מאמר שיטה

זיהוי של חלבונים קושרי מולקולה קטנים בסביבה נייד Native ידי תיוג Live- תא Photoaffinity

DOI:

10.3791/54529

⸱

20 בספטמבר 2016

 , 
1Department of Pharmacology and Molecular Sciences, Johns Hopkins University School of Medicine, 2Department of Oncology, Johns Hopkins University School of Medicine

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו מתארים כאן שיטה לזיהוי חלבונים קושרי מולקולות קטנים באמצעות תיוג פוטו-אפיניטי. היתרון בטכניקה זו הוא שקישור ותיוג קוולנטי של חלבוני המטרה מתרחש בסביבה התאית החיה, ומסיר את הסיכון לשיבוש מבנה החלבון המקומי ותנאי הקישור עם ליזיס התאים.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

זיהוי המטרות המולקולריות של מולקולות קטנות הוא צעד מאתגר אך הכרחי להבנת מנגנון הפעולה שלהן. בעוד שמספר שיטות לזיהוי מטרה פותחו ושימשו כדי להבהיר בהצלחה את חלבוני הקישור של מגוון מולקולות קטנות, לטכניקות אלו יש חסרונות שהופכים אותן ללא מתאימות לזיהוי סוגים מסוימים של אינטראקציות קטנות בין מולקולות למטרה. בפרט, אינטראקציות לא קוולנטיות התלויות בתנאים תאיים טבעיים, כגון אלה של חלבוני ממברנה שהמבנים שלהם עלולים להיות מופרעים עם ליזה של תאים, לרוב אינן ניתנות לשיטות זיהוי מטרה מבוססות זיקה. כאן, אנו מדגימים שיטה שבה בדיקה המכילה קבוצה פוטו-לאבילית משמשת לקישור קוולנטי לחלבון קושר המולקולות הקטנות בסביבת התא החי, מה שמאפשר זיהוי ובידוד של חלבון המטרה ללא צורך בשמירה על האינטראקציה לאחר ליזה של תאים. טכניקה זו היא כלי רב ערך לחקר מולקולות קטנות מעניינות מבחינה ביולוגית עם מנגנונים לא ידועים, הן בהקשר של ביולוגיה בסיסית והן בהקשר של גילוי תרופות.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מולקולות קטנות ביו ביסודו לעבוד על ידי אינטראקציה עם ושינוי הפונקציה של אחד או יותר מולקולות "יעד", רוב החלבונים בדרך כלל, בתא. גילוי סמים, כאשר תרכובת פעילה מתגלה באמצעות הקרנת פנוטיפי, הזהות של הנפגע המולקולרי (ים) של המתחם כי הוא חיוני, לא רק להבנת מנגנון פעולה ואת תופעות לוואי אפשריות של המתחם, אלא גם עבור פוטנציאל גילוי ביולוגיה חדשה שבבסיס מודל המחלה ולסלול את הדרך לפיתוח של כיתות מכניסטית חדשות של הרפוי 1. למרות זיהוי המטרה אינו נדרש עבור תרופת לשמש טיפולית, בשנים האחרונות חלה הכרה גוברת כי מועמדי תרופה חדשניים סיכויים טובים יותר להצליח בניסויים קליניים, ולכן להניב תשואות טובות יותר על השקעה, אם יעד תוקף הוא י....

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הערה: פרוטוקול זה הותאם מ מקינון טאונטון 10 לשימוש בתאים חיים.

1. הכנת תאים בתרבית

  1. הכן מאכלי תרבית תאי 6 סנטימטר סטרילי עבור מספר הדגימות הרצויות (ראה להלן).
    הערה: צלחת אחת של תאים משמשת לכל מצב טיפול, אבל אם יותר חלבון נדרש 2 או 3 מנות אפשר להכין לכל מצב ומשולב לאחר קרינת UV.
    1. הכן לפחות 3 מנות של תאים; בקרה שלילית עם DMSO בלבד (D), טיפול Probe בלבד (P), ואת החללית +....

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

התוצאות המוצגות כאן התקבלו עם חללית צילום זיקה של itraconazole התרופה נגד הפטריות, השימוש אשר פורסם בעבר 16. תוצאות אלו מראות את השימוש בטכניקת תיוג לחיות תאי photoaffinity לזהות חלבון מחייב itraconazole גדול בהצלחה כמו חלבון הממברנה 35 kDa מתח-Dependent ערוץ 1 אניון (VDAC1).

בפרוטוקול לעיל בוצע בתאי HEK293T באמצעות החללית itraconazole ע.......

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

גישות שונות לזיהוי המטרות של מולקולות קטנות ניתן לקבץ באופן כללי לשתי קטגוריות: מלמעלה למטה, שם פנוטיפ הסלולר של התרופה משמש כדי לצמצם את המטרות הפוטנציאליות שלה המבוסס על הפונקציות הידועות שלהם, או מלמטה למעלה, כאשר היעד מזוהה ישירות באמצעים כימיים או גנטיים 3. מלמעלה למטה או מחקרים פנוטיפי יכול לזהות תהליכים תאיים מסוימים מושפעים התרופה (למשל, תעתיק / תרגום / סינתזה של DNA, בלוק מחזור התא, מאותת את הפעלת מסלול / עיכוב, וכו ') שעשוי ביסוד פנוטיפ ה.......

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למחברים אין מה לחשוף.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו מודים לד"ר בן נצ'ב על הייעוץ בתכנון פרוטוקול תיוג הפוטו-אפיניטי, לד"ר וויי שי על סינתזה של בדיקת הפוטו-אפיניטיות של איטרקונזול, לד"ר יונגג'ון דאנג על ייעוץ לגבי ניסויי משיכה של זיקה, ולחברים אחרים במעבדת J.O.L. על הערות מועילות ותמיכה. עבודה זו נתמכה בחלקה על ידי מלגת קרן PhRMA בפרמקולוגיה/טוקסיקולוגיה (ל-S.A.H.); מענק המכון הלאומי לסרטן R01CA184103; המכון למחקר רפואי לדיילים; הקרן לסרטן הערמונית (J.O.L.); ומכון ג'ונס הופקינס למחקר קליני ותרגומי, הממומן בחלקו על ידי מענק UL1 TR 001079 מהמרכז הלאומי לקידום מדעי התרגום (NCATS).

....

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
Tris(2-carboxyethyl)phosphine (TCEP)Life Technologies20490הפוך יום שימוש טרי. הכן מלאי של 100 מ"מ במים עם 4 eq NaOH.
טריס[(1-בנזיל-1H-1,2,3-טריאזול-4-יל)מתיל] אמין (TBTA)AnaSpec63360-50 הכן מלאי של 1.7 מ"מ ביחס של 4:1 של t-בוטנול ל-DMSO, אחסן ב-20  °C.
נחושת גופרתית (CuSO4• 5H2O)LabChem, Inc.LC13440-1מכינים מלאי של 50 מ"מ במים, מאחסנים בטמפרטורת החדר.
ביוטין-אזידקליק כלים לכימיהAZ104-100הכן מלאי של 10 מ"מ ב-DMSO, אחסן ב-20  °C.
אלקסה פלואור 647-אזיד Life TechnologiesA10277הכן מלאי 1 מ"מ ב-DMSO, אחסן ב-20  °C.
מנורת UV 365 ננומטריש להרכיב משקפיים חוסמי UVSpectrolineFC100
טבליות מעכבי פרוטאז,11873580001Roche Life Scienceיש להכין תמיסה 50x במים ולאחסן בטמפרטורה של -20  °C.
סוניקטורברנסוןסוניפייר 250מוגדר לתפוקה 1, חובה 30%. 
סורק ג'ל פלואורסצנטיGE Healthcare Life SciencesFLA 9500השתמש בלייזר אדום כדי לזהות Alexa-fluor 647.
ערכת בדיקת חלבון DC תואמת חומר ניקויBio-Rad5000112
חרוזי סטרפטווידין אגרוז בקיבולת גבוהה Life Technologies20359
Dulbecco's Modified Eagles Medium, דל גלוקוזThermoFisher Scientific11885092
סרום בקר עוברי, מוסמךThermoFisher Scientific26140079
תמיסת פניצילין/סטרפטומיציןThermoFisher Scientific15140122
SDS מאגר דגימה (2x)ThermoFisher ScientificLC2676
בזמן ההפעלה. ללא EDTA

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Schenone, M., Dančìk, V., Wagner, B. K., Clemons, P. A. Target identification and mechanism of action in chemical biology and drug discovery. Nat Chem Biol. 9 (4), 232-240 (2013).
  2. Cook, D., Brown, D., et al. Lessons learne....

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

Live cell Photoaffinity LabelingSmall Molecule Target IdentificationPhotoaffinity Probe BindingNative Cellular EnvironmentCovalent CrosslinkingHEK 293 T CellsFluorescent Gel ScanningStreptavidin Agarose BeadsSDS PAGE AnalysisMass Spectrometry Identification

מאמרים קשורים