מאמר שיטה

הערכה מהירה וספציפית של פעילות Halogenating Peroxidase בדגימות דם ליקוציט מועשר

DOI:

10.3791/54484

⸱

28 ביולי 2016

 ,  ,  ,  ,  , 
1Institute for Medical Physics and Biophysics, Medical Faculty, University of Leipzig, 2Fraunhofer Institute for Cell Therapy and Immunology (IZI) Leipzig

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול זה מתאר את ההעשרה המהירה של לויקוציטים מדגימות דם קטנות לקביעה ספציפית לאחר מכן של פעילות הפרוקסידאז ההלוגנטית בתוך התאים. ניתן ליישם את השיטה על חומר אנושי ולא אנושי ועשויה לתרום להערכה של סמנים דלקתיים חדשים.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

במאמר זה פרוטוקול להעשרה המהירה ואחידה של לויקוציטים מדגימים דם קטן שלם מתואר. הליך זה מבוסס על תמוגה hypotonic של אריתרוציטים וניתן להחיל דגימות אנושיות וכן דם ממקור לא אנושי. היקף המדגם הראשוני הקטן של כ 50 עד 100 μl עושה בשיטה זו החלימה על דגימת דם חוזרת ונשנית בחיות מעבדה קטנות. יתר על כן, העשרה לויקוציטים מושג בתוך דקות ועם מאמצי חומר נמוכים לגבי כימיקלים ומיכשור, מה שהופך שיטה זו ישימה בסביבות מעבדה מרובה.

טיהור סטנדרטי של לויקוציטים הוא בשילוב עם שיטת מכתים בררנית במיוחד לשם הערכת הפעילות peroxidase halogenating של peroxidases heme, myeloperoxidase (MPO) ו peroxidase אאוזינופילים (EPO), כלומר, היווצרות של hypochlorous וחומצה hypobromous (HOCl ו HOBr). בעוד MPO לידי ביטוי בולט neutrophils, סוג תא החיסון הנפוץ ביותר בדם אנושי וכן מונוציטים, האנזים הקשור EPO מתבטא באופן בלעדי אאוזינופילים. פעילות halogenating של אנזימים אלה מופנה באמצעות כמעט HOCl- ו HOBr ספציפי וההעמסה לצבוע aminophenyl (APF) ואת מי חמצן מצע peroxidase העיקרי. לאחר ניתוח cytometry זרימת לאחר כל התאים peroxidase-חיובי (נויטרופילים, מונוציטים, אאוזינופילים) וניתן להבחין ופעילות peroxidase halogenating שלהם ניתן לכמת. מאז מכתים APF ניתן בשילוב עם יישום של סמנים פני התא, פרוטוקול זה יכול להתארך להתייחס-שברים תת לויקוציטים במיוחד. השיטה ישימה לזהות HOCl ו HOBr ייצור הוא אדם והן לויקוציטים מכרסמים.

לנוכח התפקיד החיסוני דן בהרחבה מגוונת של מוצרים האנזימטית אלה במחלות דלקתיות כרוניות, פרוטוקול זה עשוי לתרום להבנה טובה יותר שלהרלוונטיות אימונולוגיים של peroxidases heme הנגזרות לויקוציטים.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

לויקוציטים polymorphonuclear (PMNs, המכונה גם גרנולוציטים) ומונוציטים מייצגים מרכיבים תאיים חשובים של מערכת החיסון המולדת של 1,2 דם. הם לתרום להגנה העיקרית נגד פתוגנים כמו גם ההפעלה של מערכת החיסון הנרכשת ואת החניכה של תגובה סיסטמית דלקתית 2-4. זאת במיוחד נויטרופילים, הסוג הנפוץ ביותר של גרנולוציטים, מונוציטים ו גם לתרום באופן משמעותי ברגולצית סיום האירועים דלקתיים חריפים 5. לכן תאים אלה יכולים גם לשחק תפקיד חשוב במחלות דלקתיות כרוניות כמו 6,7 דלקת מפרקים שגרונית. למעשה, אסטמה, מחלה דרך נשימה דלקתית כרונית, מתאפיין אפופטוזיס לקוי של אאוזינופילים, סוג גרנולוציט השני הכי בדם 8. עם זאת, אפופטוזיס של גרנולוציטים וההסרה המהירה שלהם על ידי מקרופאגים הם שני צעדים חיוניים במהלך הסיום הסלולרשל דלקת 9-11.

בתאים בשם החיסון שני אנזימים קשורים זה לזה, כלומר myeloperoxidase (MPO, נויטרופילים ומונוציטים) ו peroxidase אאוזינופילים (EPO, אאוזינופילים) ניתן למצוא 12,13. Peroxidases heme אלה קשורים באופן קלאסי לתגובה הלחות החיסונית: הם שני-אלקטרונית לחמצן (פסאודו) הלידים אל (פסאודו) היפו המתאים חומצות halous אשר ידועים בתכונות bactericidal שלהם 14-16. בתנאים פיסיולוגיים צורות MPO בעיקר חומצת hypochlorous (HOCl) ו hypothiocyanite (- OSCN) בעוד החומצה האחרונה ו hypobromous (HOBr) נוצרת על ידי EPO 17-19. תוצאות חדשות מרמזות כי (פסאודו) זו פעילות אנזים halogenating עשויה גם לתרום הסדרת תגובות דלקתיות של סיום הכהונה של תגובות חיסוניות 20,21. למעשה, הפקת HOCl ידי MPO ומוצרי שמקורם הוצגה לדכא מבוסס תאי T תגובות אדפטיבית חיסוניות 22-24.

על מנת לקבל יותר תובנות לתוך התפקיד החיסוני של לויקוציטים ממערכת החיסון המולדת ב מחלות דלקתיות כרוניות ולקבוע את תרומת MPO ו EPO כדי תפקוד פיזיולוגי זה פיתחנו שיטה להעשיר לויקוציטים במהירות מדגימות דם קטנים למשך ספציפיים הבאים קביעת פעילות peroxidase halogenating בתאים אלה. דלדול כדורי בחרנו שיטה סטנדרטית כולל צעדי תמוגה hypotonic שני שלאחר מכן עם מים מזוקקים, מה שמוביל העשרה לויקוציטים מהיר ובעלויות חומר נמוכות. לקביעה הבאה של MPO halogenating ופעילות EPO והעמסת aminophenyl לצבוע HOCl- ו HOBr הספציפי (APF) שמשה 25-27. בניגוד יישום השיטות המכתימות peroxidase נוקב 28,29, גישה זו מאפשרת זיהוי סלקטיבי של פעילות peroxidase halogenating, אשר נפגע לעתים קרובות infl החמורהammation 30,31.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כל הדגימות דם אדם התקבלו מתנדבים בריאים, ואת פרוטוקול העשרה לויקוציטים להחיל פועל בהתאם להנחיות של ועדת האתיקה של הפקולטה לרפואה של אוניברסיטת לייפציג. הניסויים עם דם עכברוש אושרו על ידי ועדת האתיקה המקומית האחראית (Landesdirektion Sachsen, "רפראט 24), על פי ההנחיות הגרמניות על טיפול בבעלי חיים ולשימוש.

1. התקנה ניסיונית

הערה: ככל הליך תמוגה hypotonic עבור הדלדול של אריתרוציטים מן דגימות הדם הוא הליך קריטי בזמן, להכין את כל הציוד הדרוש (למשל, מאגרים) עבור חלק זה של הפרוטוקול מראש.

  1. לייבל אחד 15 מיליליטר צינור צנטריפוגות במשך תמוגה hypotonic צינור דגימה אחת 1.5 מיליליטר עבור והעמסת aminophenyl עוקבת (APF) מכתים לדגימת דם.
    1. אם העשרה לויקוציטים יבוצע בתנאים סטריליים, לבצע תיוג זה תחת זרםקופסא.
  2. הכן על 12 מ"ל פוספט שנאגרו מלוחים (PBS, 10 מ"מ) לדגימה. תלוי אם לויקוציטים יבודד בתנאים סטריליים או לא, להכין PBS או באמצעות פתרון מוכן סטרילי מן הספק או על ידי המסת טבליות PBS במים מזוקקים. בדוק את ערך ה- pH, ובמידת הצורך, להסתגל pH 7.4 באמצעות כמויות קטנות של 0.1 M פתרונות HCl ו NaOH.
    1. ממיסים טבליות PBS (ראו טבלה של חומרים) ב 200 מ"ל מים מזוקקים כדי להשיג פתרון חיץ שאינו סטרילי מספיק לכ 16 דגימות. אם תרצה, לעקר את הפתרון הזה על ידי סינון סטרילי.
  3. הכן על 1 מיליליטר תמיסת מלח מאוזן הנקס (HBSS) השלימה עם Ca 2 + לדגימה.
    1. ממיסים 970 מ"ג מלח HBSS ב 100 מ"ל (נפח סופי) מים פעמיים מזוקקים. לפני מילוי עד נפח הסופי, לבדוק את ערך ה- pH ולהתאימו pH 7.4. בשל קיבולת החיץ הנמוכה שלה, להכין חיץ זה טרי כל יוםd לבצע את התאמת ה- pH עם טיפול מיוחד באמצעות כמויות קטנות של 0.1 M HCl ו NaOH פתרונות.
      הערה: פתרון סטרילי ניתן להשתמש, בהתאם הניסוי. הפתרון עשוי להיות מעוקר על ידי סינון סטרילי.
  4. מלבד שני מאגרים, התווית להכין צינור (למשל, 50 מ"ל צינור צנטריפוגה) או בקבוק (למשל, 250 מ"ל לכוס מידה) עם מים מזוקקים פעמיים עבור ההליך תמוגה hypotonic מראש. הכן על 10 מ"ל מים לדגימה.
  5. כן מכל עם קרח כתוש עבור מכתים APF (סעיף 3), אשר מבוצע על קרח.
  6. כן aliquots של APF מראש כדי לאפשר ההכנה המהירה של פתרונות עובדים בשימוש במהלך המכתים (שלב 3.2) וכדי למנוע מקפיא פשרה שוב ושוב של פתרון APF.
    הערה: APF מתקבל בכינויו 5 מ"ג / מ"ל ​​(11.81 מ"מ) פתרון המניות ב אצטט מתיל.
    1. להקפיא aliquots של 10-100 μl ב 0.5 מ"ל צינורות. עבור APF מכתים סופיריכוז לצבוע של 10 מיקרומטר משמש (שלב 3.8).

2. תמוגה hypotonic של אריתרוציטים

הערה: בצע את שלבי תמוגה hypotonic (למעט צעדי צנטריפוגה) תחת ספסל זרימה למינרית כדי למנוע זיהום. בצע את ההליך כולו בטמפרטורת החדר. כמו תמוגה hypotonic הוא תהליך קריטי הזמן, להתאים את טפטפות מים (2 מ"ל) ו PBS (5 מ"ל) בנוסף מראש ולפתוח המים צלוחיות PBS לפני שתתחיל בהליך. אחסן את הפתרון PBS ואת מים מזוקקים בטמפרטורת החדר לפני השימוש.

  1. מתוך כל העברת דגימת דם 100 μl אל הצינור 15 מ"ל צנטריפוגה המתאים.
    הערה: בניסויים שלנו דגימות דם בדרך כלל מכילות 10 U / ml של הפרין כדי למנוע קרישה. זאת בשל מקורות שונים של החומר מדגם האופי והריכוז של הקרישה אנטי עשויים להיות שונה. השפעתו על מכתים APF צריך להיבדק על ידי comparing התוצאות לתוצאות שהושגו מדגימות דם בתוספת סוגים או ריכוזים אחרים של קרישה אנטי.
  2. הוסף 2 מ"ל מים מזוקקים ומערבבים דגימות באמצעות מערבל מערבולת מוגדרת לרמה בינונית. דגירה דגימות עבור 60 שניות, ולאחר מכן להוסיף 5 מ"ל PBS לדגימה ומערבבים בעזרת מערבל מערבולת.
    הערה: עד כ -5 דוגמאות ניתן להכין במקביל. לשמור על הסדר המדגם זהה עבור התוספת של מי PBS להשיג פעמי דגירה דומות.
  3. לאחר ההתחדשות של תנאים איזוטוני על ידי תוספת PBS (שלב 2.2) גלולה תאים שלמים שנותרו כל הדגימות על ידי צנטריפוגה במשך 6 דקות בטמפרטורת החדר ו- g x 450.
  4. הסר את supernatant על ידי שפיכה אותו לפח פסולת שולחן. להסיר כמה שיותר נוזלים ככל האפשר על ידי צינור היפוך צנטריפוגה קשה על זה שפונה אל מגבת נייר. ודא כי התא גלולה יבש ככל האפשר.
  5. חזור על תהליך תמוגה hypotonic כפי שתואר קודם לכן (שלב 2.2).
    NOTE: בעיקרון זה הליך תמוגה hypotonic (שלבי 2.3 עד 2.5) יוכל לחזור על עצמו יותר מפעם אחת, תלוי הטוהר של שבר לויקוציטים מעורב כדי להתקבל. לאחר שני תמוגה צעדי חלקיו של נותרים אריתרוציטים בשבריר התא המעורב המתקבל הוא כ -25%.
  6. גלולת התאים השלמים שנותרו על ידי צנטריפוגה במשך 6 דקות בטמפרטורת החדר ו- g x 450. הסר את supernatant (ראה שלב 2.4). הוסף 500 μl HBSS כדי גלולה בעדינות לפזר אותו עד למציאת פתרון הומוגני מתקבל. העברת כל מדגם צינור 1.5 מ"ל מדגם ולסמן אותם בהתאם.
  7. בהתאם הניסוי לנתח דגימות שהתקבלו ישירות (למשל, באמצעות cytometry זרימה) 25, כתם עם נוגדנים שכותרתו פלואורסצנטי (לזיהוי סוגי תא בודדים) 32, דגירה עם גירויי תא (לניסויי הפעלת תא) 33 או מאוחסן על קרח ושימוש יותר מאוחר. בהתאם מטרת המחקר, מיד לבצע ניסויים מאוחרים יותר עליש שבר לויקוציטים מעורב מאז גרנולוציטים קצר למדי מחצית חיים של כ -20 שעות.
    הערה: זה נכון גם לגבי מכתים peroxidase הפעולה המפורט להלן.

3. Halogenating Peroxidase פעילות מכתים

הערה: HOCl- ו HOBr הייצור ידי peroxidases heme נגזר-דם MPO ו EPO היא לכמת באמצעות APF, אשר הוא מתחמצן ל והעמסת ידי חומצות hypohalous בשם. לכן אם תיוג תא עם נוגדנים שכותרתו קרינה מבוצע בשילוב עם מכתים APF, להימנע fluorophores כי להפריע לאות הפליטה וההעמסה.

  1. בצע מכתים APF ב 4 ° C על הקרח.
  2. להכנת פתרון עבודה של APF להפשיר aliquot המתאים של צבע (למשל, 10 μl, 11.81 מ"מ) ו לדלל אותו עם HBSS בדיוק 1 מ"מ (למשל, להוסיף 108.1 חיץ μl אל 10 μl).
    1. עבור כל דגימה (500 פתרון התא μl) להכין 5 μl של הפתרון עובד APF תיאר. בהתאם לכך, השתמש באחת 10 aliquot μl של APF (11.81 מ"מ), אשר מניב 118.1 הפתרון עובד APF μl (1 מ"מ) כדי להכין כ -20 דגימות. בשל אובדן במהלך pipetting להכין כ -10% יותר פתרון APF עובד מ מחושב.
  3. כדי לבדוק את הספציפיות peroxidase של מכתים APF, להכין דגימות בקרה עם hydrazide חומצה 4-aminobenzoic מעכב peroxidase heme (4-ABAH) 35.
    1. הכן פתרון מניות 1 M של 4-ABAH (151.17 g / mol) ב sulfoxide דימתיל (DMSO) על ידי דילול 75.6 מ"ג 4-ABAH ב 500 μl ממס. בהמשך לדלל 4-ABAH 1/10 ב HBSS.
  4. לעריכת תווית פתרון H 2 O 2 עבודה שני צינורות 1.5 מ"ל צנטריפוגה עם "70 מ"מ H 2 O 2" ו "7 מ"מ H 2 O 2", בהתאמה.
    1. בצינור שכותרתו "70 מ"מ H 2 O 2", לדלל טרי 10 μlשל פתרון המניות 30% (8.8 מ"מ) של H 2 O 2 באמצעות 990 μl מים מזוקקים כדי לקבל ריכוז של כ -88 מ"מ. חנות על הקרח ולהשתמש תוך 4 שעות.
      הערה: H 2 O 2 מועברת בדרך כלל כפתרון מניות 30% על ידי הספקים. כאשר מאוחסנים 4 ° C, הוא יציב במשך כ -3 שנים. בצע דילולים של H 2 O 2 במים מזוקקים כדי למנוע ריקבון. H 2 O 2 דילולים יכולים גם להיות מוכנים ב 0.1 פתרון M NaOH.
    2. לקביעת ריכוז מדויק H 2 O 2 להכין דילול 1 עד 10 עוד מפתרון המניות הראשונה H 2 O 2 (כ -88 מ"מ) על ידי הוספת 100 μl מפתרון זה ל -900 μl מים מזוקקים בצינור 1.5 מ"ל שכותרתו "7 מ"מ H 2 O 2".
    3. קלט ספקטרום בטווח UV ליד (למשל, 200-300 ננומטר) באמצעות פוטו UV-Vis ולהשתמש את הספיגה ב 240 ננומטר (49; 240 = 34 M -1 cm -1) כדי לקבוע את ריכוז בפועל H 2 O 2 בתמיסת המניות השנייה H 2 O 2 34. ודא קובט הפניה מכיל מים מזוקקים בלבד. עבור cuvettes קוורץ שימוש מדידה כמו ספקטרום בטווח UV נרשם.
    4. מתוצאה זו, לחשב את הריכוז המדויק של שני פתרונות מניות H 2 O 2. התאם את הריכוז של פתרון המניות הראשון במדגם צינור "70 מ"מ H 2 O 2" בדיוק 70 מ"מ על ידי הוספת כמות מתאימה של מים מזוקקים. אחסן את הפתרון עובד המתקבל על קרח ולהשתמש תוך שעה אחת.
  5. הוסף 5 μl של הפתרון עובד 4-ABAH (100 מ"מימ) על הדגימות המתאימות לריכוז סופי של 1 מ"מ. דגירת הדגימות במשך 15 דקות ב 37 מעלות צלזיוס בחממה לפני כן APF.
  6. הוסף 5 הפתרון עובד APF μl (1 מ"מ) לכלמדגם 500 μl כדי להשיג ריכוז לצבוע סופי של 10 מיקרומטר. מערבב את הדגימות בעדינות (למשל, על ידי שימוש מערבל המערבולת על הגדרה בינונית) דגירה במשך 30 דקות ב 37 מעלות צלזיוס.
  7. הוסף 5 μl H 2 O פתרון עובד 2 (70 מ"מ) מדגם 500 μl ריכוז סופי של 700 מיקרומטר. בעדינות מערבבים את דגימות דגירה אותם במשך 60 דקות ב 37 מעלות צלזיוס. בצע מדידות בקרה נאותות במקביל.
    הערה: מדידות בקרה הראה כי 700 מיקרומטר H 2 O 2 אינם רעילים עבור התאים. גם לא היו כל תגובות הסלולר משמעותיות ציינו.
    הערה: מכתים APF יכול גם להתבצע על ידי השמטת התוספת של H 2 O 2, תלוי בשאלה המדעית. בהיעדר חמצן מימן MPO chlorinating הבזליים רק ופעילות EPO נקבע תוך התוספת של H 2 O 2 מאפשרת זיהוי של ייצור HOCl ו HOBr המקסימאלי על ידי התאים. Tהוא אחרון פירושו אות ניאון גבוהה משמעותי.
  8. לקבלת pelleting התאים, צנטריפוגות את הדגימות למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר 400 x גרם. ביסודיות להסיר את supernatant מבלי להרוס את הגלולה ולהוסיף 250 μl HBSS כדי resuspend תאים.
    הערה: הדגימות מוכנות כעת לניתוח באמצעות זרימת cytometry 25.
  9. אחסן את הדגימות בחושך עד לניתוח כדי למנוע הלבנה. לאחר עירור ב 480-490 ננומטר לזהות את פליטת והעמסת בסביבות 525 37 ננומטר.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כפי שדווח בעבר השיטה המתוארת לעיל התבררה לחול הן אדם וכדי לא אנושי חומר 32. יתר על כן, כפי שמוצג על עכברים עם סימפטומים אסתמטיים המכתים APF עשוי להיות כלי מתאים כדי לזהות הבדלים במעמד פרו-הדלקתי המערכתי. לכן במחקר שלאחר מכן השתמשנו בפרוטוקול זה שוב ושוב להעריך את פעילותו halogenating של MPO (ו EPO) בחולדות נקבות Dark agouti עם דלקת הנגרמת pristane (PIA). דוגמה מייצגת של העשרת לויקוציטים והכתים שבוצעו במהלך ניסוי זה מוצג

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כפי נויטרופילים הם לויקוציטים הנפוצים ביותר בדם אנושי הבידוד של תאים חיוביים peroxidase לעתים קרובות מתמקד רק תאים אלה וכולל הפרדה של נויטרופילים מ לויקוציטים אחרים על ידי צנטריפוגה שיפוע צפיפות 38. עם זאת, כפי נויטרופילים הם הרבה פחות בשפע בדגימות דם בעכברים 39 עבור השיטות מורכבות יותר האחרונות צריכים לשמש 40. יתר על כן, בשני השיטות גם להביא להעברתם של מונוציטים חיוביים peroxidase ממדגמים ו, בשל הצורך של כרכי דם גדולים יותר (למשל, 400 μl ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למחברים אין מה לחשוף.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עבודה זו התאפשרה הודות למימון של משרד החינוך והמחקר הפדרלי הגרמני (BMBF, 1315883) וכן על ידי פרויקט Sächsische Aufbaubank (SAB) 100116526 ממימון של הקרן האירופית לפיתוח אזורי (ERDF).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
חומרים/ציוד
15 מ"ל צינורות צנטריפוגהVWR/Corning734-0451-1.5
מ"ל צינורות דגימהVWR/Eppendorf211-2130DE-Pipettes
לנפחים של עד 5 מ"לEppendorfלמשל , 3120000070אנו משתמשים ב- Eppendorf Resarch פלוס פיפטות עם נפחים מתכווננים בטווח 1-10 ומיקרו; l, 10-100 ומיקרו; l, 100-1,000 ומיקרו; l 500-5,000 ומיקרו; l
ספסל זרימה למינריתThermo Electron CorperationHeraSafe-Vortex
מערבלבנדר & Hobein AGVortex Genie
2-Tabletop צנטריפוגהKendro מוצרי מעבדהLaborfuge 400Rהצנטריפוגה אמורה להיות מסוגלת לשמש ב-450 x גרם
צנטריפוגה קטנהEppendorf5415Dהצנטריפוגה אמורה להיות מסוגלת לשמש ב-400 x g
חממהHeraeuscytoperm 2הגדרות: 37 & deg; C, 95% לחות, 5% תכולת CO<>2 יש
ספקטרופוטומטר UV-VisVarianCary 50 bioA ספקטרום בין 200 ל-300 ננומטר. לפיכך יש ליישם קובטות קוורץ
ציטומטר זרימהBecton, DickinsonBD Facs Caliburניתן להשתמש בכל ציטומטר זרימה המצויד בלייזר המתאים לעירור של פלואורסצאין (למשל< / em>, לייזר ארגון 488 ננומטר)
<חזק>שם< / חזק><חזק>חברה< /חזק><חזק>מספר קטלוגי< / חזק><חזק>הערות< / חזק>
Chemicals
תמיסת מלח חוצצת פוספט (PBS)תמיסה סטריליתשל אמרסקוK812
תמיסת מלח חוצצת פוספט (PBS)טבליות Sigma-AldrichP4417לפתרון ב-200 מ"ל מים
תמיסת מלח מאוזנת של הנקס (HBSS) עם Ca2+Sigma-AldrichH1387970 מ"ג/100 מ"ל, בדוק בזהירות והתאם את ערך ה-pH ל-7.4
חומצה הידרוכלוריתMerck Millipore1.09057.10001 M תמיסה
נתרן הידרוקסידRiedel-deHaë n30620כדורים מוצקים. לתמיסה של 1 M לפתור 4 גרם/100 מ"ל מים Millipore
Aminophenyl fluoresceinCayman10157תמיסה של 5 מ"ג/מ"ל (11.81 מ"מ) במתיל אצטט, aliquots (למשל 100 µ l) יש להכין ולאחסן בטמפרטורה של -20 מעלות; C
מי חמצןSigma-AldrichH1009תמיסת מלאי זו של 30% תואמת לריכוז של כ-8.8 M. יש להכין דילולים נוספים טריים במים מזוקקים מיד לפני השימוש ולכמת אותם על ידי מדידות ספיגה:
4-aminobenzoic acid hydrazide (4-ABAH)Sigma-AldrichA41909יש להכין תמיסת מלאי ראשונה של 1 M ב-DMSO, שנייה של 100 מ"מ על 1:10 דילול בכימיקלים HBSS
DMSOVWR23500.26-
לרשום, מוכנה לשימוש

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Cline, M. J. Monocytes, macrophages, and their diseases in man. J Invest Dermatol. 71 (1), 56-58 (1978).
  2. Wright, H. L., Moots, R. J., Bucknall, R. C., Edwards, S. W. Neutrophil function in inflammation and inflammatory diseases. Rheumatology. 49, 1618-1631 (2010).
  3. Brinkmann, V., et al. Neutrophil extracellular traps kill bacteria. Science. 303 (5663), 1532-1535 (2004).
  4. Ishihara, K., Yamaguchi, Y., Okabe, K., Ogawa, M. Neutrophil elastase enhances macrophage production of chemokines in receptor-mediated reaction. Res Commun Mol Pathol Pharmacol. 103 (2), 139-147 (1999).
  5. Henson, P. M. Resolution of inflammation. A perspective. Chest. 99 (3 Suppl), 2S-6S (1991).
  6. Lefkowitz, D. L., Lefkowitz, S. S. Macrophage-neutrophil interaction: a paradigm for chronic inflammation revisited. Immunol Cell Biol. 79 (5), 502-506 (2001).
  7. Wright, H. L., Moots, R. J., Edwards, S. W. The multifactorial role of neutrophils in rheumatoid arthritis. Nat Rev Rheumatol. 10 (10), 593-601 (2014).
  8. Kankaanranta, H., et al. Delayed eosinophil apoptosis in asthma. J Allergy Clin Immunol. 106 (1 Pt 1), 77-83 (2000).
  9. Peng, S. L. Neutrophil apoptosis in autoimmunity. J Mol Med. 84 (2), 122-125 (2006).
  10. Simon, H. U. Neutrophil apoptosis pathways and their modifications in inflammation. Immunol Rev. 193, 101-110 (2003).
  11. Vandivier, R. W., Henson, P. M., Douglas, I. S. Burying the dead: the impact of failed apoptotic cell removal (efferocytosis) on chronic inflammatory lung disease. Chest. 129 (6), 1673-1682 (2006).
  12. Loughran, N. B., O'Connor, B., O'Fagain, C., O'Connell, M. J. The phylogeny of the mammalian heme peroxidases and the evolution of their diverse functions. BMC Evol Biol. 8, 101-115 (2008).
  13. Zámocký, M., Obinger, C. Ch. 2. Biocatalysis based on heme peroxidases. Torres, E., Ayala, E. M. , Springer. 7-35 (2010).
  14. Klebanoff, S. J. Myeloperoxidase-halide-hydrogen peroxide antibacterial system. J Bacteriol. 95 (6), 2131-2138 (1968).
  15. Klebanoff, S. J. Myeloperoxidase: friend and foe. J Leukoc Biol. 77 (5), 598-625 (2005).
  16. Wang, J., Slungaard, A. Role of eosinophil peroxidase in host defense and disease pathology. Arch Biochem Biophys. 445 (2), 256-260 (2006).
  17. Arnhold, J., Furtmuller, P. G., Regelsberger, G., Obinger, C. Redox properties of the couple compound I/native enzyme of myeloperoxidase and eosinophil peroxidase. Eur J Biochem. 268 (19), 5142-5148 (2001).
  18. Bafort, F., Parisi, O., Perraudin, J. P., Jijakli, M. H. Mode of action of lactoperoxidase as related to its antimicrobial activity: a review. Enzyme Res. , 1-13 (2014).
  19. van Dalen, C. J., Whitehouse, M. W., Winterbourn, C. C., Kettle, A. J. Thiocyanate and chloride as competing substrates for myeloperoxidase. Biochem J. 327 (Pt 2), 487-492 (1997).
  20. Arnhold, J., Flemmig, J. Human myeloperoxidase in innate and acquired immunity. Arch Biochem Biophys. 500 (1), 92-106 (2010).
  21. Flemmig, J., Lessig, J., Reibetanz, U., Dautel, P., Arnhold, J. Non-vital polymorphonuclear leukocytes express myeloperoxidase on their surface. Cell Physiol Biochem. 21 (4), 287-296 (2008).
  22. Odobasic, D., Kitching, A. R., Semple, T. J., Holdsworth, S. R. Endogenous myeloperoxidase promotes neutrophil-mediated renal injury, but attenuates T cell immunity inducing crescentic glomerulonephritis. J Am Soc Nephrol. 18 (3), 760-770 (2007).
  23. Odobasic, D., et al. Neutrophil myeloperoxidase regulates T-cell-driven tissue inflammation in mice by inhibiting dendritic cell function. Blood. 121 (20), 4195-4204 (2013).
  24. Ogino, T., et al. Oxidative modification of IkappaB by monochloramine inhibits tumor necrosis factor alpha-induced NF-kappaB activation. Biochim Biophys Acta. 1746 (2), 135-142 (2005).
  25. Flemmig, J., Remmler, J., Zschaler, J., Arnhold, J. Detection of the halogenating activity of heme peroxidases in leukocytes by aminophenyl fluorescein. Free Radic Res. 49 (6), 768-776 (2015).
  26. Flemmig, J., Zschaler, J., Remmler, J., Arnhold, J. The fluorescein-derived dye aminophenyl fluorescein is a suitable tool to detect hypobromous acid (HOBr)-producing activity in eosinophils. J Biol Chem. 287 (33), 27913-27923 (2012).
  27. Setsukinai, K., Urano, Y., Kakinuma, K., Majima, H. J., Nagano, T. Development of novel fluorescence probes that can reliably detect reactive oxygen species and distinguish specific species. J Biol Chem. 278 (5), 3170-3175 (2003).
  28. Presentey, B., Szapiro, L. Heriditary deficiency of peroxidase and phospholipids in eosinophil granulocytes. Acta Haematol. 41, 359-362 (1969).
  29. Undritz, E. The Alius-Grignaschi anomaly: the hereditary constitutional peroxidase defect of the neutrophils and monocytes. Blut. 14 (3), 129-136 (1966).
  30. Kutter, D. Prevalence of myeloperoxidase deficiency: population studies using Bayer-Technicon automated hematology. J Mol Med.(Berl). 76 (10), 669-675 (1998).
  31. Lanza, F. Clinical manifestation of myeloperoxidase deficiency. J Mol Med. 76 (10), 676-681 (1998).
  32. Flemmig, J., et al. Rapid and reliable determination of the halogenating peroxidase activity in blood samples. J Immunol Methods. 415, 46-56 (2014).
  33. Flemmig, J., Remmler, J., Rohring, F., Arnhold, J. (-)-Epicatechin regenerates the chlorinating activity of myeloperoxidase in vitro and in neutrophil granulocytes. J Inorg Biochem. 130, 84-91 (2014).
  34. Beers, R. F., Sizer, I. W. A spectrophotometric method for measuring the breakdown of hydrogen peroxide by catalase. J Biol Chem. 195 (1), 133-140 (1952).
  35. Kettle, A. J., Gedye, C. A., Winterbourn, C. C. Mechanism of inactivation of myeloperoxidase by 4-aminobenzoic acid hydrazide. Biochem J. 321 (2), 503-508 (1997).
  36. Nakazato, T., et al. Myeloperoxidase is a key regulator of oxidative stress mediated apoptosis in myeloid leukemic cells. Clin Cancer Res. 13 (18), 5436-5445 (2007).
  37. Machwe, M. K. Effect of concentration on fluorescence spectrum of fluorescein. Curr Sci. 39 (18), 412-413 (1970).
  38. Hu, Y. Ch. 7. Leucocytes: Methods and Protocols. Ashman, R. B. , Methods in Molecular Biology. Springer. 101-113 (2012).
  39. Zschaler, J., Schlorke, D., Arnhold, J. Differences in innate immune response between man and mouse. Crit Rev Immunol. 34 (5), 433-454 (2014).
  40. Hasenberg, M., et al. Rapid immunomagnetic negative enrichment of neutrophil granulocytes from murine bone marrow for functional studies in vitro and in vivo. PLoS One. 6 (2), e17314(2011).
  41. Mendez-David, I., et al. A method for biomarker measurements in peripheral blood mononuclear cells isolated from anxious and depressed mice: beta-arrestin 1 protein levels in depression and treatment. Front Pharmacol. 4 (124), 1-8 (2013).
  42. Cotter, M. J., Norman, K. E., Hellewell, P. G., Ridger, V. C. A novel method for isolation of neutrophils from murine blood using negative immunomagnetic separation. Am J Pathol. 159 (2), 473-481 (2001).
  43. Dorward, D. A., et al. Technical advance: autofluorescence-based sorting: rapid and nonperturbing isolation of ultrapure neutrophils to determine cytokine production. J Leukoc Biol. 94 (1), 193-202 (2013).
  44. Freitas, M., Lima, J. L., Fernandes, E. Optical probes for detection and quantification of neutrophils' oxidative burst. A review. Anal Chim Acta. 649 (1), 8-23 (2009).
  45. Winterbourn, C. C. The challenges of using fluorescent probes to detect and quantify specific reactive oxygen species in living cells. Biochim Biophys Acta. 1840 (2), 730-738 (2014).
  46. Kusenbach, G., Rister, M. Myeloperoxidase deficiency as a cause of recurrent infections. Klin Padiatr. 197 (5), 443-445 (1985).
  47. Zipfel, M., Carmine, T. C., Gerber, C., Niethammer, D., Bruchelt, G. Evidence for the activation of myeloperoxidase by f-Meth-Leu-Phe prior to its release from neutrophil granulocytes. Biochem Biophys Res Commun. 232 (1), 209-212 (1997).
  48. Whiteman, M., Spencer, J. P. Loss of 3-chlorotyrosine by inflammatory oxidants: implications for the use of 3-chlorotyrosine as a bio-marker in vivo. Biochem Biophys Res Commun. 371 (1), 50-53 (2008).
  49. Gerber, C. E., Kuci, S., Zipfel, M., Niethammer, D., Bruchelt, G. Phagocytic activity and oxidative burst of granulocytes in persons with myeloperoxidase deficiency. Eur J Clin Chem Clin Biochem. 34 (11), 901-908 (1996).
  50. Maghzal, G. J., et al. Assessment of myeloperoxidase activity by the conversion of hydroethidine to 2-chloroethidium. J Biol Chem. 289 (9), 5580-5595 (2014).
  51. Shepherd, J., et al. A fluorescent probe for the detection of myeloperoxidase activity in atherosclerosis-associated macrophages. Chem Biol. 14 (11), 1221-1231 (2007).
  52. Sun, Z. -N., Liu, F. -Q., Chen, Y., Tam, P. K. H., Yang, D. A highly specific BODIPY-based fluorescent probe for the detection of hypochlorous acid. J Am Chem Soc. 10 (11), 2171-2174 (2008).
  53. Kirchner, T., Flemmig, J., Furtmuller, P. G., Obinger, C., Arnhold, J. (-)Epicatechin enhances the chlorinating activity of human myeloperoxidase. Arch Biochem Biophys. 495 (1), 21-27 (2010).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

APF

מאמרים קשורים