הדו"ח הבא מתאר כיצד לשכפל את מודל המכרסמים של נוירופתיה אופטית איסכמית קדמית לא-עורקית (rNAION), תוך שימוש בפרמטרים המתאימים של צבע, עדשות מגע ולייזר. אנו גם חושפים את השלבים המתאימים להערכת נגע rNAION in vivo.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
המודל המכרסם של Nonarteritic Anterior Ischemic Optic נוירופתיה (rNAION)
במאמר זה
סיכום
תקציר
נוירופתיה אופטית איסכמית קדמית לא-ארטריטית (NAION) היא נגע איסכמי מוקדי של עצב הראייה המשפיע על 1/700 אנשים במהלך חייהם. NAION גורם לבצקת בעצב הראייה, אובדן סלקטיבי של נוירוני תאי הגנגליון ברשתית (RGCs) וניוון של עצב הראייה. פותח מודל מכרסמים של NAION המבטא את רוב תכונות ה-NAION וההשלכות, המתאים הן לחולדות והן לעכברים. מודל זה משתמש ביישום לייזר מוקדי באורך גל של 532 ננומטר כדי להאיר צבע פוטואקטיבי, רוז בנגל (RB), כדי לגרום לנזק נימי ודליפה בעצב הראייה הקדמי הממוקד (האזור הלמינר). לאחר השראת rNAION, יש איסכמיה מוקדמת של עצב הראייה, בצקת בעצב הראייה ודלקת תוך עצבית, ואחריה RGC סלקטיבי ואובדן אקסונלי. מכיוון שעצב הראייה הוא מערכת החומר הלבן של מערכת העצבים המרכזית, מודל ה-rNAION ישים למחקרים מכניסטיים של איסכמיה סלקטיבית של החומר הלבן, כמו גם לניתוחים נוירו-פרוטקטיביים ומנגנונים לטווח קצר וארוך של תגובה גליאלית ועצבית לאיסכמיה.
מבוא
קדמי Nonarteritic נוירופתיה אופטית איסכמית (NAION) היא נגע איסכמי מוקד של החלק הקדמי של עצב הראייה (אונ) 1. NAION הוא הגורם השכיח ביותר לאובדן ראייה קשורת עצב ראייה פתאומי אצל אנשים מעל גיל 50 2. המנגנון הוא האמין להיות תסמונת תא שתוצאתו בצקת intraneural, וגורם דחיסה של הנימים באספקת אקסונים בתוך עצב הראייה 3.
מאז ON הוא למעשה מערכת עצבים מרכזית (CNS) בדרך, את NAION מכרסם מודל (rNAION) ניתן להשתמש כדי לחקור את המנגנונים ותגובות משייכות חומר לבן מבודדות CNS. מודל rNAION עשוי אפוא להיות שימושי לנתח בעיות רבות הקשורות ניזק הקשורים שבץ חומר לבן. ניתן להשתמש בו כדי להעריך אסטרטגיות neuroprotective שונות וסוכני שבץ חומר לבן.
אחד המאפיינים האטרקטיביים ביותר של המודל הוא שזההליך מכאיב, לא פולשנית. כוח לייזר יכול להיות מותאם כדי לייצר תואר שונים של נזק איסכמי. תכונה נוספת היא כי היא מסתמכת על רדיקלים דיסמוטאז המושרה לייזר לפגוע האנדותל נימי, הפקת בתפקוד נימי פרוגרסיבי. זה בצק תפקוד ומתקדם זו כי הוא האמין להיות דומה להפליא למנגנון שגורם NAION. מחקרים הראו כי הוא אינו גורם הקרישה נימי ישירה, אבל פועל דרך שני מנגנונים לפחות: מוות המושרה דיסמוטאז הפשטה של כמה נימי תאי אנדותל 4, ו NFkB (הפקטור הגרעיני כפא-אור-שרשרת-משפר של תאי B מופעל ) קשור תקנה דלקתית למעלה נותרים האנדותל, עם עליות בתחבורה נוזל על פני קרום התא אל interstitium 5. סגירת נימי עצב הראייה והדחיסה שנגרמו בעקבות הצטברות נוזל ביניים איסכמיה ראש עצב ראייה. תמונת סכמטית מוצגתאיור 2. מודל rNAION ניתן להשתמש בשני מיני החולדה ועכבר 6,7, וניתן לשינוי ברמת חומרתה, מתוך נגע קל עד הרס מוחלט, אבל כאבים של עצב הראייה והרשתית, כגון כמו חסימה בעורק המרכזי ברשתית (CRAO).
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
פרוטוקול זה אושר על ידי האוניברסיטה של טיפול בבעלי חיים מוסדיים מרילנד ועדת ניצול (IACUC; בבולטימור, מרילנד, ארה"ב)
1. ניסיוני Set-up
- ערוך עדשות מגע אישיות מעוצב מתוך מ"מ 7 עגול כיתה אופטית ברורה בקוטר פרספקס, בעובי 3 מ"מ. חותך את העדשות העגולות עם מקדחה. השתמש מקדח מקובל כדי להשמיע העיקול הפנימי, ולבסוף למרק את העקומות החיצוניות ופנימיות באמצעות מלטש עדשות מגע של חצץ ultrafine (1000/3000).
- הכן 2.5 מ"מ רוז בנגל (RB) ב- pH 7.4 חיץ מלוחים פוספט (PBS) מראש, מסנן לעקר עם מסנן מזרק 0.45 מיקרון ולאחסן 1 מ"ל aliquots ב -20 מעלות צלזיוס במיכל אור חזק עד 6 חודשים.
הערה: השימוש בבעלי חיים זכר outbred לבקן, כגון ספראג Dawley ממזער את ההבדלים בתגובה תלוי זן, מאפשרת בקלות מוגברת של אינדוקציה ומקטינה את ההשתנות שעלולות להתרחש עם הייחום cycliנקבת ng. - הגדר את תדירות הוכפל נופך אלומיניום ניאודימיום איטריום (FD-YAG) לייזר רפואי עיניים, אשר מייצר אור לייזר 532 ננומטר. הר לייזר על מנורת סדק עיניים Haag-שטרייט באמצעות מתאם לייזר עיניים רגיל. התקן זמין מסחרי זו מאפשר הדמיה סימולטני של יישום נקודת עין ליזר של החיה. הלייזר הרפואי יש גם קרן מכוון התמקדות נכונה centration שימוש באותו גודל נקודה כמו אינדוקציה לייזר. פרמטרי כוח הליזר הם כדלקמן:
- לזירוז rNAION עכברוש: להשתמש 500 מיקרומטר נקודה גודל / 50 mW לייזר כוח / 1000 משך msec / 1,000 מרווח msec.
- לזירוז עכבר rNAION: לשנות את גודל הנקודה 300 מיקרומטר עבור דיסק אופטי קטן ולהשאיר ופרמטרים נוספים באותו כהגדרת החולדה.
- משתמשים באופן שגרתי מד הכוח לייזר על מנת להבטיח את תפוקת החשמל לייזר.
2. נוהל ניסיוני
- הפעילו את המחשב לייזרולהקים פרמטר הליזר המתאים. מומלץ לחמם את לייזר לפני השימוש חמש דקות לפחות.
- לשקול את החיה על מנת לקבוע את המינון המתאים עבור קטמין / xylazine וצבע RB. להרדים את החיה על ידי הזרקת intraperitoneal של תערובת 1 מ"ל / ק"ג של 80 מ"ג / מ"ל קטמין ו xylazine 4 מ"ג / מ"ל.
- השאר את החיה בכלוב מחומם עד בהרדמה מלאה. בדקו אם אין תגובה לגירויים מרתיעים (זנב או קמצוץ בוהן). בדוק חיות עבור עומק ההרדמה כל 10 דקות.
- להרחיב את התלמידים של החיה עם 1% tropicamide ו להרדים את השטח של העין עם 0.5% proparacaine. אם השימוש בבעלי חיים פיגמנט, כגון לונג אוונס, טיפות עיניים 2.5% neosynephrine יגדל הרחבת אישון.
- השתמש במספריים לחתוך את הזיפים קרובים הלוע בצד כדי להיגרם למנוע חסימת הנוף.
- שים טיפת 1% methylcellulose או ירידת צימוד עיניים אחרת לחלק הפנימי של עדשת מגע מחוייט, ולאחר מכן להחיל את העדשה על tהוא עין עכברוש.
- מניח את החיה על פלטפורמה המותאמת לגובה של מנורת הסדק. הגדר את הראש של החיה בזווית של 45 מעלות, כך העין הוא בניצב מנורת סדק ו קרן לייזר.
- דמיינו את העין דרך מנורת סדק עיניים. ודא קרן המכוונת הוא בגודל הנכון וכן ממוקד מרוכז ישירות על העצב דמיין האופטי. צלם את הפונדוס הרשתית באמצעות מצלמה דיגיטלית עם גבוה אס"א (1,200 - 2,000) מהירות רכובה על אחת יצירות העין של מנורת הסדק עם מתאם בהתאמה אישית.
הערה: היכולת לראות את כלי כורואידלית חושפת את השקיפות של הרשתית. זהו סימן חשוב כדי להיות מסוגל לזהות איסכמיה ברשתית לאחר מכן, אשר יכולה לבלבל את הפרשנות אם היא מתרחשת. rNAION הוא איסכמיה עצב ראייה, שתוצאתה אובדן RGC המבודד, בעוד שתוצאות איסכמיה ברשתית לניזק ברשתית המשפיעים כל התאים של שכבות הרשתית הפנימיות. - לחלופין, תמונה נוספת הרשתיתעצב הראייה באמצעות טומוגרפי קוהרנטיות ספקטרלי אופטי-דומיין (SD-Oct 8) כדי להעריך את העין הנגרמת האו"ם. סרוק אן-פאס (איור 3B) וכן 7 סריקות חתך דרך הרשתית (איור 3 ג). הדמית SD-Oct משתמשת באותו עדשות מגע המשמשות לזירוז ליזר.
- להזריק 1 מ"ל / ק"ג RB לווריד דרך וריד הזנב, ולחכות 30 שניות, ולאחר מכן להפעיל את כוח לייזר. עיכוב זמן זה מאפשר RB להפיץ באופן שווה על פני המחזור. אנו משתמשים דופק ליזר 50 mW באחד שניות / דופק. האנרגיות רבתי (≥ 60 mW) עלולה לגרום נזק הרשתית או לגרום איסכמיה וסקולרית רשתית.
זהירות: לוודא שכולם יש זוג משקפיים סינון בטיחות לייזר של אורך הגל חסימת הנאותים כדי למנוע אור לייזר תועה הזנת העין של החוקר.
הערה: ממשל לייזר חייב להינתן במהירות לאחר ההזרקה IV RB מאז לצבוע מסולק במהירות מהמחזור. ככל אינדוקצית הליזר, חמור יותר איסכמיה עצב הראייה. באופן כללי, בעלי חיים מקבלים 7 - 12 פולסים שניים ברצף מהיר. המגע של אור לייזר עם צבע במחזור נותן כלי עצב הראייה זוהר זהוב יפה כי ניתן לראות דרך מנורת סדק (איור 4B). זה מוכיח לצבוע הוזרק מערכתי ומופץ לתוך זרם הדם. אם הזוהר הוא קלוש, או בכלל (איור 4 א), לצבוע לא הוזרק לווריד. במקרה זה, לא נותנים זריקה שנייה מיד, מאז החיה תצטרך להתאושש במשך יומיים לפחות לפני reinjection. - מיד לאחר אינדוקציה, להסיר את עדשות המגע. מכסים בשני העיניים עם אנטיביוטיקה משולשת עיניים (וכוהל / polymyxin / Bacitracin) משחה עם dexamethasone, ומקום חי על כרית חימום על 37 מעלות צלזיוס בתוך כלוב שוכן יחיד תחת השגחה צמודה עד להחלמה מלאה.
- נקו את עדשות המגע עם מזוקקים wאטר ולנגב יבש עם מטלית ניקוי שאינו שוחקת לשימוש עתידי.
- יומיים לאחר אינדוקציה להעריך את בצקת עצב הראייה על ידי שני בצילום צבעוני הפונדוס ו SD-Oct ניתוח 8.
הערה: השוואת מידת בצקת בעצב הראייה נותן אומדן של חומרת איסכמיה עצב הראייה. בגיל ימים, במרווח דיסק עצב הראייה מטושטש, ואת הוורידים ברשתית מורחבים מעט, לעומת העין הנגדית (un-induced). בצע electroretinography (ERG) ופלאש חזותי עורר פוטנציאל (VEP 11) בשעה שתיים לארבע שבועות לפרסם אינדוקציה לניתוח אלקטרופיזיולוגיה.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
עדשות מגע מופעלת להדמית הרשתית המרכזית (האיור 1). נקודת ליזר המוקדים מאירה את בדיסק האופטי בחלק האחורי של הרשתית (איור 2). רשתית un-induced הנורמלית מוצגת צלמה ידי מיקרוסקופ ביו מנורת סדק (איור 3 א) ועל ידי SD-אוקטובר (איור 3 ב ו -3 ג). במהלך אינדוקצית ליזר, כשאף לצבוע שוהה במחזור, אור הליזר אינו מביא כלי קרינת דיסק (איור 4 א). RB תוך ורידי ואת תאורת לייזר או...
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
אמנם ישנם מספר דגמים של נזק עצבי הראייה (למחוץ עצב הראייה 12, חיתוך רוחב עצב הראייה 13, ו pion 14), המודל rNAION הוא אנושי, להתאמה הן חולדות ועכברים. זה יותר דומה מצבו הקליני בבני האדם של NAION. מצב זה כולל בצקת בעצב הראייה מתקדמת קדמי, תסמונת תא עצב ראייה קדמית, איסכמיה אקסונלית מוקדים, ניזק axonal תא גנגליון ברשתית מבודד והפסד לאורך קורס זמן ממושך. הדו"ח הנוכחי נותן את ההוראות המתאימות אינדוקציה rNAION, דן בעיות פוטנציאליות במהלך אינדוקציה, ...
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
המחברים אין לחשוף.
תודות
אנו מודים תלמידים רבים הבחורים שעבדו לדגם זה כדי לשפר את האפקטיביות שלה, וכדי להבין את דרכי עבודתו. תודה מיוחדת לד"ר של. מרי ג'ונסון (אוניברסיטת מרילנד-בולטימור), ניצה גולדנברג-כהן (בית החולים לילדים שניידרמן, פתח-תקוה, ישראל), צ'ארלס ג'אנג (מדיקל קולג 'איינשטיין, ברונקס, ניו יורק), ואלרי טויטו (Hopital Salpetrie, פריז, צרפת). מחקר זה מומן בחלקו על ידי RO1 EY015304 כדי SLB.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| 50 mW 532 ננומטר לייזר | Iridex | לייזר עיניים סטנדרטי | |
| 0 - 100 mW 532 ננומטר לייזר | טכנולוגיות | תחליף | |
| למתאם מנורת חריץ לייזר | iridex Iridex | SMA מתאם משולב לפלט לייזר | |
| לייזר קוהרנטי Fieldmate לייזר עם חיישן תרמופיל | קוהרנטי | אחרים מתאים גם | |
| בדיקת עיניים מנורת חריץ ביומיקרוסקופ | שונים | Haag-Streit הוא הטוב ביותר; גרסאות זולות יותר זמינות ב- ebay | |
| Rose Bengal | Sigma | 330000-1G | Photoinducing agent |
| Fundus עדשת מגע או כיסוי זכוכית להחליק | מותאם אישית / Cantor and Nissel (בריטניה) | עדשת פלסטיק פלנוקמורה מעוצבת בהתאמה אישית לבדיקת עיניים ואינדוקציה | |
| טרופיקמיד 1% | |||
| תרכובת ליטוש Tamiya | Tamiya, INC | 87068 | ליטוש עדשות מגע |
| 2.5% Hypromellose (Goniovisc)/1% Methycellulose | HUB Pharmaceuticals | חומר צימוד עדשות מגע | |
| 2.5% טיפות עיניים Neosynephrine | מעבדות | חומר מרחיב אישונים | |
| Tropicamide 1% | Alcon labs | חומר מרחיב אישונים | |
| 0.5% פרופרקאין | מעבדות | הרדמה מקומית | |
| 30 גרם מזרק אינסולין מחט התמזגה | שונים | להזרקה תוך ורידית של ורד בנגל | |
| משחה אנטיביוטית אופטאמית בתוספת דקסמתזון (משחה אנטיביוטית משולשת) | שונים | יש למרוח לאחר אינדוקציטון כדי למזער הצטלקות בקרנית | |
| תאגיד היידלברג תחום ספקטרלי-טומוגרפיה קוהרנטית אופטית | היידלברג תאגיד | למדידות קוהרנטיות אופטית בקו הבסיס ואחרי האינדוקציה; לא חיוני לאינדוקציה |
מקורות
- Banik, R. Nonarteritic Anterior Ischemic Optic Neuropathy: An Update on Demographics, Clinical Presentation, Pathophysiology, Animal Models, Prognosis, and Treatment. J. Clin. Experimental Ophthalmol. 10, 1-5 (2013).
- IONDT study group. Characteristics of patients with nonarteritic anterior ischemic optic neuropathy eligible for the Ischemic Optic Neuropathy Decompression Trial. Arch Ophthalmol. 114, 1366-1374 (1996).
- Tesser, R. A., Niendorf, E. R., Levin, L. A. The morphology of an infarct in nonarteritic anterior ischemic optic neuropathy. Ophthalmology. 110, 2031-2035 (2003).
- Bernstein, S. L., Johnson, M. A., Miller, N. R. Nonarteritic anterior ischemic optic neuropathy (NAION) and its experimental models. Prog Retin Eye Res. 30, 167-187 (2011).
- Nicholson, J. D., et al. PGJ2 Provides Prolonged CNS Stroke Protection by Reducing White Matter Edema. PLoS One. 7 (12), (2012).
- Goldenberg-Cohen, N., et al. Oligodendrocyte Dysfunction Following Induction of Experimental Anterior Optic Nerve Ischemia. Invest Ophthalmol Vis Sci. 46, 2716-2725 (2005).
- Bernstein, S. L., Guo, Y., Kelman, S. E., Flower, R. W., Johnson, M. A. Functional and cellular responses in a novel rodent model of anterior ischemic optic neuropathy. Invest Ophthalmol Vis Sci. 44, 4153-4162 (2003).
- Berger, A., et al. Spectral-Domain Optical Coherence Tomography of the Rodent Eye: Highlighting Layers of the Outer Retina Using Signal Averaging and Comparison with Histology. PLoS One. 9 (5), (2014).
- Huang, T. L., et al. Protective effects of systemic treatment with methylprednisolone in a rodent model of non-arteritic anterior ischemic optic neuropathy (rNAION). Exp Eye Res. 131, 69-76 (2015).
- Mantopoulos, D., et al. An Experimental Model of Optic Nerve Head Injury. Invest Ophthalmol Vis Sci. 57, 6222(2014).
- You, Y., et al. Visual Evoked Potential Recording in a Rat Model of Experimental Optic Nerve Demyelination. J. Vis. Exp. (101), e52934(2015).
- Templeton, J. P., Geisert, E. E. A practical approach to optic nerve crush in the mouse. Mol Vis. 18, 2147-2152 (2012).
- Magharious, M. M., D'Onofrio, P. M., Koeberle, P. D. Optic Nerve Transection: A Model of Adult Neuron Apoptosis in the Central Nervous System. J Vis Exp. (51), e2241(2011).
- Wang, Y., et al. A Novel Rodent Model of Posterior Ischemic Optic Neuropathy. JAMA Ophthalmol. 131 (2), 194-204 (2013).
- Huang, T. L., Chang, C. H., Chang, S. W., Lin, K. H., Tsai, R. K. Efficacy of Intravitreal Injections of Antivascular Endothelial Growth Factor Agents in a Rat Model of Anterior Ischemic Optic Neuropathy. IOVS. 56, 2290-2296 (2015).
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
