פרוטוקול זה מתאר את ההעשרה המהירה של לויקוציטים מדגימות דם קטנות לקביעה ספציפית לאחר מכן של פעילות הפרוקסידאז ההלוגנטית בתוך התאים. ניתן ליישם את השיטה על חומר אנושי ולא אנושי ועשויה לתרום להערכה של סמנים דלקתיים חדשים.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
הערכה מהירה וספציפית של פעילות Halogenating Peroxidase בדגימות דם ליקוציט מועשר
במאמר זה
סיכום
תקציר
במאמר זה פרוטוקול להעשרה המהירה ואחידה של לויקוציטים מדגימים דם קטן שלם מתואר. הליך זה מבוסס על תמוגה hypotonic של אריתרוציטים וניתן להחיל דגימות אנושיות וכן דם ממקור לא אנושי. היקף המדגם הראשוני הקטן של כ 50 עד 100 μl עושה בשיטה זו החלימה על דגימת דם חוזרת ונשנית בחיות מעבדה קטנות. יתר על כן, העשרה לויקוציטים מושג בתוך דקות ועם מאמצי חומר נמוכים לגבי כימיקלים ומיכשור, מה שהופך שיטה זו ישימה בסביבות מעבדה מרובה.
טיהור סטנדרטי של לויקוציטים הוא בשילוב עם שיטת מכתים בררנית במיוחד לשם הערכת הפעילות peroxidase halogenating של peroxidases heme, myeloperoxidase (MPO) ו peroxidase אאוזינופילים (EPO), כלומר, היווצרות של hypochlorous וחומצה hypobromous (HOCl ו HOBr). בעוד MPO לידי ביטוי בולט neutrophils, סוג תא החיסון הנפוץ ביותר בדם אנושי וכן מונוציטים, האנזים הקשור EPO מתבטא באופן בלעדי אאוזינופילים. פעילות halogenating של אנזימים אלה מופנה באמצעות כמעט HOCl- ו HOBr ספציפי וההעמסה לצבוע aminophenyl (APF) ואת מי חמצן מצע peroxidase העיקרי. לאחר ניתוח cytometry זרימת לאחר כל התאים peroxidase-חיובי (נויטרופילים, מונוציטים, אאוזינופילים) וניתן להבחין ופעילות peroxidase halogenating שלהם ניתן לכמת. מאז מכתים APF ניתן בשילוב עם יישום של סמנים פני התא, פרוטוקול זה יכול להתארך להתייחס-שברים תת לויקוציטים במיוחד. השיטה ישימה לזהות HOCl ו HOBr ייצור הוא אדם והן לויקוציטים מכרסמים.
לנוכח התפקיד החיסוני דן בהרחבה מגוונת של מוצרים האנזימטית אלה במחלות דלקתיות כרוניות, פרוטוקול זה עשוי לתרום להבנה טובה יותר שלהרלוונטיות אימונולוגיים של peroxidases heme הנגזרות לויקוציטים.
מבוא
לויקוציטים polymorphonuclear (PMNs, המכונה גם גרנולוציטים) ומונוציטים מייצגים מרכיבים תאיים חשובים של מערכת החיסון המולדת של 1,2 דם. הם לתרום להגנה העיקרית נגד פתוגנים כמו גם ההפעלה של מערכת החיסון הנרכשת ואת החניכה של תגובה סיסטמית דלקתית 2-4. זאת במיוחד נויטרופילים, הסוג הנפוץ ביותר של גרנולוציטים, מונוציטים ו גם לתרום באופן משמעותי ברגולצית סיום האירועים דלקתיים חריפים 5. לכן תאים אלה יכולים גם לשחק תפקיד חשוב במחלות דלקתיות כרוניות כמו 6,7 דלקת מפרקים שגרונית. למעשה, אסטמה, מחלה דרך נשימה דלקתית כרונית, מתאפיין אפופטוזיס לקוי של אאוזינופילים, סוג גרנולוציט השני הכי בדם 8.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
כל הדגימות דם אדם התקבלו מתנדבים בריאים, ואת פרוטוקול העשרה לויקוציטים להחיל פועל בהתאם להנחיות של ועדת האתיקה של הפקולטה לרפואה של אוניברסיטת לייפציג. הניסויים עם דם עכברוש אושרו על ידי ועדת האתיקה המקומית האחראית (Landesdirektion Sachsen, "רפראט 24), על פי ההנחיות הגרמניות על טיפול בבעלי חיים ולשימוש.
1. התקנה ניסיונית
הערה: ככל הליך תמוגה hypotonic עבור הדלדול של אריתרוציטים מן דגימות הדם הוא הליך קריטי בזמן, להכין את כל הציוד הדרוש (למשל, מאגרים) עבור חלק זה של הפרוטוקול מראש.
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
כפי שדווח בעבר השיטה המתוארת לעיל התבררה לחול הן אדם וכדי לא אנושי חומר 32. יתר על כן, כפי שמוצג על עכברים עם סימפטומים אסתמטיים המכתים APF עשוי להיות כלי מתאים כדי לזהות הבדלים במעמד פרו-הדלקתי המערכתי. לכן במחקר שלאחר מכן השתמשנו בפרוטוקול זה שוב ושוב להעריך את פעילותו halogenating של MPO (ו EPO) בחולדות נקבות Dark agouti עם דלקת הנגרמת pristane (PIA). דוגמה מייצגת של העשרת לויקוציטים והכתים שבוצעו במהלך ניסוי זה מוצג
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
כפי נויטרופילים הם לויקוציטים הנפוצים ביותר בדם אנושי הבידוד של תאים חיוביים peroxidase לעתים קרובות מתמקד רק תאים אלה וכולל הפרדה של נויטרופילים מ לויקוציטים אחרים על ידי צנטריפוגה שיפוע צפיפות 38. עם זאת, כפי נויטרופילים הם הרבה פחות בשפע בדגימות דם בעכברים 39 עבור השיטות מורכבות יותר האחרונות צריכים לשמש 40. יתר על כן, בשני השיטות גם להביא להעברתם של מונוציטים חיוביים peroxidase ממדגמים ו, בשל הצורך של כרכי דם גדולים יותר (למשל, 400 μl .......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
למחברים אין מה לחשוף.
תודות
עבודה זו התאפשרה הודות למימון של משרד החינוך והמחקר הפדרלי הגרמני (BMBF, 1315883) וכן על ידי פרויקט Sächsische Aufbaubank (SAB) 100116526 ממימון של הקרן האירופית לפיתוח אזורי (ERDF).
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| חומרים/ציוד | |||
| 15 מ"ל צינורות צנטריפוגה | VWR/Corning | 734-0451-1.5 | |
| מ"ל צינורות דגימה | VWR/Eppendorf | 211-2130DE-Pipettes | |
| לנפחים של עד 5 מ"ל | Eppendorf | למשל , 3120000070 | אנו משתמשים ב- Eppendorf Resarch פלוס פיפטות עם נפחים מתכווננים בטווח 1-10 ומיקרו; l, 10-100 ומיקרו; l, 100-1,000 ומיקרו; l 500-5,000 ומיקרו; l |
| ספסל זרימה למינרית | Thermo Electron Corperation | HeraSafe-Vortex | |
| מערבל | בנדר & Hobein AG | Vortex Genie | |
| 2-Tabletop צנטריפוגה | Kendro מוצרי מעבדה | Laborfuge 400R | הצנטריפוגה אמורה להיות מסוגלת לשמש ב-450 x גרם |
| צנטריפוגה קטנה | Eppendorf | 5415D | הצנטריפוגה אמורה להיות מסוגלת לשמש ב-400 x g |
| חממה | Heraeus | cytoperm 2 | הגדרות: 37 & deg; C, 95% לחות, 5% תכולת CO<>2 יש |
| ספקטרופוטומטר UV-Vis | Varian | Cary 50 bio | A ספקטרום בין 200 ל-300 ננומטר. לפיכך יש ליישם קובטות קוורץ |
| ציטומטר זרימה | Becton, Dickinson | BD Facs Calibur | ניתן להשתמש בכל ציטומטר זרימה המצויד בלייזר המתאים לעירור של פלואורסצאין (למשל< / em>, לייזר ארגון 488 ננומטר) |
| <חזק>שם< / חזק> | <חזק>חברה< / | חזק><חזק>מספר קטלוגי< / חזק> | <חזק>הערות< / חזק> |
| Chemicals | |||
| תמיסת מלח חוצצת פוספט (PBS) | תמיסה סטרילית | של אמרסקו | K812 |
| תמיסת מלח חוצצת פוספט (PBS) | טבליות Sigma-Aldrich | P4417 | לפתרון ב-200 מ"ל מים |
| תמיסת מלח מאוזנת של הנקס (HBSS) עם Ca2+ | Sigma-Aldrich | H1387 | 970 מ"ג/100 מ"ל, בדוק בזהירות והתאם את ערך ה-pH ל-7.4 |
| חומצה הידרוכלורית | Merck Millipore | 1.09057.1000 | 1 M תמיסה |
| נתרן הידרוקסיד | Riedel-deHaë n | 30620 | כדורים מוצקים. לתמיסה של 1 M לפתור 4 גרם/100 מ"ל מים Millipore |
| Aminophenyl fluorescein | Cayman | 10157 | תמיסה של 5 מ"ג/מ"ל (11.81 מ"מ) במתיל אצטט, aliquots (למשל 100 µ l) יש להכין ולאחסן בטמפרטורה של -20 מעלות; C |
| מי חמצן | Sigma-Aldrich | H1009 | תמיסת מלאי זו של 30% תואמת לריכוז של כ-8.8 M. יש להכין דילולים נוספים טריים במים מזוקקים מיד לפני השימוש ולכמת אותם על ידי מדידות ספיגה: |
| 4-aminobenzoic acid hydrazide (4-ABAH) | Sigma-Aldrich | A41909 | יש להכין תמיסת מלאי ראשונה של 1 M ב-DMSO, שנייה של 100 מ"מ על 1:10 דילול בכימיקלים HBSS |
| DMSO | VWR | 23500.26 | - |
מקורות
- Cline, M. J. Monocytes, macrophages, and their diseases in man. J Invest Dermatol. 71 (1), 56-58 (1978).
- Wright, H. L., Moots, R. J., Bucknall, R. C., Edwards, S. W. Neutrophil function in inflammation and inflammatory diseases. Rheumatology. 49, 1618-1631 (2010).
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
