחבית לכיוון במיקום 10 השעה .
      הערה: הליך זה צריך להתבצע בזהירות, כדי למנוע פגיעה של וריד הצוואר השמאלי, הנמצא מחוץ שריר sternocleidomastoid.
    18. בבוטות להפריד את השריר sternohyoid דק ו / או שריר omohyoid לחשוף את העורק הראשי (CA) (חץ איור 3F) לאחר מסירה את השריר sternocleidomastoid. חותכים את השריר sternohyoid ו / או שריר omohyoid לפי הצורך. השתמש hemostat להפריד את הרקמות הרכות מ CA בלי לגעת CA.
      הערה: CA מלווה העצב התועה, המבנה הלבן לראות איור 3G (חץ ירוק), וברוב המקרים זה מתחת לשריר sternohyoid דק ו / או שריר omohyoid (בין הקווים המקווקווים צהוב באיור 3F).
    19. השתמש מלקחיים טיפ נאה להרים את fascia לרוחב ברחבי CA תוך הימנעות העצב התועה ו CA. שימוש נוסף מלקחיים טיפ נאה אגרוף חור על fascia בין CA לבין העצב התועה.
    20. להעביר את הקרס דרך החור בעדינות להרים את CA, ולאחר מכן למקם את מלקחי טיפ הנאים תחת CA. הזז את הקרס מלקחיים בכיוונים מנוגדים לאורך CA להתפשט רקמות רכות adventitial. ב חינם לפחות ~ 5 מ"מ אורך של CA (האיור 3H, חץ כחול) מן הרקמה שמסביב.
    21. כדי לחסום קרינת רקע, לחץ על הקצה של stirrer קפה פלסטיק שחור שטוח, Crosscut בוחש קפה לתוך חתיכת 3 מ"מ, ואז לחתוך longitudinally בשולי לקפל לקבל שתי חתיכות פלסטיק בצורה "U" (3H איור, ירוק חץ).
    22. יש לשטוף חתיכה אחת של פלסטיק בצורת "U" זה עם מי מלח והחזק אותו עם מלקחיים ומניחים אותו מתחת CA בעודך מרים את CA בעדינות עם וו (3H איור, החץ הירוק). מיד להחיל 2-3 טיפות של תמיסת מלח כדי למנוע ייבוש CA.
  2. הקלטת וידאו בזמן אמת
    1. מעביר את מכסה עכבר צלחת יחד על הבמה מיקרוסקופ ומכניס בעמדה מתאימה תחת עדשת מי 10X. למלא את החלל בין עדשת 10X ואת CA עם מי מלח.
    2. הפעל את יישום תוכנת הקלטת וידאו הדיגיטלי, והפעל קובץ חדש ותיתן להן שם מתאים. להקליט תמונות כלי נורמליות לרשום את מספר המסגרת כאשר הקלטת הווידאו הוא עצר.
      הערה: מוצרי תוכנת הקלטת וידאו במחשב להקלטה. אנו משתמשים בתוכנות הקלטת וידאו דיגיטליות התיאורים הבאים מבוססים על יישום זה.
      הערה: מאז tra מכניאומה יכולה לפגוע האנדותל ולהוביל היווצרות פקיק 20, יש צורך לאשר שאין פגיעה כירורגית כדי בדפנות כלי הדם לפני הפציעה 3 FeCl. כמו כן יש לאשר שאין הרקמה הנותרת ברחבי קליפורניה, העשויים ליצור מחסום ולעמעם את השפעת הפגיעה -induced 3 FeCl. רשום את מספר המסגרת של הרשומות יעשה את זה קל לנתח את הסרטונים בהתאם פעמים שחלפו מאוחר יותר.
    3. להזיז את העכבר עם מכסה צלחת מתוך עדשת 10X. מקפלים פינה של מגבת נייר כדי להפוך טיפ דק ועדין ולהשתמש בו כדי למחוק את מלח בזהירות סביב CA (להימנע מלגעת CA) וכן במקומות אחרים בתחום כירורגית. זה חשוב כדי למנוע דילול של הפתרון 3 FeCl בשימוש.
    4. השתמש מלקחי טיפ נאים להרים פיסת נייר סינון רוויה פתרון FeCl 3 ולמקם אותו ישירות על CA ולשמור אותו באתר 1 דקות.
      הערה: To להדמית סיוע של נתונים המדויקים הדם וקציר, הנח את הנייר המסנן קרובה לסוף הדיסטלי של חשופי CA (3I האיור) ולהשאיר קטע קצר באתר הפרוקסימלי (חץ ירוק 3I איור) על קיום זרימת דם מאוחר שלב (ראה להלן).
    5. הסר את הנייר מסנן (בנקודה זו בזמן מוגדר כתחילת "לאחר פציעה") ולשטוף את CA עם מי מלח (לפחות 2 מ"ל).
    6. שים את העכבר עם מכסה הצלחת בחזרה אל העדשה 10X; לבחון את הכלי ולהתחיל תמונות וידאו שיא. רשום לעצמך את המספר וידאו מסגרת בסוף כבר בדקה הראשונה של הקלטה.
      הערה: היווצרות פקיק מזוהה על ידי הצטברות של טסיות פלורסנט, אשר נצפו תמונות וידאו בזמן אמת על מסך המחשב או תחת מיקרוסקופ. תמונות הקלטת וידאו מיד לאחר לשים את העכבר בחזרה מתחת למיקרוסקופ. המשך להקליט עד הסוף בדקה הראשונה לאחר הסרת fנייר ilter. שים את הספינה כולה מן דיסטלי באתרי הפרוקסימלי לקבל מידע על הפציעה, ולאחר מכן להתמקד באזור של עניין (בדרך כלל הוא במרכז האזור הפגוע) הדמיה נוספת.
    7. תמונות וידאו שיא במשך 10 שניות כל דקה במשך 10 הדקות הראשונות (למשל, 2:55 כדי 3:05) ולאחר מכן 10 שניות כל שתי דקות עד סוף הניסוי. רשום את מספרי המסגרת כאשר כל הקלטה היא עצר.
      הערה: נקודות הקצה של המודל הן: 1) כאשר זרימת דם חדל עבור> 30 שניות; או 2) אם החסימה אינה נראית 30 דק 'לאחר פציעה. במקרה זה, להשתמש 30 דקות עבור ניתוח סטטיסטי. גדר זמן חשיפה של תיעוד וידאו כמו 10 msec בהתחלה, אז זה יהיה קל לשמור על זרימת הדם מעל thrombi. כאשר thrombi הפך לגדול ואת הקרינה מרווה את חיישן המצלמה, הוא הופך להיות קשה לזהות את זרימת הדם מעל thrombi. כדי לפתור בעיה זו, להזיז את ההדמיה center לאתר הפרוקסימלי ללא פגע (איור 3I, החץ הירוק) שבו זרימת הדם עדיין ניתן ציין בבירור. אנחנו גם להגדיל את Expose זמן כדי msec 15 או 20 כאשר ההתמקדות באתר בלתי נפצעו הפרוקסימלי, כך זרימת הדם ניתן לראות בצורה ברורה יותר. כאשר זרימת הדם תיפסק, רבים תאים גדולים (לויקוציטים) להתחיל לגלגל על ​​הקיר כלי באתר הפרוקסימלי של פקיק. תזרים בדרך כלל מפסיק בתוך 2 - 3 דקות לאחר הופעת התאים הגדולים. רשמו את Expose זמן שבגיליון ההקלטה אם הוא השתנה. זה בדרך כלל לוקח בערך 30 דקות מן ההרדמה עד סוף הניסוי, אם עכברי C57BL6 סוג הבר הרגילים שמשו.
      הערה זהירות: אל תשתמש קריש טסיות מצטבר לבן כסימן של הפסקת זרימת דם, אשר לא לתת נתונים מדויקים וזה מושפע זמן החשיפה. קריש הדם הלבן כיסה את לומן הכלי לא אומר זרימת דם חדל (ראה וידאו נציג 1).
    8. בסוף הניסוי, להרדים את העכברים באמצעות מנת יתר קטמין / xylazine (200/20 מ"ג / ק"ג), ואחריו נקע בצוואר הרחם לאחר אישור לא נשימה ופעימות לב.

3. עורק FeCl 3 מושרה Mesenteric / דגם פקקת וריד

  1. להרדים 8 - 12 בן שבוע עכברים C57BL6 כאמור בסעיף 2.1.1. החל משח וטרינר על העיניים כדי למנוע יובש במהלך הרדמה.
  2. להזריק פתרון papaverine (0.4 מ"ג / עכבר סה"כ) intraperitoneally לעכב תנועת פריסטלטית מעיים.
  3. הסר פרווה על הצוואר והבטן עם גוזז חשמלי חיה. קרם מקריח אינו הכרחי.
  4. אבטח את העכבר במצב שכיבה על מכסה צלחת בתרבית רקמה 15 ס"מ. השתמש ארבעה חתיכות של נייר קטנות (2 ס"מ X 0.5 ס"מ) כדי לאבטח את כל הרגליים. השתמש תפר 4 -0 כדי לעטוף החותכות, קלט את שני קצוות של תפר את המכסה כדי לשמור על ישר הצוואר (איור 2).
  5. בצע את ההליכים 2.1.4 -2.1.15 לחשוף את וריד הצוואר להזרקה של rhodamine 6G כדי טסיות התווית.
  6. בצע חתך קו האמצע דרך העור מפני xiphoid כדי הבטן התחתונה באמצעות מספריים כירורגיות (איור 4 א). תרים את הצפק באמצע (המכונה גם Linea alba, איור 4 א, ​​חץ) עם מלקחיים גרפו, אשר ברורה ואין לו כלי דם, להרים על 2 - 3 מ"מ גבוה, לאשר לא מעי מתחת לקו החיתוך, וחותכי הצפק פתוח אורכית עם מספריים בסדר (איור 4B).
  7. לאבטח מחדש העכברים למצב לרוחב נכון. מניחים את הג'ל agarose חצי עיגול קרוב הבטן, ובעדינות exteriorize המעיים ופרש אותה על החלק העליון של הג'ל עם מלקחיים גרפה (איור 4C). השתמש הסניפים השניים לניסוי פקק (האיור 4C, חץ).
    הערה: השתמש hemostat או מיקרו-Adson מלקחיים כדי לעזור exteriorize המעיים. להימנע מפגיעהמעי ואת הכלי.
  8. מניח 5 - 6 טיפות מי מלח כדי לשמור על הלחות של מעי הכלי. מעביר את העכבר עם מכסת הצלחת יחד על הבמה מיקרוסקופ ומניח בעמדה מתאימה תחת העדשה 10X היבשה.
    הערה: השתמש עדשה יבשה בגלל קרום jejunoileal לא יכול להחזיק תמיסת מלח. ודא לרדת תמיסת מלח על הרקמות החשופות לשמור אותם לחים.
  9. כתם המלוח סביב עורק וריד mesenteric לפני הטיפול.
  10. השתמש מלקחיים טיפ נאה להרים פיסת נייר מסנן רווי 12.5% ​​פתרון FeCl 3 ולמקם אותו ישירות על העורק לווריד mesenteric דקות 1 (איור 4D). הסר את הנייר מסנן (בנקודה זו בזמן מוגדר כתחילת "לאחר פציעה") ולשטוף את העורק mesenteric נפצעו וריד עם מי מלח (לפחות 2 מ"ל).
  11. שים את העכבר עם מכסה הצלחת בחזרה תחת עדשת יבש 10X; לבחון את כלי ולהתחיל recתמונות וידאו ORD כאמור 2.2).
    הערה: נקודות הקצה של ניסוי זה הן: 1) כאשר זרימת דם חדל עבור> 30 שניות; או 2) אם החסימה אינה נראית 30 דק 'לאחר פציעה, וגם במקרה זה להשתמש 30 דקות עבור ניתוח סטטיסטי.
  12. בסוף הניסוי, להרדים את העכברים באמצעות מנת יתר קטמין / xylazine (200/20 מ"ג / ק"ג), ואחריו נקע בצוואר הרחם לאחר בלי מכות נשימה ולב יאושרו.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

התרדמה עורקים פקקת דגם
בעכברים עם רקע C57BL6, אנו ממליצים להשתמש 7.5% FeCl 3 לטיפול הספינה דקות 1 כנקודת מוצא. תחת טיפול של 7.5% 3 FeCl, גבולות האזור הפצוע בדפנות כלי דם נורמליות מזוהים בקלות תחת מיקרוסקופ (מקוון ראו וידאו 1), דבר המצביע על כך את שכבת האנדותל נפגעה באופן משמעותי. Thrombi נוצר מיד עם הטיפול 3 FeCl, והם נצפו בכל דקות עכברים 1 WT C57BL6 לאחר פצי...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

מודל FeCl 3 -induced הוא אחד הדגמים פקקו בשימוש הנרחב ביותר, אשר לא יכול רק לספק מידע רב ערך על שינויים גנטיים על תפקוד טסיות ופקק 7,8,16,19,31-33, אבל גם יכול להיות כלי רב ערך להערכת תרכובות אסטרטגיות טיפוליות לטיפול ומניעה של מחלות atherothrombotic 11,17,34-37. כאן אנו הראינו השינויים שלנו חידודים של מודל זה והראינו ראיות נוספות של השירות של טכניקה זו, אשר היא רגיש מספיק כדי לקבוע את ההשפעות של קרישה (tPA) ותרופות אנטי-טסיות (נוגדן PAR4). בנוסף ה...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

למחברים אין מה לחשוף.

תודות

עבודה זו נתמכה על ידי המכון הלאומי ללב, ריאות ודם (NHLBI) של המכונים הלאומיים לבריאות תחת מספרי פרסים R01 HL121212 (PI: Sen Gupta), R01 HL129179 (PI: Sen Gupta, Co-I: Li) ו-R01 HL098217 (PI: Nieman). תוכן פרסום זה הוא באחריות המחברים בלבד ואינו מייצג בהכרח את העמדות הרשמיות של המכונים הלאומיים לבריאות.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
מספריים כירורגיים - טונגסטן קרבידכלים מדעיים עדינים  14502-14מלקחיים מיקרו-אדסון לחתוך ולהחזיק את העור
- משוננים/ישרים/12 ס"מכלים מדעיים 11018-12לחתוך ולהחזיק את העור
Metzenbaum Fino מספריים - טונגסטן קרביד/מעוקל/בוטה-בוטה/14.5 ס"מכלים מדעיים 14519-14   לנתח ולהפריד רקמות רכות
המוסטט דק במיוחד - חלק/מעוגל/12.5 ס"מכלים מדעיים עדינים  13021-12לניתוח והפרדת רקמות רכות
מלקחיים Graefe - משוננים/ישרים/10 ס"מכלים מדעיים 11050-10לניתוח והפרדת רקמות רכות
Dumont #5 מלקחיים עדינים - טיפים לביולוגיה/ישר/אינוקס / 11 ס"מכלים מדעיים עדינים  11254-20 לבודד את כלי הדם מהרקמה המקיפה
מלקחיים #5XL Dumont - טיפים סטנדרטיים/ישר/אינוקס/15 ס"מכלים מדעיים 11253-10כלי מבודד מרקמה מקיפה
וו קהה- 12 ס"מ/0.3 מ"מ קוטר קצהכלי מדע עדין 10062-12כלי בידוד מרקמה מקיפה
מחזיקי מחטים מיקרו Castroviejoמדעיים עדינים  12061-02מחזיקי מחט
חוט תפר 4-0כלי מדע עדין 18020-40לקיבוע החותכות לצלחת
חוט תפר 6-0כלי מדע עדין 18020-60לכל הניתוחים והקשירה
מחטי תפר קאלטכלים מדעיים עדינים  12050-03
רודמין 6G סיגמא83697-1Gלטסיות
דם FeCl3 (נטול מים)סיגמא12321כדי לגרום לפגיעה בכלי הדם
פפברין הידרוכלורידסיגמאP3510לעיכוב תנועתיות המעיים.
עיקור מכשירים כירורגיים של Medline קלטות חיטוי קיטורMedline111625כדי לתקן את העכבר לצלחת
Fisherbrand™   מסנני מזרק - סטרילי 0.22 ומיקרו; מפישר09-720-004לעיקור תמיסות המוזרקות לעכברים
Fisherbrand™   מסנני מזרק - סטרילי 0.45 ומיקרו; מפישר09-719Dלסינון תמיסת FeCl3
כרית הכנה לאלכוהול סטריליפישר06-669-62לעיקור אתר הניתוח
Agarose BioExpressE-3120-500כדי להפוך את שלב הג'ל Leica
DMLFS מיקרוסקופ פלואורסצנטיLeicaמיקרוסקופ תוך-חיוני
פלטפורמת GIBRALTAR ומערכת שלב XY עם צלחת חימום מחוברת.npi אלקטרוני GmbHhttp://www.npielectronic.de/products/micropositioners/burleigh/gibraltar.html
Streampix גרסה 3.17.2 תוכנהNorPixhttps://www.norpix.com/
כלים

מקורות

  1. Sachs, U. J., Nieswandt, B. In vivo thrombus formation in murine models. Circ Res. 100, 979-991 (2007).
  2. Libby, P., Lichtman, A. H., Hansson, G. K. Immune effector mechanisms implicated in atherosclerosis: from mice to humans. Immunity. 38, 1092-1104 (2013).
  3. Ruggeri, Z. M. Platelet adhesion under flow. Microcirculation. 16, 58-83 (2009).
  4. Watson, S. P. Platelet activation by extracellular matrix proteins in haemostasis and thrombosis. Curr Pharm Des. 15, 1358-1372 (2009).
  5. Furie, B., Furie, B. C. Thrombus formation in vivo. J Clin Invest. 115, 3355-3362 (2005).
  6. Li, W., McIntyre, T. M., Silverstein, R. L. Ferric chloride-induced murine carotid arterial injury: A model of redox pathology. Redox Biol. 1, 50-55 (2013).
  7. Ghosh, A., et al. Platelet CD36 mediates interactions with endothelial cell-derived microparticles and contributes to thrombosis in mice. J Clin Invest. 118, 1934-1943 (2008).
  8. Chen, K., et al. Vav guanine nucleotide exchange factors link hyperlipidemia and a prothrombotic state. Blood. , (2011).
  9. Li, W., et al. CD36 participates in a signaling pathway that regulates ROS formation in murine VSMCs. J Clin Invest. 120, 3996-4006 (2010).
  10. Chen, K., Febbraio, M., Li, W., Silverstein, R. L. A specific CD36-dependent signaling pathway is required for platelet activation by oxidized low-density lipoprotein. Circ Res. 102, 1512-1519 (2008).
  11. Kurz, K. D., Main, B. W., Sandusky, G. E. Rat model of arterial thrombosis induced by ferric chloride. Thromb Res. 60, 269-280 (1990).
  12. Konstantinides, S., Schafer, K., Thinnes, T., Loskutoff, D. J. Plasminogen activator inhibitor-1 and its cofactor vitronectin stabilize arterial thrombi after vascular injury in mice. Circulation. 103, 576-583 (2001).
  13. Leadley, R. J. Jr, et al. Pharmacodynamic activity and antithrombotic efficacy of RPR120844, a novel inhibitor of coagulation factor Xa. J Cardiovasc Pharmacol. 34, 791-799 (1999).
  14. Marsh Lyle, E., et al. Assessment of thrombin inhibitor efficacy in a novel rabbit model of simultaneous arterial and venous thrombosis. Thromb Haemost. 79, 656-662 (1998).
  15. Farrehi, P. M., Ozaki, C. K., Carmeliet, P., Fay, W. P. Regulation of arterial thrombolysis by plasminogen activator inhibitor-1 in mice. Circulation. 97, 1002-1008 (1998).
  16. Robertson, J. O., Li, W., Silverstein, R. L., Topol, E. J., Smith, J. D. Deficiency of LRP8 in mice is associated with altered platelet function and prolonged time for in vivo thrombosis. Thromb Res. 123, 644-652 (2009).
  17. Gupta, N., Li, W., Willard, B., Silverstein, R. L., McIntyre, T. M. Proteasome proteolysis supports stimulated platelet function and thrombosis. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 34, 160-168 (2014).
  18. Srikanthan, S., Li, W., Silverstein, R. L., McIntyre, T. M. Exosome poly-ubiquitin inhibits platelet activation, downregulates CD36 and inhibits pro-atherothombotic cellular functions. J Thromb Haemost. 12, 1906-1917 (2014).
  19. Li, W., et al. Thymidine phosphorylase participates in platelet signaling and promotes thrombosis. Circ Res. 115, 997-1006 (2014).
  20. Le Menn, R., Bara, L., Samama, M. Ultrastructure of a model of thrombogenesis induced by mechanical injury. J Submicrosc Cytol. 13, 537-549 (1981).
  21. Li, W., et al. CD36 participates in a signaling pathway that regulates ROS formation in murine VSMCs. J Clin Invest. 120, 3996-4006 (2010).
  22. Re-examining Acute Eligibility for Thrombolysis Task Force. Review, historical context, and clarifications of the NINDS rt-PA stroke trials exclusion criteria: Part 1: rapidly improving stroke symptoms. Stroke. 44, 2500-2505 (2013).
  23. Mumaw, M. M., de la Fuente, M., Arachiche, A., Wahl, J. K. 3rd, Nieman, M. T. Development and characterization of monoclonal antibodies against Protease Activated Receptor 4 (PAR4). Thromb Res. 135, 1165-1171 (2015).
  24. Mumaw, M. M., de la Fuente, M., Noble, D. N., Nieman, M. T. Targeting the anionic region of human protease-activated receptor 4 inhibits platelet aggregation and thrombosis without interfering with hemostasis. J Thromb Haemost. 12, 1331-1341 (2014).
  25. Modery-Pawlowski, C. L., Kuo, H. H., Baldwin, W. M., Sen Gupta, A. A platelet-inspired paradigm for nanomedicine targeted to multiple diseases. Nanomedicine (Lond). 8, 1709-1727 (2013).
  26. Anselmo, A. C., et al. Platelet-like nanoparticles: mimicking shape, flexibility, and surface biology of platelets to target vascular injuries. ACS Nano. 8, 11243-11253 (2014).
  27. Modery, C. L., et al. Heteromultivalent liposomal nanoconstructs for enhanced targeting and shear-stable binding to active platelets for site-selective vascular drug delivery. Biomaterials. 32, 9504-9514 (2011).
  28. Woollard, K. J., Sturgeon, S., Chin-Dusting, J. P., Salem, H. H., Jackson, S. P. Erythrocyte hemolysis and hemoglobin oxidation promote ferric chloride-induced vascular injury. J Biol Chem. 284, 13110-13118 (2009).
  29. Ciciliano, J. C., et al. Resolving the multifaceted mechanisms of the ferric chloride thrombosis model using an interdisciplinary microfluidic approach. Blood. 126, 817-824 (2015).
  30. Barr, J. D., Chauhan, A. K., Schaeffer, G. V., Hansen, J. K., Motto, D. G. Red blood cells mediate the onset of thrombosis in the ferric chloride murine model. Blood. 121, 3733-3741 (2013).
  31. Dunne, E., et al. Cadherin 6 has a functional role in platelet aggregation and thrombus formation. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 32, 1724-1731 (2012).
  32. Lockyer, S., et al. GPVI-deficient mice lack collagen responses and are protected against experimentally induced pulmonary thromboembolism. Thromb Res. 118, 371-380 (2006).
  33. Zhou, J., et al. The C-terminal CGHC motif of protein disulfide isomerase supports thrombosis. J Clin Invest. , (2015).
  34. Eckly, A., et al. Mechanisms underlying FeCl3-induced arterial thrombosis. J Thromb Haemost. 9, 779-789 (2011).
  35. Day, S. M., Reeve, J. L., Myers, D. D., Fay, W. P. Murine thrombosis models. Thromb Haemost. 92, 486-494 (2004).
  36. Cooley, B. C. Murine models of thrombosis. Thromb Res. 129 Suppl 2, S62-S64 (2012).
  37. Gupta, N., Li, W., McIntyre, T. M. Deubiquitinases Modulate Platelet Proteome Ubiquitination, Aggregation, and Thrombosis. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 35, 2657-2666 (2015).
  38. Konstantinides, S., et al. Distinct antithrombotic consequences of platelet glycoprotein Ibalpha and VI deficiency in a mouse model of arterial thrombosis. J Thromb Haemost. 4, 2014-2021 (2006).
  39. Versteeg, H. H., Heemskerk, J. W., Levi, M., Reitsma, P. H. New fundamentals in hemostasis. Physiol Rev. 93, 327-358 (2013).
  40. Yan, S. F., Mackman, N., Kisiel, W., Stern, D. M., Pinsky, D. J. Hypoxia/Hypoxemia-Induced activation of the procoagulant pathways and the pathogenesis of ischemia-associated thrombosis. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 19, 2029-2035 (1999).
  41. Rahaman, S. O., Li, W., Silverstein, R. L. Vav Guanine nucleotide exchange factors regulate atherosclerotic lesion development in mice. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 33, 2053-2057 (2013).
  42. Silverstein, R. L., Li, W., Park, Y. M., Rahaman, S. O. Mechanisms of cell signaling by the scavenger receptor CD36: implications in atherosclerosis and thrombosis. Trans Am Clin Climatol Assoc. 121, 206-220 (2010).
  43. Liu, J., Li, W., Chen, R., McIntyre, T. M. Circulating biologically active oxidized phospholipids show on-going and increased oxidative stress in older male mice. Redox Biol. 1, 110-114 (2013).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

Rhodamine 6GPAR4
מי כלוריד-induced Ferric מודלים פקקת Murine
צור קשר
המלצה לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

2026 © זכויות יוצרים MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.