הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

מודל פגיע ראש החוזרים מזעזע של עכברים

11.5K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/54530

⸱

12 באוקטובר 2016

 ,  ,  ,  ,  , 
1Program for Neurotrauma, Neuroproteomics & Biomarkers Research, University of Florida, 2Department of Psychiatry, University of Florida, 3Department of Neuroscience, University of Florida

במאמר זה

סיכום

זעזוע מוח מציג את הסוג הנפוץ ביותר של פגיעה מוחית טראומטית. לכן, מודל של בעלי חיים עם זעזוע מוח חוזר, המשכפל את המאפיינים החשובים של פציעה במטופלים, עשוי לספק אמצעי לחקר זעזוע מוח בצורה קפדנית, מבוקרת ויעילה.

תקציר

אף על פי שזעזוע מוח / פגיעה מוחית טראומטית קלה (mTBI) היא התופעה השכיחה ביותר של פגיעה מוחית טראומטית, עדיין יש חוסר ידע על הפגיעה והשפעותיה. כדי לפתח הבנה טובה יותר של זעזועי מוח, משתמשים לעתים קרובות בחיות מכיוון שהן מספקות מודל מבוקר, קפדני ויעיל. מחקרים התאימו מודלים מסורתיים של חיות לביצוע mTBI כדי לעורר חומרת פציעה קלה על ידי שינוי פרמטרי הפציעה. מודלים אלה שימשו מכיוון שהם יכולים לייצר פגיעות מוח דומות מורפולוגית למצב הקליני ולספק ספקטרום של חומרת הפציעה. עם זאת, הם מוגבלים ביכולתם להציג את המאפיינים הזהים של פציעות בחולים. באמצעות מערכת פגיעה מסורתית, מודל פציעת זעזוע מוח חוזרת (rCHI) יכול לגרום לזעזוע מוח קל עד בינוני דמוי אדם. ניתן לקבוע את דרגת הפגיעה על ידי מדידת תקופת אובדן ההכרה (LOC) עם סימן להפסקת נשימה חולפת. מודל rCHI מועיל לשימוש בשל הדיוק והפשטות שלו בקביעת השפעות mTBI וטיפולים פוטנציאליים.

מבוא

זעזוע, המכונית גם פגיעה מוחית טראומטית קלה (mTBI), הוא התופעה המתמשכת ביותר של פגיעה מוחית טראומטית (TBI) ופוגע במיליוני אנשים ב ארצות הברית. זעזוע מוח יכול להיות מסובך לאבחן אין תרופה ספציפית עבור זעזוע מוח. יש הכרה גוברת וראיות כמה שטראומה מכאנית קלה שנגרמה מפציעות ספורט, לחימה צבאית, עיסוקים אחרים ומרתקים פיסיים עלולה להיות השלכות נוירולוגיות מצטברות וכרוני 1,2. עם זאת, יש עדיין חוסר הידע לגבי זעזועי מוח והשפעותיהם. המתודולוגיה הנוכחית מגבילה את המחקרים של פתולוגיה וטיפול בבני אדם מאז הערכה נוירולוגית והערכה הדמיה בלבד זמינים לאבחון קליני. במודלים של בעלי החיים לספק אמצעי ללמוד זעזועי מוח בצורה יעילה, קפדנית, ומבוקר עם בתקווה אבחנה נוספת וטיפול mTBI.

מחקרים מותאמים מסורתית TBIמודלים כגון השפעת קליפת מוח מבוקר (CCI), השפעה נוזלת-כלי קשה (FPI), פגיעת ירידה במשקל, פגיעת פיצוץ לבצע mTBI וממריצים חומרות פגיעה נמוכות על ידי שינוי פרמטרי פציעה. מודלים אלה מועילים לשימוש בשל יכולתם לשכפל טראומה מוחית מורפולוגית דומה המצב הקליני; עם זאת, הם גם יש מגבלות משלהם. חומרת הפציעה המושרה על ידי (ירידה במשקל) פציעה האצה היא לעתים קרובות משתנה מאוד. שתי התוצאות של CCI קלה - דימום תת-עכבישי ו contusion מוקדי - אינם בני השוואה זעזועי מוח אנושי טיפוסי. CCI ו FPI דורשים craniotomy, אשר אינו רלוונטי מבחינה קלינית, תוך פגיעה הפיצוץ הוא מודל היותר שנויים במחלוקת לגבי המדידות עמדה בלחץ שיא חשיפה שונות, כמו גם פגיעה משנית משתנה במהלך החשיפה 3-6. במודל חיה המזעזע מעודכנת כי יכול לתרגם מחקר פרה-קליני לתוך setti הקליניng יש צורך במחקר.

שאלת מפתח דוגמנות TBI הקלה היא להגדיר את חומרת פציעה ניסיון, אשר הצמוד ביותר משכפלת את הפגיעה בסביבה קלינית. לאחרונה, קבוצות מחקר שונות פתחו את פגיעת הראש הסגורה או פגיעת ראש מזעזע 7-10 מודל (CHI). CHI הוא שינוי של CCI ללא פתיחת גולגולת, אבל זה עדיין משתמש במערכת השפעה מגנטית אלקטרונית מסורתית לייצר שפעת ראש. צ'י יכול לגרום זעזוע מוח החל קלה עד מתונה על ידי התאמת הפרמטרים השפעה. אובדן ההכרה (לוק) ניתן להבחין מייד לאחר השפעה ידי איתור ירידת קצב הנשימה או הסיום החולף של נשימה. תקופת LOC משמש כדי לקבוע את חומרת הפציעה. מאמר זה כולל גרסה משופרת ומעודכנת מעט של מודל חוזר צ'י (rCHI) בעכברים, יחד עם פרוטוקול צעד אחר צעד מפורט ותוצאות נציג. א אסטרטגיות מחקר מודל rCHIמחדש מועיל בקביעת ההשפעות mTBI וטיפולים פוטנציאליים, במיוחד מאחר ואין במודל חיה הפרט מסוגל לחקות כל שינויים פתולוגיים הנגרמת זעזוע מוח.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

כל הנהלים בוצעו תחת פרוטוקולים # 201207692 אושרה על ידי ועדת טיפול בבעלי חיים מוסדיים השתמש של אוניברסיטת פלורידה ובהתאם ה- National Institutes of Health מדריך לטיפול ושימוש בחיות מעבדה.

1. טיפול בבעלי חיים

  1. השתמש זכר בן 3-4 חודשים C57BL / 6J. לספק מצעים, חומר קינון, מזון כרצונך מים. שמור על העכברים בטמפרטורות סביבה מבוקרות בטמפרטורה של 20 - 22 מעלות צלזיוס עם אור 12-hr קבוע / מחזורים כהים 12-hr.

2. טרום impaction כן

  1. צרף טיפ מתכת מצופי גומי סיליקון מחוייט מכשיר השפעת stereotaxic אלקטרומגנטית. ודא התחתי השטוחה של הקצה מקביל פני השטח של הקצה החללי (איור 1 א).
  2. להרדים את העכבר עם isoflurane 4% ואחריו הרדמה תחזוקה של isoflurane 2.5%. בדוק את ההרדמה באמצעות מד הזרימה. monitor רמת ההרדמה עד שהחיה מגיעה לרמה של הרדמה כירורגית על ידי הצגת אובדן רפלקס דוושת נסיגה.
  3. שים את העכבר אפרקדן על כרית חימום. השתמש חרטומו בצורת משפך כדי לשמור על העכבר בהרדמה. לגמרי לגלח את הראש באמצעות גוזם. השתמש במשחה וזלין עיניים על העיניים של העכבר כדי למנוע יובש לאחר הרדמה.

הגדרת 3. פרמטרי השפעה

הערה: מערכת ההשפעה כוללת תיבת בקרה כדי להגדיר פרמטרי השפעה, גידול מפעיל כדי לבצע את הנעיצה ואת מסגרת דיגיטלית stereotactic עם 3-תנועת גרזנים.

  1. טרום להגדיר את המהירות של מכשיר ההשפעה עד 4 מ '/ שני וישב זמן 240 msec על תיבת הבקרה.

4. למקם את מרכז ההשפעה

  1. שים כרית חימום רכה מתחת לגוף של החיה כדי לשמור על טמפרטורת הגוף ליד 39 מעלות צלזיוס. הר העכבר בתוך מסגרת stereotactic בתוך pronעמדת דואר עם סורגי אוזן הבוטה לקצה.
  2. מנמיכים את קצה השפעה קרוב לראש של העכבר על ידי הזזת נהג Z. התאם את קצה השפעה שטוח (9 מ"מ קוטר) על ידי הזזת ה- X ו- Y-נהגים באמצע הדרך אל היעד קואורדינטות מעל תפר sagittal.
  3. ודא קצה אחד של קצה ההשפעה אנכית מקבילים לקו אופקי דמיוני הנמשך בין שתי האוזניים (תרשים 1C). מרכז ההשפעה תואם את באמצע דרך תפר sagittal המרכזי בין תפרי interfrontal ו lambdoid (interaural 9 מ"מ עד interaural 0 מ"מ, לרוחב 4.5 מ"מ).

5. הגדרת עומק השפעה

  1. כדי להגדיר את עומק ההשפעה כהלכה, השתמש קצה חללית נוסף כדי להחליף את הסיליקון המבודד מצופי גומי טיפ השפעה.
  2. כדי לוודא שאין שינוי של מרכז ההשפעה לאחר טיפי מיתוג, להגדיר את X ו- Y ערוץ בלוח הבקרה הדיגיטלי stereotaxic לאפס לפני מעבר העצות.
  3. הזז את probטיפ דואר למרכז של אזור ההשפעה ידי הזזת X-Y-הכוננים ידניים.
  4. חיישן מגע קליפ הזנב של העכבר.
  5. הזז את impactor (כונן Z) כלפי מטה עד הקצה החללי נוגע פני השטח של אתר ההשפעה.
  6. הגדר את ערוץ Z בלוח הבקרה stereotaxic לאפס.
  7. להזיז את קצה ההשפעה חזרה לאזור ההשפעה על ידי התאמת X- ידני ו- Y-נהגים (לא אפס כפתורים בלוח הבקרה stereotaxic דיגיטלי) עד X ו- Y-הנהגים הם אפס (בהתאם קצה השפעה הוצב בעבר).
  8. לחזור בו מפעיל על ידי העברת המתג לחזור על תיבת הבקרה. באופן ידני להעביר את impactor למטה (נהג Z) על ידי 4 מ"מ.

השפעת 6.

  1. לעורר את ההשפעה על ידי לחיצה על מתג ההשפעה על הקופסה המלאה להשיג עומק עיוות של 4 מ"מ.

7. לאחר impaction

  1. מדדו את הזמן מן ההשפעה עד נשימתו הראשונה של העכבר באמצעות טיימר.
  2. הסר את החיה מן המכשיר ומניח אותם על משטח חם כדי לשמור על טמפרטורת הגוף שלהם. אין להשאיר את החיה ללא השגחה עד שהוא שב להכרתו מספיק כדי לשמור שכיבה sternal.
  3. לאפשר התאוששות לפני חזרת החיה חזרה לכלוב נקי. אל תחזור חיה לחברה של בעלי חיים אחרים עד התאושש לחלוטין.
  4. הקפד לשקול את העכברים מדי יום. אם העכברים להראות סימנים של כאב, intraperitoneally להזריק בהם Meloxicam ל 1 - 2 מ"ג / ק"ג כל 12 - 24 שעות.

8. Impaction חוזרים

  1. תן העכברים לפגיעות נוספות ב -4 ימים, 7, ​​ו -10 לאחר הפציעה הראשונית (72 מרווח hr בין השפעות).

9. אימונוהיסטוכימיה (IHC)

  1. זלוף Transcardial
    1. להרדים את העכברים בזריקה intraperitoneal עם 200 מ '/ pentobarbital ק"ג.
    2. להעריך ולהבטיח הרדמה כירורגית-המטוס על ידי קמצוץ הבוהן. secיור העכבר במצב שכיבה על ידי הקשה על הרגליים הקדמיות בעדינות כפותיו האחוריות למשטח עבודה קלקר בתוך במנדף כימי.
    3. עושים חתך דרך העור לאורך קו האמצע החזי מהנקודה שמתחת לתהליך xiphoid אל עצם הבריח. לעשות שני חתכים בעור נוספים על תהליך xiphoid והמשך לאורך הבסיס של בית חזה הגחון רוחבי.
    4. פתח את חלל בית החזה ולחשוף את הלב על ידי חיתוך דרך השרירים ואת בית החזה החזה.
    5. אבטח את הלב הפועם עם מלקחיים בוטים ולעשות 1 - חתך מ"מ 2 של החדר השמאלי.
    6. מיד להכניס מחט פרפר לתוך העלייה הימנית. בגין העירוי של תמיסת מלח 20ml ידי דחיפת המזרק באיטיות.
    7. עבור מהמצב מלוח paraformaldehyde 4%. המשך זלוף עם 20ml של paraformaldehyde.
    8. לערוף את העכבר להסיר את העור עם מספריים. לבודד את המוח מהגולגולת באמצעות חותך עצם.
  2. Cryostat חתך
    1. רקמות המוח שבץ חיתוך הטמפרטורה האופטימלית (OCT) ניסוח ולהקפיא ב -80 ° C. מניחים את המוח ב cryostat בכיוון sagittal. חותכים חלקים במוח 5 מיקרומטר עבה.
  3. הַכתָמָה
    1. ייבש את החלקים הקפואים בטמפרטורת חדר למשך שעה 1.
    2. דגירה השקופיות עם 100 μl של בסרום 2% עיזים 0.1% Triton X-100 ב בופר פוספט (PBS) במשך שעה 1 ב RT.
    3. שטפו את השקופיות 3 פעמים עם 300 μl של PBS. ואז דגירה שקופיות עם אנטי GFAP (1: 200) או נוגדנים נגד פריטין (1: 200) בנפרד במשך הלילה על 4 מעלות צלזיוס.
    4. שטפו את השקופיות 3 פעמים עם 300 μl של PBS. ואז דגירה את השקופיות עבור 2 שעות בטמפרטורת החדר עם נוגדנים משני מצומדות ביוטין.
    5. שטפו את השקופיות 3 פעמים עם 300 μl של PBS. ואז דגירה שקופיות עם מורכבות ביוטין avidin (ABC) פתרון (1:50) בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות.
    6. שטפו את השקופיות 3 פעמים עם 300 μl של PBS. ואז דגירה 3,3'-diaminobenzidine (DAB) פתרון המצע (50 מ"ל PBS, 10 μl H 2 O 2, 10 מ"ג גלולת DAB, מסנן לפני השימוש) עבור 5 - 8 דקות. שים את השקופיות תחת מיקרוסקופ עד להופיע התא החיובי.
    7. יש לשטוף את השקופיות במי ברז איטי בריצה במשך 5 דקות. מגלשות נקיות עם מעבדת לנגב. ואז להרכיב את החלקים עם בינוניים coverslip גובר.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

במודל זה (איור 1 AC), היו תקופות קצרות של האנחות האלה נשימות רדודות. איבוד הכרה (שלא מדעת) מוגדר כירידה את קצב הנשימה או ההפסקה חולפת של נשימה לפני בשיבת נשימה נורמלית. השפעה על מרכז הראש שנגרם חוסר הכרה לזמן קצר (7.5 ± 4.7, 7.8 ± 5.5, 10.2 ± 8.8, 9.5 ± 8.0 שניות בכל השפעה בנפרד, 1D איור). המוח עכבר הראה מורפולוגיה נורמלית על ידי מכתים היסטולוגית H & E, אשר לא הצביעו על נזק נגעים או רקמות מבניים ברור הנובע

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

כדי לחקות פגיעות מוח מורפולוגית דומה המצב הקליני, הסימפטומים הפוסט-זעזוע מוח צפויים. סימפטומים פוסט-זעזוע המוח בדרך כלל כוללים כאבי ראש, סחרחורות, סחרחורת, עייפות, בעיות זיכרון ושינה, קושי להתרכז, כמו גם חרדה, מצב רוח דכאוני. מאז סימפטומים גופניים לא יכול עדיין להיות מדיד במודלים של בעלי חיים, השינויים של מנוע ותפקוד קוגניטיבי וטיפול התנהגותי רגשי משמשים קריטריונים להערכת זעזוע מוח רציונלי במודלים של בעלי חיים. במחקר דיווח קודם, זה היה מראה כי במודל עכבר rCHI גורם גירעונות למידה מ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

למחברים אין אינטרס כלכלי לחשוף.

תודות

עבודה זו נתמכה על ידי מימון ממענק בריאות פלורידה (קרן מחקר לפגיעות מוח וחוט שדרה) (KKW).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
מכונת הרדמהEagle Eye Anesthesia, Incדגם 150 הרדמה
אימפקטור אלקטרומגנטיLeica BiosystemsImpact One Stereotaxic Impactorלבצע אימפקט
מכשיר סטריאוטקסי דיגיטליLeica Biosystems39462501הרכבה של עכבר וקצות מיקום
קצה מתכת מצופה גומי Sicilone PrecisionTool & הנדסה, Gainesvill FLקצה אימפקטבהתאמה אישית
גוזם ליתיום יון All-in-One WAHLמוצרים ביתיים9854-600מהדקי נייר שיער עכבר גילוח
קצה בדיקה בהתאמהאישית
אפליקטורים עם קצה כותנהMEDLINEראשקרצוף MDS202055 עם
רקמות מלח Tek O.C.T.ASKURA FINETEK USA INC4583הטמעת רקמות
אנטי-GFAPDakoCA93013נוגדן עבור IHC
אנטי פריטיןSigmaF6136נוגדן עבור IHC
VECTASTAIN Elite ABC  ערכתמעבדות וקטורPK-6100IHC מערכת זיהוי
Permount הרכבה בינוניתפישר מדעיSP15-100
Aperio XT סורק ScanScopeLeica Microsystems Inc,שקופיותסריקת
Leica AutoStainer XLLeica חברת הפתולוגיהST2010H& מכתים
E DAB מערכת זיהוי סיגמאD3939IHC

מקורות

  1. Baugh, C. M., et al. Chronic traumatic encephalopathy: neurodegeneration following repetitive concussive and subconcussive brain trauma. Brain Imaging Behav. 6 (2), 244-254 (2012).
  2. McKee, A. C., et al. Chronic traumatic encephalopathy in athletes: progressive tauopathy after repetitive head injury. J. Neuropathol Exp Neurol. 68 (7), 709-735 (2009).
  3. Petraglia, A. L., Dashnaw, M. L., Turner, R. C., Bailes, J. E. Models of mild traumatic brain injury: translation of physiological and anatomic injury. Neurosurgery. 75 Suppl (4), S34-S49 (2014).
  4. Goldstein, L. E., McKee, A. C., Stanton, P. K. Considerations for animal models of blast-related traumatic brain injury and chronic traumatic encephalopathy. Alzheimers Res Ther. 6 (5), 64(2014).
  5. Gold, E. M., et al. Functional assessment of long-term deficits in rodent models of traumatic brain injury. RegenMed. 8 (4), 483-516 (2013).
  6. Xiong, Y., Mahmood, A., Chopp, M. Animal models of traumatic brain injury. Nat Rev Neurosci. 14 (2), 128-142 (2013).
  7. Luo, J., et al. Long-term cognitive impairments and pathological alterations in a mouse model of repetitive mild traumatic brain injury. Front Neurol. , 5-12 (2014).
  8. Yang, Z., et al. Temporal MRI characterization, neurobiochemical and neurobehavioral changes in a mouse repetitive concussive head injury model. Sci Rep. 10 (5), 11178(2015).
  9. Zhang, J., et al. Inhibition of monoacylglycerol lipase prevents chronic traumatic encephalopathy-like neuropathology in a mouse model of repetitive mild closed head injury. J Cereb Blood Flow Metab. 35 (3), 443-453 (2015).
  10. Petraglia, A. L., et al. The spectrum of neurobehavioral sequelae after repetitive mild traumatic brain injury: a novel mouse model of chronic traumatic encephalopathy. J Neurotrauma. 31 (13), 1211-1224 (2014).
  11. Lumpkins, K. M., Bochicchio, G. V., Keledjian, K., Simard, J. M., McCunn, M., Scalea, T. Glial fibrillary acidic protein is highly correlated with brain injury. J Trauma. 65 (4), 778-782 (2008).
  12. Yang, Z., Wang, K. K. Glial fibrillary acidic protein: from intermediate filament assembly and gliosis to neurobiomarker. Trends Neurosci. 38 (6), 364-374 (2015).
  13. Liu, H., et al. Increased expression of ferritin in cerebral cortex after human traumatic brain injury. Neurol Sci. 34 (7), 1173-1180 (2013).
  14. Jordan, B. D., et al. The clinical spectrum of sport-related traumatic brain injury. Nat Rev Neurol. 9 (4), 222-230 (2013).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

מודל פגיע ראש החוזרים מזעזע של עכברים
צור קשר
המלצה לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

2026 © זכויות יוצרים MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.