זיהוי של חלבונים קושרי מולקולה קטנים בסביבה נייד Native ידי תיוג Live- תא Photoaffinity

Summary

אנו מתארים כאן שיטה לזיהוי חלבונים קושרי מולקולות קטנים באמצעות תיוג פוטו-אפיניטי. היתרון בטכניקה זו הוא שקישור ותיוג קוולנטי של חלבוני המטרה מתרחש בסביבה התאית החיה, ומסיר את הסיכון לשיבוש מבנה החלבון המקומי ותנאי הקישור עם ליזיס התאים.

Abstract

זיהוי המטרות המולקולריות של מולקולות קטנות הוא צעד מאתגר אך הכרחי להבנת מנגנון הפעולה שלהן. בעוד שמספר שיטות לזיהוי מטרה פותחו ושימשו כדי להבהיר בהצלחה את חלבוני הקישור של מגוון מולקולות קטנות, לטכניקות אלו יש חסרונות שהופכים אותן ללא מתאימות לזיהוי סוגים מסוימים של אינטראקציות קטנות בין מולקולות למטרה. בפרט, אינטראקציות לא קוולנטיות התלויות בתנאים תאיים טבעיים, כגון אלה של חלבוני ממברנה שהמבנים שלהם עלולים להיות מופרעים עם ליזה של תאים, לרוב אינן ניתנות לשיטות זיהוי מטרה מבוססות זיקה. כאן, אנו מדגימים שיטה שבה בדיקה המכילה קבוצה פוטו-לאבילית משמשת לקישור קוולנטי לחלבון קושר המולקולות הקטנות בסביבת התא החי, מה שמאפשר זיהוי ובידוד של חלבון המטרה ללא צורך בשמירה על האינטראקציה לאחר ליזה של תאים. טכניקה זו היא כלי רב ערך לחקר מולקולות קטנות מעניינות מבחינה ביולוגית עם מנגנונים לא ידועים, הן בהקשר של ביולוגיה בסיסית והן בהקשר של גילוי תרופות.

Introduction

מולקולות קטנות ביו ביסודו לעבוד על ידי אינטראקציה עם ושינוי הפונקציה של אחד או יותר מולקולות "יעד", רוב החלבונים בדרך כלל, בתא. גילוי סמים, כאשר תרכובת פעילה מתגלה באמצעות הקרנת פנוטיפי, הזהות של הנפגע המולקולרי (ים) של המתחם כי הוא חיוני, לא רק להבנת מנגנון פעולה ואת תופעות לוואי אפשריות של המתחם, אלא גם עבור פוטנציאל גילוי ביולוגיה חדשה שבבסיס מודל המחלה ולסלול את הדרך לפיתוח של כיתות מכניסטית חדשות של הרפוי ^1. למרות זיהוי המטרה אינו נדרש עבור תרופת לשמש טיפולית, בשנים האחרונות חלה הכרה גוברת כי מועמדי תרופה חדשניים סיכויים טובים יותר להצליח בניסויים קליניים, ולכן להניב תשואות טובות יותר על השקעה, אם יעד תוקף הוא ידוע ^2. לפיכך, חלה התעניינות גוברת שיטות לזיהוי קטןחלבוני יעד מולקולה.

ניסוי זיהוי מטרות קלסי בדרך כלל מסתמך על טיהור זיקה, שבו המולקולה הקטנה של העניין היא משותקת על שרף וטופחה עם lysates התא כולו, שלאחריו חלבונים מאוגדים נשטפים והחלבונים הנותרים הם eluted וזיהו ^3. בעוד טכניקה זו נעשה שימוש כדי לזהות את המטרות של מולקולות קטנות רבות ^4, הוא אינו מתאים כשיטה מזהה היעד אוניברסלי מכמה סיבות. ראשית, חלבון המטרה חייב לשמור קונפורמציה המקורית שלו על תמוגה תא על מנת לשמר את יכולתה להיקשר המולקולה הקטנה. זה יכול להיות בעייתי במיוחד עבור חלבונים בממברנה, אשר לעתים קרובות לעבור שינויים מרחביים לאחר הוצאתו מסביבת מולדתם, או פשוט המצרפי משקע מתוך פתרון. שנית, המולקולה הקטנה חייבת להיות שינוי כימי בצורה כזו כי זה יכול להיות משותק על השרף תוך שמירהיכולתה לקשור את חלבון המטרה. כיסים מחייבים עמוקים עשויים אפוא להיות נגישים מולקולה קטנה ברגע שהוא מקובע השרף. שלישית, זיקת המחייב חייבת להיות גבוהה מספיק שהאינטראקציה נשמרת במהלך שלבי הכביסה, מה שהופך זיהוי של אינטראקציות זיקה נמוכות מאתגרות. תנאים רביעיים, סביבתיים כגון pH, ריכוז יון, או הנוכחות של מולקולות אנדוגני אחרות יכולים להשתנות מרחבית בתוך התא הם לפעמים תנאים מוקדמים תרופתי-יעד. לכן, מציאת התנאים הנכונים כדי לאפשר ולשמור המחייב החיצוני של התא יכול דורש כמות משמעותית של ניסוי וטעייה.

תיוג Photoaffinity עוקף בעיות אלה בכך שהוא מאפשר הקשר הקוולנטי של מולקולה קטנה היעד שלה בהקשר יליד תא. במקום לשתק המולקולה הקטנה כדי שרף מגושם גדול המולקולה במקום שינוי כימי להתקין שני גרם פונקציונלי קטןroups: א מחצית photoactivatable המאפשר crosslinking קוולנטיים חלבון המטרה כאשר מוקרנים עם אורך גל מסוים של אור, וקבוצת כתב המאפשרת חלבון המטרה כדי להתגלות ובהמשך מבודד. תאי חי מטופלים עם חללית photoaffinity, החללית נקשרה ו Crosslinks קוולנטית חלבון המטרה, והמתחם-החלבון החללי הוא אז מבודד ללא פגע. הספציפי של חללית מחייבת את היעד מודגם על ידי ביצוע ניסוי תחרות במקביל, שבו עודף של תרכובת האב משמש להתחרות במרחק מחייב של חללית חלבון המטרה.

העיצוב וסינתזה של בדיקות photoaffinity משתנה מאוד בין מולקולה קטנה אחת לאחרת, ולא יהיה מכוסה בפרוטוקול זה; עם זאת, מספר דיונים מעולים בנושא פורסמו ^5-9. השיקול העיקרי הוא כי החללית שומרת לעצמה את הפעילות הביולוגית של תרכובת האב, ולכן presumably מחייב לאותו היעד (ים). מבנה-פעילות יחסים (SAR) מחקרים חייבים להתבצע כדי לקבוע אילו חלקים של המולקולה ניתן לשנות ללא הפסד של פעילות ביולוגית. מגוון של קבוצות כימיות שונות שמש crosslinkers photoactivatable, כולל diazirine, benzophenone, ו תזיד aryl, אשר לכל אחד מאתנו יש יתרונות וחסרונות ^10. כמו כן, ישנם תגי הכתב מרובים שנוצלו לבודד חלבונים קושרי החללית. קבוצות Reporter עשויות להיות פונקציונליות בכוחות עצמם, כגון ביוטין נפוץ או תגי פלורסנט, או עשוי להיות מבשרים הדורשים functionalization נוסף לאחר צעד photocrosslinking, אשר יש את היתרון של להיות קטן יותר ולכן פחות סביר להתפשר פעילות ביולוגית ^11.

בפרוטוקול זה, השתמשנו בדיקת photoaffinity המכילה קבוצת diazirine photocrosslinking, וכן אלקין מסוף הקובץ המצורף של קבוצת כתב באמצעות Cu (I) -catalyzed אזיד-אלקין cycloaddition שארפלס-Hüisgen (או לחץ) התגובה ^12-15. מחקרי SAR, לחקור תכנון וסינתזה, ותוצאות המחקרים הללו פורסמו במקומות אחרים ^16-18.

Protocol

הערה: פרוטוקול זה הותאם מ מקינון טאונטון ¹⁰ לשימוש בתאים חיים.

1. הכנת תאים בתרבית

1. הכן מאכלי תרבית תאי 6 סנטימטר סטרילי עבור מספר הדגימות הרצויות (ראה להלן).
   הערה: צלחת אחת של תאים משמשת לכל מצב טיפול, אבל אם יותר חלבון נדרש 2 או 3 מנות אפשר להכין לכל מצב ומשולב לאחר קרינת UV.
   1. הכן לפחות 3 מנות של תאים; בקרה שלילית עם DMSO בלבד (D), טיפול Probe בלבד (P), ואת החללית + מתחרה (C).
   2. לחלופין, להכין צלחת 4 ^th כמו אין שליטת UV, כדי להיות מטופלים עם חללית אבל לא חשוף לאור UV.
      הערה: אם מולקולות מתחרה מרובות הן להיבדק, כגון אנלוגים שונים של המולקולה הקטנה של עניין, להכין צלחות מתחרה נוספות לפי צורך.
2. הוספת תאים HEK293T מנות תרבות בתקשורת תרבות 4 מ"ל. השתמש 3.5 מיליון גאמות לכל צלחת.
   הערה: מספר תאים צריך להיקבע עבור כל סוג תא כך תאים הם כמעט 100% ומחוברות בתחילת הניסוי, על מנת להשיג את תשואת החלבון מקסימלית. לקבלת HUVEC, להשתמש 0.3 מיליון תאים לכל צלחת. קירוב טוב הוא 1/10 של תאים בצלחת ס"מ 15 ומחוברות. תאי HEK293T צריכים להיות מתורבתים ב Modified של Dulbecco נשרים בתוספת בינונית עם 10% עובריים שור סרום (FBS) ו -1% פניצילין / סטרפטומיצין.
3. מחזיר את תאי חממת התרבות (37 מעלות צלזיוס, 5% CO ₂₎ הלילה.

2. טיפול תאי Photocrosslinking

1. למחרת, מראש aliquot התרופות הבאות לתוך צינורות 1.5 מ"ל microcentrifuge:
   1. עבור הטיפול הראשון, להוסיף 4 μl של DMSO ל -2 צינורות 4 μl של 10 מתחרה מ"מ (כלומר, במתחם ההורה ללא שינוי) עד 1 צינור.
   2. לטיפול השני, להוסיף 16 μl של DMSO עד 1 צינור 16 μl של 50 &# 181; M photoaffinity חללי 2 צינורות.
      ההערה: הריכוז האופטימלי עשויה להיות שונה עבור בדיקות שונות (ראה דיון), אבל בין 200-500 ננומטר היא נקודת התחלה טובה (כאן אנו משתמשים 200 ננומטר). ריכוז המתחרה צריך יעלה על זה של החללית לפחות פי 20 (כאן אנו משתמשים 10 מיקרומטר). הריכוז הסופי של DMSO צריך להיות שווה בכל הצלחות לא יעלה על 0.5% (20 נפחי μl).
2. תביאו את צלחות התא לתוך מכסה המנוע תרבית תאים ולהוסיף התרופות מראש aliquoted משלב 2.1.1 כדלקמן: לשאוב 1 מ"ל של התקשורת בתרבות, resuspending התרופה טרום aliquoted בתקשורת, בעדינות הוספתו בחזרה עד טיפת צלחת חכם. מוסיפים את DMSO לצלחת DMSO (D) ואת החללית (P) צלחת, ולהוסיף המתחרה לצלחת התחרות (C). החזר את הצלחות אל האינקובטור התרבות למשך 30 דקות.
3. עם אורות בשכונת התרבות המעומעמת, מוסיף את החללית מראש aliquoted משלב 2.1.2 לחקור (P) וצלחות תחרות (C) ולהוסיף אתDMSO לצלחת DMSO (D), כאמור לעיל. החזר את הצלחות אל האינקובטור התרבות עבור שעה 1.
4. במהלך הדגירה, להכין את הפריטים הבאים: מגש של קרח שיכול להתאים כל הלוחות; קר כקרח חיץ תמוגה (PBS [pH 8.5] + מעכבי פרוטאז 1x קוקטייל [EDTA-שלמה וחופשית, בדילול מפתרון המניות 50x עשה במים]; 200 μl / צלחת); צינורות microcentrifuge שכותרתו D, P, או C עבור כל אחד מתנאי הטיפול השונים, על קרח.
5. 15 דקות לפני סוף דגירת hr 1, להגדיר את מנורת UV (365 ננומטר) בחדר הקר להפעיל אותה כדי לחמם את הנורה.
6. לאחר 1 דגירת שעה עם החללית, למקם מנות על קרח. שוטפים את התאים בעדינות עם 5 מ"ל קר כקרח PBS (pH 7.4) כדי להסיר בדיקה עודף. Re-לכסות את התאים עם 4 מ"ל קר כקרח PBS.
7. מניח את הצלחת של תאים מרוכזים 3 סנטימטרים תחת מנורת UV על גבי שקית קרח כדי למזער חימום מהמנורה. מקרין במשך 3 דקות. מוציאים את המאפה למגש של קרח וחזור עבור כל הדגימות.
8. אהקרנת חרה, לשאוב את PBS מתאי ולהוסיף 200 μl של (pH 8.5) PBS קר כקרח עם מעכבי פרוטאז על כל צלחת. לנתק את התאים מן הצלחת באמצעות גומי מגרד ולהעביר את הצינורות microcentrifuge מראש שכותרתו על הקרח.
9. הוספת SDS לריכוז סופי של 0.4% (10 μl של 10% SDS לתוך 250 μl של המדגם).
   זהירות: אבקת SDS מהווה סכנה. הימנע משאיפת אבקת SDS ידי לובש מסכה על האף והפה.
10. Lyse את התאים על ידי sonicating ההשעיה עבור 10 פעימות (פלט 1, מחזור עבודה 30%) ו דגירה על קרח למשך 1 דקה לפני סיבוב שני של 10 פעימות.
11. במידת הצורך, סר 2 μl של השעיה ולבדוק תחת מיקרוסקופ אור על מנת להבטיח תמוגה תא שלמה.
12. מרתיח את הדגימות על פלטה חשמלית להגדיר עד 95 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות כדי להשלים תמוגה תא לפגל כל החלבונים.
13. למדוד את ריכוז החלבון מדגם באמצעות assay חלבון spectrophotometric תואם-חומרי ניקוי, כגון הדואר חלבון בירת assay ^19, על פי הוראות היצרן, עם ספקטרופוטומטר להגדיר למדוד ספיגה ב 750 ננומטר.
14. לנרמל את ריכוז החלבון ל -2.5 מ"ג / מ"ל ​​(או אם ריכוזים נמוכים מ -2.5 מ"ג / מ"ל, לנרמל את המדגם עם ריכוז החלבון הנמוכה ביותר) על ידי הוספת PBS pH 8.5 + 0.4% SDS לפי הצורך (למשל, אם הדגימות הן 5 מ"ג / מ"ל ​​ב 250 μl, להוסיף 250 μl של pH PBS 8.5 + 0.4% SDS כדי לקבל ריכוז סופי של 2.5 מ"ג / מ"ל).

3. צירוף תג פלורסנט ידי לכימיה לחץ על ויזואליזציה של חלבונים שכותרתו

1. הסר 40 μl של lysate התא והעברת צינור microcentrifuge חדש. שמור את lysates הנותר עבור תגובה עם ביוטין-תזיד (שלב 4).
2. מוסיפים את ריאגנטים הבאים לפי הסדר: 0.2 μl-אזיד פלואור (פתרון המניות 1 מ"מ DMSO), 0.58 TCEP μl (מלאי 100 מ"מ במים עם 4 ושווי NaOH הוסיף, מוכן טרי), ו 3.38 TBTA μl (1.7 מניות מ"מ בתוך 4: יחס 1 של t-butanol כדי DMSO). וורטקס לערבב.
3. להוסיף 1.14 μl CuSO ₄ -5H ₂ O (50 מ"מ במים) כדי להתחיל את התגובה. וורטקס בקצרה דגירה בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות בחושך.
4. הוסף 50 μl של חיץ מדגם 2x SDS כדי להרוות את התגובה. בנקודה זו, הפעל את דגימות ישירות על ג'ל SDS-PAGE ²⁰ לקבלת התוצאות הטובות ביותר, או בחנות ב -20 מעלות צלזיוס למשך הלילה במידת הצורך.
5. אם הקפאת דגימות, לחמם במשך 5 דקות ב 95 ° C לפני הטעינה על הג'ל.
   הערה: מאז המשקל המולקולרי של חלבון המטרה בדרך כלל אינו ידוע בשלב זה, רצוי לרוץ 2 ג'לים עם ריכוזי acrylamide שונים (כלומר, 8% ו -15%), או מגוון משקל מולקולרי רחב ג'ל שיפוע (כלומר, 4-15%), כדי להבטיח כיסוי משקל מולקולרי מוחלט.
6. כאשר החזית לצבוע הגיעה לסוף של הג'ל, להמשיך להפעיל את ג'ל למשך 5 דקות נוספות כדי להבטיח את כל unreacte העודףפלואוריד-אזיד ד כבר יצא הג'ל לחלוטין.
7. הסר את הג'ל למכל עם DDH ₂ O ו דגירה של 10 דקות עם תסיסה עדינה, כדי לשטוף את כל-יזיד פלואור העודף.
8. מניחים את הג'ל על צלחת זכוכית לסרוק את הג'ל באמצעות סורק ג'ל ניאון טייפון פי הוראות היצרן.

4. צירוף תג ביוטין על ידי כימיה לחץ עבור טיהור זיקה של חלבונים שכותרתו

1. של lysates הנותרים משלב 3.1, השתמש הסכום המקסימלי לאחר נורמליזציה חלבון כזה שכל הדגימות הן באותו נפח (למשל, אם לאחר נורמליזציה 2.5 מ"ג / מ"ל ​​הכרכים מדגם וכתוצאה מכך הם 500, 550, ו -600 μl, השתמש 500 μl של כל אחד).
2. טרום לנקות את lysates על ידי הוספת 50 μl קיבולת גבוהה חרוזים agarose streptavidin, 2x מראש שטף עם PBS (pH 7.4). דגירה שעה 1 ב 4 ° C עם רוטציה.
3. גלולה חרוזים על ידי צנטריפוגה XG ב 1000 במשך 3 דקות. הסר tהוא supernatant לצינור microcentrifuge חדש על קרח וזורק את החרוזים.
4. הסר 1-2% מהמדגם DMSO לצינור חדש שכותרתו "קלט". הוסף נפח שווה של חיץ ולאחסן מדגם 2x SDS ב -20 ° C.
5. לפי 500 μl של lysate, מוסיפים את ריאגנטים הבאים: 1.38 μl-אזיד ביוטין (המניה 10 מ"מ DMSO), 5.5 μl TCEP, ובמרחק של כ -32.5 TBTA μl. וורטקס לערבב.
6. להוסיף 11 μl CuSO ₄ -5H ₂ O לכל 500 μl של lysate ו מערבולת בקצרה. דגירה בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות.
7. הוסף 4 כרכים מדגם של אצטון מקורר ל -20 מעלות צלזיוס. וורטקס דגימות דגירת הלילה ב -80 ° C כדי לזרז את החלבונים לחלוטין ולהסיר ביוטין-יזיד unreacted.
8. צנטריפוגה הדגימות ב 17,000 XG במשך 15 דקות ב 4 ° C עד גלולת החלבונים זרזו.
9. לשאוב supernatant לחלוטין, resolubilize החלבונים על ידי sonication ב 150 μl PBS (pH 7.4) + 1% SDS.
10. הוסף 600 μl של PBS (pH 7.4) כדי לדלל את הריכוז של SDS 0.2%.
11. מוסיפים את דגימות עד 30 μl מראש שטף חרוזים agarose streptavidin בקיבולת גבוהה דגירה שעה 1 ב 4 ° C עם רוטציה.
12. גלולה חרוזים על ידי צנטריפוגה XG ב 1000 במשך 3 דקות. לשאוב supernatant המכיל חלבונים שנזרקו מאוגד.
13. הוסף 1 מ"ל של חיץ לשטוף (400 mM NaCl, 50 מ"מ טריס, 0.2% SDS, pH 7.4) על חרוזים דגירה 5 דקות בטמפרטורת החדר עם סיבוב.
14. חזור על שלבים 4.12 ו 4.13 3 פעמים.
15. לשאוב חיץ לשטוף לחלוטין מן החרוזים, ולהוסיף 30 μl של חיץ מדגם 2x SDS.
16. דגירה במשך 5 דקות על גוש חום 95 ° C כדי לשחרר את החלבונים מן החרוזים.
17. צנטריפוגה חרוזים דקות 1 ב 13,000 XG בטמפרטורת החדר.
    הערה: בשלב זה, הדגימות ניתן לאחסן ב -20 ° C עד מוכן לרוץ SDS-PAGE. אם הקפאת דגימות, לחמם במשך 5 דקות ב 95 מעלות לפני השימוש.
18. בקפידהפיפטה למאגר מדגם המכיל חלבונים הנחה של חרוזים, ולטעון על SDS-PAGE ²⁰ (ראה שיקולים חשובים להלן). החרוזים ניתן לשמור על reboiling מאוחר יותר במידת הצורך.
    הערה: לקבלת זיהוי חלבון על ידי כתם כסף, תוצאות טובות יותר מתקבלות באמצעות ג'ל 1 מ"מ עובי. אם להקה היא שיש להוציא מתוך הג'ל כסף מוכתם עבור ספקטרומטריית מסה (MS) ניתוח, להכין את כל ריאגנטים טריים מפתרונות סטרילית להשאיר ריק היטב בין דגימות על הג'ל. עבור כל להקה לחתוך מהנתיב החללי, פרוסה במקביל יש לנקוט מנתיב DMSO כך חלבוני רקע שיכולים להיגרע. עבור אימות של חלבון מזהה על ידי כתם המערבי, זה קריטי גם לטעון את המדגם קלט משלב 4.4 בעת הפעלת ג'ל SDS-PAGE.
19. עקוב פרוטוקול סטנדרטי או צביעת כסף ²¹ או מערביים כתם ²² לזהות חלבון המטרה (ים).

Results

התוצאות המוצגות כאן התקבלו עם חללית צילום זיקה של itraconazole התרופה נגד הפטריות, השימוש אשר פורסם בעבר ^16. תוצאות אלו מראות את השימוש בטכניקת תיוג לחיות תאי photoaffinity לזהות חלבון מחייב itraconazole גדול בהצלחה כמו חלבון הממברנה 35 kDa מתח-Dependent ערוץ 1 אניון (VDAC1).

בפרוטוקול לעיל בוצע בתאי HEK293T באמצעות החללית itraconazole ע...

Discussion

גישות שונות לזיהוי המטרות של מולקולות קטנות ניתן לקבץ באופן כללי לשתי קטגוריות: מלמעלה למטה, שם פנוטיפ הסלולר של התרופה משמש כדי לצמצם את המטרות הפוטנציאליות שלה המבוסס על הפונקציות הידועות שלהם, או מלמטה למעלה, כאשר היעד מזוהה ישירות באמצעים כימיים או גנטיים ^3. מלמעלה למטה או מחקרים פנוטיפי יכול לזהות תהליכים תאיים מסוימים מושפעים התרופה (למשל, תעתיק / תרגום / סינתזה של DNA, בלוק מחזור התא, מאותת את הפעלת מסלול / עיכוב, וכו ') שעשוי ביסוד פנוטיפ ה...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Tris(2-carboxyethyl)phosphine (TCEP)	Life Technologies	20490	הפוך יום שימוש טרי. הכן מלאי של 100 מ"מ במים עם 4 eq NaOH.
טריס[(1-בנזיל-1H-1,2,3-טריאזול-4-יל)מתיל] אמין (TBTA)	AnaSpec	63360-50	הכן מלאי של 1.7 מ"מ ביחס של 4:1 של t-בוטנול ל-DMSO, אחסן ב-20  °C.
נחושת גופרתית (CuSO4• 5H2O)	LabChem, Inc.	LC13440-1	מכינים מלאי של 50 מ"מ במים, מאחסנים בטמפרטורת החדר.
ביוטין-אזיד	קליק כלים לכימיה	AZ104-100	הכן מלאי של 10 מ"מ ב-DMSO, אחסן ב-20  °C.
אלקסה פלואור 647-אזיד	Life Technologies	A10277	הכן מלאי 1 מ"מ ב-DMSO, אחסן ב-20  °C.
מנורת UV 365 ננומטר	יש להרכיב משקפיים חוסמי UV	Spectroline	FC100
טבליות מעכבי פרוטאז,	11873580001	Roche Life Science	יש להכין תמיסה 50x במים ולאחסן בטמפרטורה של -20  °C.
סוניקטור	ברנסון	סוניפייר 250	מוגדר לתפוקה 1, חובה 30%.
סורק ג'ל פלואורסצנטי	GE Healthcare Life Sciences	FLA 9500	השתמש בלייזר אדום כדי לזהות Alexa-fluor 647.
ערכת בדיקת חלבון DC תואמת חומר ניקוי	Bio-Rad	5000112
חרוזי סטרפטווידין אגרוז בקיבולת גבוהה	Life Technologies	20359
Dulbecco's Modified Eagles Medium, דל גלוקוז	ThermoFisher Scientific	11885092
סרום בקר עוברי, מוסמך	ThermoFisher Scientific	26140079
תמיסת פניצילין/סטרפטומיצין	ThermoFisher Scientific	15140122
SDS מאגר דגימה (2x)	ThermoFisher Scientific	LC2676